CC BY
33
Биоинформационный поиск вариантов а-антигенной детерминанты белка S вируса гепатита B для создания поливалентной вакцины
A.С. Столбиков1, 2 (valkir5@yandex.com), Ю.С. Букин2, 3, Ю.П. Джиоев4, 5,
B.И. Злобин4 (vizlobin@mail.ru)
1ФГБУН «Сибирский институт физиологии и биохимии растений» Сибирского отделения РАН, г. Иркутск
2ГБОУ ВПО «Национальный исследовательский Иркутский государственный технический университет» Минобрнауки России
3ФГБУН «Лимнологический институт» Сибирского отделения РАН, г. Иркутск 4ГБОУ ВПО «Иркутский государственный медицинский университет» 5ФГБУ «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» Сибирского отделения РАМН, г. Иркутск
Резюме
Вакцинопрофилактика вирусного гепатита B - наиболее эффективный метод борьбы с данной инфекцией. В последнее время появились сообщения о высокой скорости мутационного процесса, приводящего к появлению штаммов вируса гепатита В, которые отличаются заменами в a-антигенной детерминанте S белка вируса. Увеличение количества подобных штаммов может привести к снижению эффективности существующих вакцин против данного вируса. Настоящая работа посвящена биоинформационному анализу возможных вариантов аминокислотных последовательностей белка S вируса гепатита B, представленных в базе данных GenBank, с целью выявления различий в структуре а-антигенной детерминанты белка S вируса. На основе кластерного анализа и с учетом физико-химических свойств аминокислотных остатков в последовательностях а-антигенной детерминанты предлагается набор полипептидов для создания поливалентной вакцины. Ключевые слова: вирус гепатита В, вакцины, биоинформационный анализ, а-антигенная детерминанта
Bioinformatic Search of Variants of Hepatitis B Virus protein S а-antigenic Determinant for the Polyvalent Vaccine Preparation
A.S. Stolbikov12 (valkir5@yandex.com), Yu.S. Bukin1,3, Yu.P. Dzhioev4,5, V.I. Zlobin4 (vizlobin@mail.ru)
1Federal State Budget Institution of Science «Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry», Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, Irkutsk
2State Educational Institution of Higher Professional Education «National Research Irkutsk State Technical University», the Ministry of Education and Science of Russia
3Federal State Budget Institution of Science «Limnological Institute», Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, Irkutsk 4State Educational Institution of Higher Professional Education «Irkutsk State Medical University»
5Federal State Budget Institution «Research Center of Family Health Problems and Human Reproduction», Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences Irkutsk Abstract
Viral hepatitis B vaccinal prevention is the most effective method against this infection. In recent times many reports appear related to the mutational process acceleration bringing to emergence of hepatitis B virus strains that differ by replacements in the virus protein S а-antigenic determinant. The increase in quantity of hepatitis B strains, which heterogeneous on а-antigenic determinant, can provoke the decrease in efficiency of the existing traditional vaccines against this virus. This study is devoted to the bioinformatic analysis of all possible variants of the deduced amino acid sequences of hepatitis B virus protein S presented in the GenBank database, for the purpose of identification of the structure differences of virus protein S-antigenic determinant. On the basis of the cluster analysis and taking into account physical and chemical properties of the amino acid residues in the sequence of а-antigenic determinant, a number of polypeptides for the polyvalent vaccine preparation are offered. Key words: hepatitis B virus, vaccines, bioinformatt analysis, а-antigenic determinant
Введение
Вирус гепатита В (ВГВ, семейство Hepadnaviridae) вызывает острые и хронические инфекции. Инфекция ВГВ имеет глобальный ареал, и, по некоторым оценкам, около 2 млрд человек во всем мире были в контакте с этим патогенным
агентом. Несмотря на успешные программы вакцинации и эффективную противовирусную терапию, носителями поверхностного антигена (HBsAg) ВГВ являются более чем 350 млн человек. Около 150 млн имеют острую форму заболевания и обладают высоким риском развития цирроза пече-
ни или гепатоцеллюлярной карциномы, от которой ежегодно умирают до 600 тысяч больных [1 - 3]. Распространенность ВГВ значительно варьирует в разных регионах мира, при этом различия обычно проводятся между зонами высокой, средней и низкой эндемичности. Эндемичность инфекции в мировом масштабе находится в границах от 10% популяции в Юго-Восточной Азии, Китае, бассейне Амазонки и районах вблизи Сахары в Африке до менее 1% - в странах Западной Европы и Северной Америки. В целом приблизительно 45% населения Земли проживает в зонах высокой эн-демичности [4].
