Биоконверсия кератина пера под действием различных ферментных препаратов Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

578:637.63

і в 1S го-)а-м-зм ей

їха

.IX

:о-

ів-

по

но

le-

an,

ing

Р.

БИОКОНВЕРСИЯ КЕРАТИНА- ПЕРА ПОД ДЕЙСТВИЕМ РАЗЛИЧНЫХ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ

Л.В. АНТИПОВА, Ч.Ю. ШАМХАНОВ

Воронежская государственная технологическая академия

На выбор протеолитических

фе

лиза белков влияют такие факторы, как оптимум pH, термостабильность, присутствие активаторов и ингибиторов [1]. Самое большое значение в выборе протеаз имеет специфичность фермента.

В мясной промышленности наибольшая перспектива - у микробных ферментных препаратов с характерной специфической активностью в отношении фибриллярных белков упроченной структуры, например кератинов.

Благодаря своему химическому составу промышленные кератинсодержащие отходы при переработке скота и птицы, в том числе и перопуховые, являются важным сырьевым источником в получении белковых продуктов различного назначения [2, 3].

Переработка кератинсодержащего сырья для получения кормовой продукции осуществляется путем гидротермического, химического или ферментативного гидролиза. Ферментативный гидролиз, по мнению специалистов, обладает рядом преимуществ, прежде всего связанных с получением обессоленных гидролизатов и с мягкими режимами обработки, максимально сохраняющими набор аминокислот нативных кератинов. В связи с этим биоконверсия кератина приобретает важное значение в создании различных белковых добавок и гидролизатов не только кормового, но и пищевого назначения.

Цель работы - сравнительное изучение влияния различных ферментных препаратов на гидролиз обработанного кератина пера и исследование аминокислотного состава полученного гидролизата.

В качестве объекта исследования использовали перопуховое сырье от переработки кур породы Русская белая. Его промывали водой, обезжиривали хлороформом и после высушивания при температуре 50°С нарезали до частиц необходимой величины (10 мм).

Для ферментативной обработки применяли препарат протеаз из акгиномицета 8(гер(отусе$/гасИохр1гаИх ВКМ А-157. Комплексный препарат ферментов получали осаждением из культуральной жидкости этанолом (при pH 7,5) в концентрации 72% в растворе и определяли протеолитичсскую активность (ПС) и белок по Лоури [4]. Полученный препарат имел удельную активность 32,7 ед. • 10"3 на 1 мг белка. Проведенными ранее исследованиями [51 свойств препарата протеаз установлено, что в его ферментном комплексе, состоящем из дву х белковых фракций, протеолигическая активность обнаружена только во второй, в которой восемь белковых зон. Ориентировочная моле^'лярная масса про-

теаз равна 7000-10000 Да. Препарат наиболее стабилен при pH 6-9 и температуре 40-45°С.

Ферментные препараты элегантин Г 1 Ох и пигмауе-син Г 10х были получены на кафедре микробиологии и биохимии ВГТА путем выделения из культуральных жидкостей грибов Thamnidhim elegans и Rhizopus pygmaues р ¡_ g. Для сравнения использовали ферментные препараты различной специфичности действия, выпускаемые отечественной микробиологической промышленностью (протолихининПОх. амилооризин ГЮх, протосубтилин ГЮх, пекгофоетидин ПОх), и животного происхояздения - трипсин.

Перо с содержанием кератина 76,2 мас.% и воду смешивали при гидромодуле 1: 20, мочевину - в конечной концентрации 0,03 М. Предварительную обработку проводили в течение 4 ч (давление 0,15 МПа). Дозировка вносимых препаратов - 6 ед./г белка. Гидролиз осуществляли в течение 6 ч при непрерывном перемешивании на лабораторной качалке при 180 об/мин.

