CC BY
13© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016
М.В.Сычева1,4, А.С.Васильченко1,3, Е.А.Рогожин2, Т.М.Пашкова1, Л.П.Попова1, О.Л.Карташова1
БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ АНТИМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ ИЗ ТРОМБОЦИТОВ КУР
1Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза, Оренбург; 2Институт биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова, Москва; 3Оренбургский государственный университет; 4Оренбургский государственный аграрный университет
Цель. Выделение и изучение биологической активности антимикробных пептидов из тромбоцитов кур. Материалы и методы. В исследовании использовали пептиды из тромбоцитов кур, полученные методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии в ступенчатом и линейном градиентах увеличения концентрации органического растворителя. Их антимикробную активность определяли методом микротитрования в бульоне; механизм биологического действия — с помощью метода флуоресцентной спектроскопии с использованием ДНК-тропных красителей. Результаты. Из тромбоцитов кур выделены индивидуальные фракции пептидов, обладающие антимикробной активностью в отношении Staphylococcus aureus P209 и Escherichia coli K12. Установлено нарушение целостности барьерных структур микроорганизмов под воздействием тромбо-цитарных антимикробных пептидов и преобладание клеток с поврежденной мембраной в популяции E.coli. Заключение. Полученные данные об антимикробной активности и механизме бактерицидного действия впервые выделенных фракций пептидов из тромбоцитов кур расширяют представление о функциональных свойствах тромбоцитов птиц и открывают перспективу для их дальнейшего изучения с целью использования в качестве антимикробного средства.
Журн. микробиол., 2016, № 2, С. 24—29
Ключевые слова: антимикробные пептиды, тромбоциты, тромбоцитарный катионный белок, флуоресцентная спектроскопия, Staphylococcus aureus Р209, Escherichia coli К12
M.V.Sycheva1,4, A.S.Vasilchenko1,3, E.A.Rogozhin2, T.M.Pashkova1, L.P.Popova1, O.L.Kartashova1
BIOLOGICAL ACTIVITY OF ANTIMICROBIAL PEPTIDES FROM CHICKENS THROMBOCYTES
1Research Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis, Orenburg; 2Shemyakin and Ovchinnikov Research Institute of Bioorganic Chemistry, Moscow; 3Orenburg State University; 4Orenburg State Agrarian University, Russia
Aim. Isolation and study ofbiological activity of antimicrobial peptides from chickens thrombocytes. Materials and methods. Peptides from chickens thrombocytes, obtained by reverse-phase high-performance liquid chromatography method with stepped and linear gradients of concentration increase of the organic solvent were used in the study. Their antimicrobial activity was determined by microtitration method in broth; mechanism of biological effect — by using fluorescent spectroscopy method with DNA-tropic dyes. Results. Individual fractions of peptides were isolated from chickens thrombocytes, that possess antimicrobial activity against Staphylococcus aureus P209 and Escherichia coli K12. A disruption of integrity of barrier structures of microorganisms under the effect of thrombocyte antimicrobial peptides and predominance of cells with damaged membrane in the population of E. coli was established. Conclusion. The data obtained on antimicrobial activity and mechanism of bactericidal effect of the peptide fractions from chickens thrombocytes isolated for the first time expand the understanding of functional properties of chickens thrombocytes and open a perspective for their further study with the aim of use as antimicrobial means.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2016, No. 2, P. 24—29
Key words: antimicrobial peptides, thrombocytes, thrombocyte cationic protein, fluorescent spectroscopy, Staphylococcus aureus Р209, Escherichia coli К12
ВВЕДЕНИЕ
С момента начала эпохи антибиотиков [6] и до настоящего времени одной из первостепенных проблем в терапии инфекционных болезней является появление новых форм микроорганизмов, устойчивых к конвенциальным антибиотикам [1, 3]. В этой связи возникает необходимость поиска новых антимикробных веществ и разработки на их основе препаратов, эффективных в отношении резистентных патогенов. Многие исследования [7, 13] позволяют выделить среди различных природных соединений группу веществ пептидной природы с выраженными антимикробными свойствами. Антимикробные пептиды (АМП) представляют собой низкомолекулярные (менее 10 кДа) преимущественно положительно заряженные (как правило, от +2 до +9) молекулы, синтезируемые широким кругом организмов: от прокариот до высших позвоночных животных [4]. Являясь фактором системы врожденного иммунитета макроорганизма, АМП реализуют свою биологическую функцию, обеспечивая неспецифическую защиту от микробной инвазии. Так, катионные антимикробные пептиды, выделенные из нейтрофилов и тканей эпителиального происхождения (дефензины, протегрины, кателициди-ны и т. д.), обладают широким спектром действия, оказывая антибактериальное, антивирусное, антипротозойное и антигрибковое действия [9]. Также установлено, что АМП стимулируют продукцию цитокинов, миграцию и пролиферацию клеток [15], модулируют гуморальный иммунный ответ и повышают титр антител после вакцинации [18].