Россия относится к регионам с высоким уровнем распространенности ВГВ, причем среди больных острыми формами гепатита В преобладают молодые люди - от 15 до 29 лет (70 - 85%). Благодаря массовой вакцинации населения как заболеваемость хроническими и фульминантными формами, так и бессимптомное носительство вируса реально снизились. Так, с 1999 по 2013 год носительство сократилось с 140,8 до 18,1 человека на 100 тыс. населения. В абсолютных цифрах в 2007 году в РФ зарегистрировано 7520 случаев острого гепатита В и 60 782 впервые выявленных носителя ВГВ, в 2013 году - соотвественно 1904 и 25 880. Суммарное число больных хроническим гепатитом В составляет около 1 млн человек [5 - 7].
Как известно, ДНК ВГВ включает в себя четыре гена (S, C, P и X), перекрывающих друг друга. Ген S несет информацию о HBsAg и рецепторах, находящихся на поверхности и необходимых для проникновения вируса в гепатоцит. Ген С (cor) кодирует белок нуклеокапсида и его антигены (HBcAg и HBeAg), ген Р - фермент ДНК-полимеразу, а ген Х-белка активирует экспрессию генов ВГВ. Молекулярная информация о структуре и функции этих генов имеет важное практическое значение, поскольку в последние годы установлено, что в той или иной зоне генома под действием различных факторов, в основном под действием вакцинных и лекарственных препаратов, происходят точечные мутации [29, 30]. Так, мутации в гене, кодирующем HBsAg, приводят к снижению аффинности с анти-HBs, а мутации в PreC-зоне могут быть причиной тяжелого течения инфекции. Полиморфизмы в гене Р часто бывают вызваны противовирусной терапией. Поэтому появление мутаций у вируса, придающих ему устойчивость к противовирусным препаратам, является основной причиной неэффективности лечения и мер профилактики использующимися вакцинными препаратами [29].
Вакцинопрофилактика гепатита В достаточно эффективна, она осуществляется посредством коммерческих вакцин, созданных на основе реком-бинатных дрожжевых культур [8]. Однако следует обратить внимание на то, что при создании генетических конструкций, кодирующих синтез HBsAg (S белка), использовались последовательности геномов наиболее распространенных штаммов
ВГВ и не всегда учитывались вариации в строении основного антигенного белка у менее часто встречающихся разновидностей ВГВ. Ранее считалось, что присутствие в вакцине «консервативной» детерминанты НВsAg (а-детерминанты, в 124 -147-м аминокислотном остатке) способно достаточно надежно защитить вакцинируемого от всех субтипов ВГВ и поэтому создание вакцин для конкретного региона, в котором курсирует определенный субтип ВГВ, нецелесообразно [4, 9]. Мнение научного сообщества начало постепенно меняться, когда результаты исследовательских работ все чаще стали подтверждать, что замены в пределах а-детерминанты влияют на выработку антител. Так, установлено, что замена только в 141-й позиции лизина на глутаминовую кислоту дает вирусу возможность нарушить распознавание HВsAg антителами, несмотря на их высокий уровень после вакцинации [10, 11]. Исследования с использованием подопытных животных (шимпанзе) показали, что при иммунизации разными субтипами HВsAg у шимпанзе вырабатываются антитела к HВsAg того серотипа, который был им введен, а также что Т- и В-лимфоцитарный ответ специфичен субтипу и генотипу вируса [9, 12].
Различия в аминокислотном составе в пределах антигенных детерминант ВГВ приводят к тому, что в одной и той же пробе сыворотки иммунизированных людей проявляется положительная реакция на HВsAg и на анти-HВsAg, а это означает отсутствие у этих людей защитного иммунитета к ВГВ [13]. Имеются также сообщения об изменении субтипа HВsAg с adw на ayw в связи с реорганизацией генома вируса у больных хроническим гепатитом В, что подчеркивает большую устойчивость HВsAg субтипа ayw [12, 14, 15]. Таким образом, рекомбинантная вакцина ВГВ обеспечивает хорошую защиту, но не против гетерологичных штаммов вируса [16].