Периодически отбирали пробы гидролизата и определяли в них массовые доли растворимого белка весовым методом. Состав свободных аминокислот в ферментативном гидролизате кератина пера при действии препарата vaStreptomycesfradiospiralisBKM А-157 определяли методом ионнообменной хроматографии на автоматическом аминокислотном анализаторе ААА-881 (Чехия). Разделение аминокислот проводили на аналитической колонке, заполненной ионнообменной смолой «Ostión LGFA» со ступенчатым элюированием тремя натрий-цитратными буферами с различными значениями pH (3,5; 4,25; 9,5).

Исследование влияния различных ферментных препаратов на расщепление кератина пера проводили после его предварительной обработки мочевиной в оптимальных рН-условиях для действия протеаз:

Ферментные препараты Трипсин - живо тного происхождения Амилооризин Г 1 Ох Элегантин Г 1 Ох ПротосубтилинГ 10х Пекгофоетидин Г 10х ПигмауесинГ 10х ПротолихининГ10х Ферментный препарат Г 10х из Streptomyces fradioapiralis

Оптимальное значение pH

8,0

5.5-5,7

2.5-3,5 8,0 5,7

3.0-3,5 8,0

7.0-8,0

На рисунке показан гидролиз кератина пера различными ферментными препаратами. На графике видно, что протеиназы препаратов амилооризина (кривая 2), элегантина (кривая 3) и пектофоетидина (кривая 5) обладали слабой расщепляющей способностью: раство-

.Хмипо кислота

Гистидин

Треонин

Аланин

Метионин

Аспарагиновая кислота Глутаминовая кислота

Сепии

г---

Глицин

Цистин

А -О..

Массобаа -¿о..у.,с. •, к >Кчи.'\-у\

количеству аминокислоты 1,72 1,99

2.09 2,26 2,62

3.10 3,59 4,08 4,63

■¿,17

Лизин

Валин

Тирозин

Аргинин

Лейцин

Изолейцин

Незаменимые аминокислоты

4,71

4.97 б,Об 14,53 16,98

21.97 57.58

рение не превышало 47,3% кератина. Протеолитиче-ский комплекс пигмауесина (кривая 6) гидролизовал белок на 56,8%. Использование протеолитических ферментов, действующих в щелочной зоне, дало лучший эффект по сравнению с ферментами, гидролизующими кератин в кислой зоне. По действию на кератин ;_ера эти ирїлі.р;:.-: р^гііиціїїсідо: и

последовательности: препарат из £геріотусех

},гасііо$рігаІі$ > протолихинин > протосубтилин > трипсин (соответственно кривые 8, 7, 4, 1).

Следует отметить, что препарат кератинрасщеп-ляющих протеаз из 8їїгрІотусе$ /гасііозрігаїіз значительно превосходил другие препараты по своей способности переводить кератин пера в растворимую форму: за 6 ч гидролиза в раствор перешло 98.4% белка. Этот показатель для остальных препаратов ниже на 25-71%. Вероятно, протеазы препарата из -ерШтусез /гскІіохрігаНз обладают широкой специфичностью к гидролизу пептидных связей в молекуле кератина. Для суммарного состава продуктов гидролиза кератина пера [5] характерно следующее соотношение, %: растворимый белок 0,6; пептиды 12,8; аминокислоты 84,2.

Известно, что кератины отличаются высоким массовым процентом и балансом незаменимых аминокислот. Кератин по соотношению незаменимых аминокислот аналогичен мясу, по содержанию лизина превосходит молоко [6].

Нами установлен состав свободных аминокислот в ке-ратиновом гидролизате пера:

Анализ полученных данных свидетельствует о высоком содержании в гидролизате таких аминокислот, как изолейцин лейцин, аргинин, тирозин, и низком - метионин. аланин, треонин и гистидин. Отсутствие триптофана, прелина и цистеина указывает на то, что эти аминокислоты входят в состав пептидов или растворимого белка. Содержание незаменимых аминокислот к общему количеству аминокислот в гидролизате -57,58%, что выгодно отличает исследуемый ферментативный гидролизат от химического [2]. Так, эта величина при кислотном гидролизе кератинов соляной кислотой составляет 37,8, фосфорной- 33,6%. Щелочным гидролизом кератинов получают продукт, который содержит 15 аминокислот, из них больше всего аргинина, валина и лизина. Содержание незаменимых аминокислот составляет 30,5%. При использовании едкого натрия это соотношение достигает 39,7%, при действии аммиаком - 21,1% [7]. Перьевая мука после водного гидролиза содержит мало лизина и метионина, но в большом количестве цистин и изолейцин [8]. Белковый концентрат, получаемый при гидролизе кератинов мочевиной и сульфитом натрия, содержит до 39% незаменимых аминокислот [9] - больше, чем в мясо-костной, мясной, рыбной муке и сухом обрате.

При ферментативном гидролизе предварительно обработанного кератина техническим- панкреатином получается кормовой гидролизат с полным набором незаменимых аминокислот. Они составляют 37,4% от общего количества аминокислот. Следует отметить, ч 1 и й V & не рлиио вые гидр о лизат.ы с одержат не знач. и, ■ тельное количество триптофана. В зависимости от вида в кератинах данной аминокислоты 0,7-0,9% или же она отсутствует [2].

Таким образом, установлено, что для получения белковых гидролизатов целесообразно использовать ферментный препарат из Б^ерШпусез ¡гаспо8р\гаИ$. При этом происходит полное растворение белка, что является важным условием создают безотходной технологии при переработке кератина пера. Основные продукты гидролиза - аминокислоты (84,2%) и пептиды (12,8%). Биоконверсия кератина выгодно отличается от химической обработки. Гидролизат можно использовать в пищевой промышленности (балансирование продуктов отдельными аминокислотами), в косж-тических изделиях или для повышения бтдоппсат исННйСГП коре..ПЗМХ ПРО- •,'410.1!.

ЛИТЕРАТУРА

1. Грачева И.М., Кривова А.Ю. Технология ферментных препаратов. - 3-е изд., перераб. и доп. - М.: Элевар, 2000. - 5Щ.

2. Химия пищи. Кн. 1: Белки: структура, функции, роль в питании. В 2 кн. / И. А. Рогов, Л.В. Антипова, Н.И. Дунчеико и др. - М.: Ко-

ОГ\ЛП ЮЛ ~

JiU'w'j ¿UÜU. — JCV-r L.

3. Антипова Л.В., Жеребцов H.A. Биохимия мяса и мясных продуктов: Учеб. Пособие. - Воронеж: Изд-во ВГУ, 1991. -184 с.

4. Антипова Л.В., Глотова И.А., Рогов И.А. Методы исследования мяса и мясных продуктов. - М.: Колос, 2001. - 376 с.

5. Шамхаиов Ч.Ю. Оптимизация условий биосинтеза кера-тинрасщепляющих протеаз Streptomyces fradiospiralis ВКМ А-157 и изучение их физико-химических свойств: Автореф. дис. ...канд. техи. наук. - Киев, 1986. - 24 с.

6. Химический состав пищевых продуктов. Кн. 2: Справочные таблицы содержания аминокислот, жирных кислот, витаминов, макро- и микроэлементов, органических кислот и углеводов / Под

ред. проф., д-ра техн. наук И,М. Скурихина и проф., д-ра мед. наук М.Н. Волгарева. - 2-е изд., перераб. и доп. - М.: Агропромиздат, 1987.-360 с.

7. Горяев МИ., Быкова Л.Н., Грлзявк О-В. Аммиачный гидролиз кератинсодержащего сырья//Мясная индустрия СССР. -1978. -№3.-С. 36-37.

8. Лобзов К.И., Валик В.Г. Рационально использовать отходы переработки птицы. // Мясная индустрия СССР. - 1980. -№ 4. - С. 23-25.