Исследования, посвященные выделению и характеристике АМП животного происхождения, выявили, что клетки крови, в частности тромбоциты, являются источником различных катионных пептидов, обладающих выраженной биологической активностью [17]. Однако основной имеющийся пул данных по этому вопросу посвящен описанию структуры и функции тромбоцитарных антимикробных пептидов (ТАМП) человека [5, 11, 16], в то время как исследования структурно-функциональных свойств ТАМП животных единичны [8].
В этой связи выделение и исследование структурно-функциональных свойств ТАМП сельскохозяйственных животных является актуальным как с точки зрения фундаментальных знаний о межвидовых особенностях биосинтеза тромбоцитар-ных АМП, так и с точки зрения использования тромбоцитов и кровяных пластинок продуктивных животных в качестве источника антимикробных веществ для создания новых противоинфекционных препаратов.
Цель работы — выделение и изучение биологической активности антимикробных пептидов из тромбоцитов кур.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Тромбоциты получали из цитратной крови клинически здоровых кур-несушек. Обогащенную тромбоцитами плазму отделяли центрифугированием при 250 g в течение 30 минут. Супернатант снова центрифугировали при 1000 g 30 минут. Осажденные тромбоциты отмывали трижды средой 199 (с добавлением 3,8% цитрата натрия в соотношении 1:10). Тромбоцитарную массу ресуспендировали в уксусной кислоте в соотношении 1:10 и выдерживали при -15°С в течение 24 часов. После дефростации полученный экстракт центрифугировали при 1000 g в течение 40 минут. Полученный супернатант использовали для дальнейшего выделения соединений, обладающих антимикробной активностью, методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ) в ступенчатом и линейном градиентах увеличения концентрации органического растворителя (ацетонитрил).
На первой стадии была проведена пробоподготовка, включающая в себя высаливание из раствора тотальной белково-пептидной фракции охлажденным ацетоном в соотношении 1:7 (объем/объем) в течение 12 часов при 4°С. На следующий день после центрифугирования (6000 g, 5 мин, 4°С) осадок высушивали на воздухе при периодическом измельчении. Затем полученный ацетоновый осадок перерастворяли в 0,1% трифторуксусной кислоте (ТФУ) и обессоливали методом ОФ-ВЭЖХ на колонке-картридже Aquapore C8 (Applied Biosystems, СШЛ), уравновешенную в том же растворителе. После выхода с колонки всех несвязав-шихся компонентов элюирование сорбировавшейся фракции осуществляли ступенчатым градиентом (75%) концентрации 80% ацетонитрила в 0,1% ТФУ. Детектирование поглощения вели при длине волны 214 нм. В дальнейшем после упаривания органического растворителя на вакуумной центрифуге (Labconco, СШЛ) обессоленный экстракт разделяли методом аналитической ОФ-ВЭЖХ в линейном градиенте увеличения концентрации 80% ацетонитрила в 0,1% ТФУ на колонке Luna C18 4,6x250 мм (Phenomenex, CШA) с детектированием поглощения при длине волны 214 нм. Собранные фракции лиофилизовали с целью удаления органического растворителя и остаточного количества ТФУ.