На территории Российской Федерации наиболее распространен ВГВ генотипа D, серотипа ayw (95%) [17]. На территории Московского региона были обнаружены мутантные штаммы ВГВ, имеющие замены в положениях 143 и 145 белка S [18]. Данные мутантные штаммы G145R и S143L относятся к категории «ускользающих» от иммунного ответа [17, 19], вырабатывающегося при стандартном вакцинировании.
Математическая модель распространения му-тантных форм ВГВ продемонстрировала увеличение частоты инфицирования такими вирусами, которые в течение 50 лет с начала вакцинации полностью вытеснят «дикий» тип [20]. Поэтому можно заключить, что разработка новых поливалентных вакцин против гепатита В, способных формировать эффективную защиту против максимального количества генетических вариантов ВГВ, является актуальной задачей.
Цель настоящей работы - представить результаты анализа расшифрованных аминокислотных последовательностей а-детерминанты, локализо-
ванной в пределах 124 - 147-го аминокислотного остатка основного антигенного белка (HBsAg) ВГВ. На основе оценки замен в a-детерминанте, являющейся основной мишенью для нейтрализующих антител [21, 22], предлагаются варианты аминокислотных последовательностей, которые было бы целесообразно использовать при создании новых кандидатных вакцин против гепатита В.
Материалы и методы
Аминокислотные последовательности основного поверхностного антигенного белка S ВГВ были получены из международной базы данных GenBank, находящейся в свободном доступе. Первичную обработку аминокислотных последовательностей проводили с помощью программы BioEdit [23]. Последовательности, предварительно извлеченные из генного банка, сохранялись в формате FASTA, откуда их импортировали в программу BioEdit. С помощью встроенного в программу BioEdit приложения Clustalw Multiple Alignen проводилось выравнивание последовательностей. В качестве эталонного образца при выравнивании использовалась последовательность основного антигенного белка ВГВ субтипа ayw [24]. В итоге были выделены уникальные последовательности a-антигенной детерминанты вируса, для классификации которых был применен метод кластерного анализа UPGMA, реализованный в программном пакете PHYLIP [25]. Матрица дистанций между аминокислотными последовательностями была построена с помощью модели аминокислотных замен PAM (М.О. Dayhoff [26]), реализованной в программе Protdist пакета PHYLIP. Выбранная модель замен позволяет при расчете дистанций между последовательностями учесть частоту встречаемости замены одной аминокислоты на другую, рассчитанную на основе анализа большого количества аминокислотных последовательностей. Таким образом, принимается во внимание тот факт, что замена одной аминокислоты на другую, близкую по свойствам, происходит чаще, чем замена одной аминокислоты на другую, отличающуюся по физико-химическим характеристикам. Анализ филогенетического древа и замен в аминокислотных последовательностях проводился с учетом таблиц физико-химических свойств аминокислот, опубликованных в источнике Р. Мари с соавт. [27].
Результаты и обсуждение
В процессе поиска информации в базе данных GenBank было обнаружено 504 полноразмерных аминокислотных последовательности белка S В^. После визуальной обработки и выравнивания последовательностей в программе BioEdit из всего массива данных было выделено 42 варианта a-антигенной детерминанты белка S. Варианты a-антигенной детерминанты отличались аминокислотными заменами в разных положениях. Их разнообразие и сравнение с «диким» типом пред-
ставлены в таблице 1. Все возможные варианты а-антигенной детерминанты обозначены в таблице и далее по тексту как а1, а2, ... а42.
Известно, что антитела связываются с антигенами полипептидной природы за счет водородных связей, электростатического взаимодействия и диполь-дипольного взаимодействия [28]. Анализ данных таблицы 1 показывает, что в некоторых случаях при сравнении а-антигенной детерминанты с «диким» штаммом ВГВ наблюдаются замены, при которых резко меняются свойства аминокислот в рассматриваемом положении последовательности. Например, происходит замена полярной гидрофильной аминокислоты на неполярную гидрофобную или аминокислоты, способной образовывать водородную связь, на аминокислоту, не способную ее образовывать. Это означает, что в некоторых случаях антитела, эффективно связывающие «дикий» штамм вируса, не будут столь действенны по отношению к мутантным штаммам.