9. Остапец Н.Г. Производство кормового белкового кон-

л (f.-Г ,,.тг.ял-~ ’•<•' ППГ'Г) 1ПТО ХГ- С Г' ОС о-т Грл! а / :vwvntw ппд)' С1рлл — i У t О. — J4« J. — ¿J—Z. !.

Кафедра технологии мяса и мясных пр одукгов

Поступила 18.02.03 г.

(678.546.1 +637.344).661.185-3

СТРУКТУРООБРАЗОВАНИЕ В БИНАРНЫХ СИСТЕМАХ МЕТИЛЦЕЛЛЮЛОЗА-ТВОРОЖНАЯ СЫВОРОТКА

с.г. козлов Установлено, что консистенция творожной сыво-

ротки с метилцеллюлозой определяется массовой до-

Кемеровский технологическим институт г г

пищевой промышленности лей 1 еЛеООрЭЗОВагеЛЯ И СЫВОрОТОЧНЫХ иСЛКОВ в СИСТе-

ме и характером образующихся структур. Структуро-Значительным резервом в технологии струкгуриро- , ' ....

г образование, благодаря возникновению различных ви-

ванных продуктов, пользующихся неизменно повы-

^ - • дов связей между контактирующими молекулами, при-

шенным спросом, является использование сыворотки

1 ’ 1 водит к увеличению значении предельного напряже-

- недорогого вторичного сырья молочной промышлен-

ния сдвига геля.

ности. Она содержит различные биологически актив- Дашшй факг обусловлен увеличением вероятности

ные вещества, необходимые для человека, что служит активного контактирования молекул сывороточных

причиной поиска новых направлений ее переработ- белков, метилцеллюлозы и других веществ системы

501ГЧ- при повышении вязкости. Структурообразованию спо-

Известно [2], что метилцеллюлоза является эффек- собствует отсутствие четкой формы молекул метил-

тивным структурообразователем в технологии различ- целлюлозы, что является причиной образования про-

ных молочных продуктов общего и специального на- странственных структур, имеющих форм}' подвижной

значения - пудингов, муссов, желе, йогуртных напит- трехмерной сстки.

ков. С целью обоснования возможности совместного Анализ кривых свидетельствует о том, что при мас-

использования метилцеллюлозы и творожной сыво- совой доле метилцеллюлозы в системе менее 1,2% не-

ротки нами было проведено комплексное исследова- зависимо от концентрации сывороточных белков полу-

ние, направленное на установление особенностей фор- ченные гели можно охарактеризовать как дилатентное

мирования гелеобразных систем на основе бинарных тело с наличием в системе предельного напряжения

композиций метилцеллюлоза-творожная сыворотка. сдвига. Подобные тела характеризуются наличием эф-

На рис. 1 показано влияние дозы метилцеллюлозы фективной вязкости, которая обусловлена силами меж-

на гелеобразование творожной сыворотки, содержа- молекулярного взаимодействия, а индекс течения явля-

щей различну'Ю массовую долю сывороточных бел- ется величиной больше единицы, т. е. темп разруше-

ков, %: 1 - 0,6; 2 - 0,7; 3 - 0,8; 4 - 0,9. ния структуры при воздействии сдвигающей деформа-

................................. ции - большей величиной. Это подтверждает наличие

в системе непрочно связанной влаги, способной вы-

—..—_____,—....—...—...........-. прессовываться при механическом воздействии.

Переход в пластично-вязкую (Бингамову) форму

............---------------------сывороточных гелей, в которых в качестве структуро-

образователя использована метилцеллюлоза, наблюда-_” ется ПРИ ее концентрации более 1,2%. Такой переход

..... сопровождается увеличением сил взаимодействия в

—системе при одновременном снижении темпа разру^ше-

--г-"......т—.1----?-------1....---------------! ния структуры в результате воздействия сдвигающей

«,л и.*е 1.2 о м' ¿,1 ?« деформации. Это позволяет отнести данные системы к

Рис. 1 анормально вязким жидкостям, в которых вязкость за-

з. Па4

Ш0

j СЮ