Mолекулярные массы пептидов измеряли на MALDI времяпролетном масс-спектрофотометре Ultraflex (Bruker Daltonics, Германия), оснащенном УФ-лазером с длиной волны 337 нм в линейном режиме. В качестве матрицы использовали 2,5-дигидроксибензойную кислоту. На мишени смешивали равные объемы (по 0,7 мкл) образцов и матрицы (15 мг матрицы/мл в 80% CH3CN, 0,1% ТФУ в воде MQ). Для анализа смесь наносили автоматическим дозатором капельным методом на стальную пластинку-мишень и высушивали на воздухе. Mасс-спектры анализировали с помощью программы Bruker DataAnalysis for TOF. Ошибка измерения составляла 0,015%.
Aнтимикробную активность полученных пептидов определяли методом микротитрования в бульоне [14] по отношению к тест-культурам Staphylococcus aureus Р209 и Escherichia coli Kl2 с последующим их высевом после соинкубирования в течение двух часов на плотную питательную среду (агар Mюллера-Хинтона). За минимальную бактерицидную концентрацию ^БК) принимали концентрацию пептидов, вызывающую гибель тест-культур.
Для флуоресцентной окраски бактериальных клеток после соинкубирования с антимикробными пептидами из тромбоцитов кур в MБK в течение 1 ч использовали коммерческий набор LIVE/DEAD® BacLight™ Bacterial Viability Kit (Molecular Probes, CШA). Согласно рекомендациям производителя бактериальные клетки осаждали при 5000 g в течение 5 мин; полученный осадок ресуспендиро-вали в 1 мл дистиллированной воды, после чего доводили оптическую плотность S. aureus Р209 до 0,1 (OD670) и E. coli K12 до 0,05 (OD670).
Измерение спектров флуоресцентной эмиссии (возбуждение 470 нм, эмиссия 490 — 700 нм) осуществляли на спектрометре Солар CM 2203 (Республика Беларусь).
РЕЗУЛЬТАТЫ
В результате фракционирования уксуснокислого экстракта тромбоцитов кур в гомогенном виде было получено 13 фракций с наиболее высоким поглощением при длине волны 214 нм, которые были протестированы на наличие антимикробной активности в системе in vitro. При этом у 8 пептидных фракций с массами в диапазоне от 3,0 до 5,2 кДа зафиксирована выраженная антимикробная активность в отношении S. aureus Р209 и E. coli K12, их минимальные бактерицидные концентрации составляли от 20 до 200 мкг/мл. Фракции №№ 4, 5 и 6 антимикробной активностью не обладали.
В сравнительном аспекте наиболее выраженным антимикробным действием
в отношении S. aureus Р209 обладали 9, 10 и 13 фракции: двухчасовая инкубация указанных соединений с тест-культурой задерживала рост 99,5; 97,3 и 99% колоний, соответственно. Наиболее активными в отношении E. coli К12 оказались пептидные соединения 1 и 10 фракций, снижающие число жизнеспособных клеток в среднем на 95,5% по сравнению с контролем.
Для проведения исследований по изучению механизма биологической активности ТАМП кур в препаративном количестве был получен тотальный обессоленный пептидный экстракт, характеризующий синергидное антимикробное действие тромбоцитарных кати-онных пептидов, и оценены эффекты его воздействия на S. aureus Р209 и E. coli К12.
Полученные результаты показали, что препарат ТАМП обладает выраженным антимикробным эффектом в отношении тест-культур: через два часа соинкубирования антимикробные пептиды подавляли рост изучаемых бактерий в среднем на 97%.
При этом после соинкубирования ТАМП с S. aureus Р209 число выросших колоний составило 1800 против 3,7x104 КОЕ/мл в контроле, с E. coli К12 — 7400 КОЕ/мл против 1,2x106 КОЕ/мл в контроле.
На следующем этапе работы с помощью метода флуоресцентной спек-
Рис. 1. Спектры флуоресценции бактериальной популяции E. coli К12.
Здесь и на рис. 2: 1 — контроль; 2 — опыт; по оси ординат — интенсивность флуоресценции (отн. ед.), по оси абсцисс — длина волны эмиссии флуоресценции (нм).
Рис. 2. Спектры флуоресценции бактериальной популяции S. aureus Р209.
троскопии был изучен механизм бактерицидного действия ТАМП кур в отношении S. aureus Р209 и E. coli К12.
Использование коммерческого набора для витальной окраски позволило детектировать увеличение проницаемости клеточных мембран микроорганизмов в условиях эксперимента. Внесение в реакционную смесь препарата ТАМП вело к нарушению проницаемости клеточных структур и утрате жизнеспособности значительной части клеточной популяции E. coli К12, о чем свидетельствовало существенное увеличение интенсивности флуоресценции в красной области спектра с максимумом при 630 нм, соответствующим эмиссии красителя пропидия иодида, проникающего только через поврежденные клеточные барьерные структуры (рис. 1). В то же время, взаимодействие антимикробных пептидов с S. aureus Р209 приводило к утрате жизнеспособности лишь некоторой части популяции стафилококка, что фиксировалось как незначительное увеличение интенсивности флуоресценции в красной области спектра (рис. 2).
Таким образом, из тромбоцитов кур выделены индивидуальные фракции пептидов, обладающие антимикробной активностью в отношении S. aureus Р209 и E. coli К12. Изучение особенностей биологического действия ТАМП зафиксировало нарушение целостности барьерных клеточных структур микроорганизмов,
при этом доля бактериальных клеток с поврежденной мембраной преобладала в популяции E. coli К12.
ОБСУЖДЕНИЕ
Ранее с помощью метода атомно-силовой микроскопии было охарактеризовано биологическое действие кислотных экстрактов из тромбоцитов и кровяных пластинок разных видов сельскохозяйственных животных [12]. При этом было зафиксировано нарушение морфологии грамположительных и грамотрицательных бактериальных клеток при воздействии уксуснокислых экстрактов из тромбоцитов кур. Характер выявленных повреждений позволил предположить наличие в тромбоцитах соединений полипептидной природы, обладающих выраженной антимикробной активностью.
Продолжение работы в этом направлении было связано с очисткой уксуснокислого белково-пептидного экстракта от различных примесей методами жидкостной хроматографии высокого давления. В процессе разделения был получен ряд индивидуальных фракций, восемь из которых продемонстрировали антимикробную активность в отношении использованных тест-культур.
Полученные данные об антимикробных свойствах тромбоцитарных пептидов кур согласуются с исследованиями ряда авторов, указывающих на широкий спектр антимикробного действия катионных пептидов из кровяных пластинок человека и животных [2, 10], и в то же время, являются новыми, впервые описывающими функциональные свойства тромбоцитов птиц.
Изучение особенностей бактерицидного действия тромбоцитарных пептидов кур с помощью метода флуоресцентной спектроскопии позволило, с одной стороны, определить жизнеспособность бактерий при опытном воздействии, с другой — при наличии мембраноповреждающего действия ТАМП зафиксировать это экспериментально.
Основываясь на полученных результатах, можно предположить, что механизм бактерицидного действия реализуется следующим образом: после первичного контакта ТАМП с клеточной стенкой S. aureus Р209 молекулы пептидов переносятся к их цитоплазматической мембране, а в случае E. coli К12 — интегрируются сначала в липополисахаридный слой наружной мембраны, а затем переносятся к внутренней. Результатом подобной интеграции и переноса является нарушение целостности барьерных структур микробных клеток, что и было продемонстрировано посредством флуоресцентной спектроскопии, зафиксировавшей увеличение проницаемости клеточной стенки микроорганизмов. Последнее предположение находит подтверждение в работе Zhu X.et al. [19], которые с помощью флуоресцентной спектроскопии, проточной цитометрии, сканирующей и просвечивающей электронной микроскопии доказали способность антимикробных пептидов увеличивать проницаемость и нарушать структурную целостность наружной и цитоплазматической мембран бактериальных клеток.
Полученные данные расширяют представление о биологических механизмах антимикробного действия веществ пептидной природы из тромбоцитов кур и являются частью работы по разработке нового перспективного класса антимикробных полифункциональных препаратов, которые могут быть в будущем использованы в медицине и ветеринарии для терапии инфекционно-воспалительных заболеваний.
Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант № 14-04-97067рповолжьеа). ЛИТЕРАТУРА
1. Резистентность к противомикробным препаратам: повторение «трагедии общего достояния». Бюллетень ВОЗ. 2010, 88 (11): 805-806.
2. Aktan I., Dunkel B., Cunningham F.M. Equine platelets inhibit E. coli growth and can be
activated by bacterial lipopolysaccharide and lipoteichoic acid although superoxide anion production does not occur and platelet activation is not associated with enhanced production by neutrophils. Veterinary Immunol. Immunopathol. 2013, 152 (3-4): 209-217.
3. Aziz A.-M. The role of healthcare strategies in controlling antibiotic resistance. British J. Nursing. 2013, 22 (18): 1066-1074.
4. Brodgen K.F. Antimicrobial peptides: pore formers or metabolic inhibitors in bacteria? Nat. Rev. Microbiol. 2005, 3 (3): 238-250.
5. Dankert J., Krijgsveld J., Van der Werff J. et al. Platelet microbicidal activity is an important defense factor against viridans Streptococcal endocarditis. J. Infect. Dis. 2001, 184: 597-605.
6. Fleming A. On the antibacterial action of cultures of a penicillium, with special reference to their use in the isolation of B. Influenzae. Br. J. Exp. Pathol. 1929, 10: 226—236.
7. Forde E., Devocelle M. Pro-moieties of antimicrobial peptide prodrugs. Molecules. 2015, 20 (1): 1210-1227.
8. Ivanov I.B., Gritsenko V.A. Comparative activities of cattle and swine platelet microbicidal proteins. Probiotics Antimicrob. Proteins. 2009, 1 (2): 148-151.
9. Jenssen H., Hamill P., Hancock R.E.W. Peptide antimicrobial agents. Clin. Microbiol. Rev. 2006, 19 (3): 491-511.
10. Mohan K.V.K., Rao S.S., Gao Y. et al. Enhanced antimicrobial activity of peptide-cocktails against common bacterial contaminants of ex vivo stored platelets. Clin. Microbiol. Infect. 2014, 20 (1): 39-46.
11. Tang Y.-Q., Yeaman M.R., Selsted M.E. Antimicrobial peptides from human platelets. Infect. Immunity. 2002, 70 (12): 6524-6533.
12. Vasilchenko A., Dymova V., Kartashova O. et al. Morphofunctional reaction of bacteria treated with antimicrobial peptides derived from farm animal platelets. Probiotics Antimicrob. Proteins. 2015, 7 (1): 60-65.
13. Wang G. Human antimicrobial peptides and proteins. Pharmaceuticals. 2014, 7 (5): 545594.
14. Wiegand I., Hilpert K., Hancock R.E.W. Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nature protocols. 2008, 3 (2): 163-175.
15. Yamasaki K., Gallo R.L. Antimicrobial peptides in human skin disease. Eur. J. Dermatol. 2008, 18 (1): 11-21.
16. Yeaman M.R. Platelets: At the nexus of antimicrobial defence. Nature Rev. Microbiol. 2014, 12 (6): 426-437.
17. Yount N.Y, Gank K.D., Xiong YQ. et al. Platelet microbicidal protein 1: Structural themes of a multifunctional antimicrobial peptide. Antimicrob. Agents Chemother. 2004, 48 (11): 4395-4404.
18. Yurong Y., Yibao J., Ruiping S. et al. Effects of chicken intestinal antimicrobial peptides on humoral immunity of chickens and antibody titres after vaccination with infectious bursal disease virus vaccine in chicken. Archives Animal Nutrition. 2006, 60 (5): 427-435.
19. Zhu X., Dong N., Wang Z. et al. Design of imperfectly amphipathic a-helical antimicrobial peptides with enhanced cell selectivity. Acta Biomaterialia. 2014, 10 (1): 244-257.
Поступила 10.05.15
Контактная информация: Сычева Мария Викторовна, к.б.н.,
460014, Оренбург, ул. Челюскинцев, 18, р.т. (3532)68-97-13