Для всего массива данных из 42 а-антигенных детерминант белка S ВГВ была построена матрица дистанций по модели МО Dаyhoff РАМ, по которой с помощью метода UPGMA реконструировано филогенетическое древо (рис. 1). Анализ филогенетического древа показал, что в сравниваемых последовательностях при дистанциях больших, чем 0,04, обнаруживаются замены, приводящие к изменению зарядовых или полярных свойств аминокислот, либо происходит замена аминокислоты, способной образовывать водородные связи, на аминокислоту, не обладающую такой способностью.
В рамки взяты варианты антигенных детерминант, обладающие сходными физико-химическими свойствами аминокислотных остатков. В правой части рисунка отмечены детерминанты, имеющие замены в 143-й и 145-й позицииях белка S. В прямоугольники взяты мутации S143L и G145R.
Некоторые антигенные детерминанты с дистанциями ниже 0,04 в различающихся позициях содержали аминокислоты, близкие по физико-химическим свойствам. Детерминанты а14 и а16 в 22-й позиции имели замену глицина на аланин, а13, а17, а13 в 15-й позиции - цистеина на серин (обе аминокислоты полярные) и в 17-й позиции -треонина на серин (обе аминокислоты способны образовывать водородные связи). Детерминанты а23 и а36 в 11-й позиции имели замену лейцина на изолейцин, а5 и а24 в позиции 22 - лизина на аргинин (обе аминокислоты положительно заряжены) и детерминанты а3, а30, а31 и а9 в позиции 3 -валина на изолейцин (обе аминокислоты неполярные и не заряжены).
Особое внимание при анализе было уделено штаммам, имеющим замены в положении 143 и 145 белка S, так как данные положения - ключевые для узнавания антигена антителом [17, 19]. В последовательности а41 присутствует замена се-рина на лизин, что относит эту последовательность к категории «ускользающих» от иммунного ответа
Таблица 1.
Различные варианты а-антигенной детерминанты белка S ВГВ в исследуемой выборке
Аминокислотная последовательность а-детерминанты у разных штаммов ВГВ Позиция в последовательности и характер замен Количество записей в вепВапк различных аминокислотных последовательностей а-детерминанты Процент от общего количества аминокислотных последовательностей белка S, занесенных в вепВапк
а1 CTTTVQGTSMYPSCCCTKPSDGNC («дикий» тип, Таиланд) 1 0,19802
а2 CTTPAQGTSMYPSCCCTKPSDGNC 127 Thr на Pro 128 Val на Ala 1 0,19802
а3 CTIPAQGTSMFPSCCCTKPSDGNC 126 Thr на Ile 127 Thr на Pro 128 Val на Ala 134 Tyr на Phe 137 27,12871
а4 CTTPAQGTSMFPSCCCTKPSDGNC 127 Thr на Pro 128 Val на Ala 134 Tyr на Phe 65 12,87129
а5 CTIPAQGTSMFPSCCCTKPSDKNC 126 Thr на Ile 127 Thr на Pro 128 Val на Ala 134 Tyr на Phe 145 Gly на Lys 3 0,594059
а6 CTSPAQGTSMFPSCCCTKPSDGNC 126 Thr на Ser 127 Thr на Pro 128 Val на Ala 134 Tyr на Phe 3 0,594059
а7 CTIPALGAFKFPSCGGTKPSDVDS 126 Thr на Ile 127 Thr на Pro 128 Val на Ala 129 Gln на Leu 131 Thr на Ala 132 Ser на Phe 133 Met на Lys 134 Tyr на Phe 138 -139 Cys на Gly 145 Gly на Val 146 Asn на Gly 147 Cys на Ser 1 0,19802
а8 CTIPAHGTSMFPSCCCTKPSDGNC 126 Thr на Ile 127 Thr на Pro 128 Val на Ala 129 Gln на His 134 Tyr на Phe 1 0,19802
а9 CTVPAQGTSMFPSCCCTKPSDGNC 126 Thr на Val 127 Thr на Pro 128 Val на Ala 134 Tyr на Phe 1 0,19802
а10 CTTPAQGNSMFPSCCCTKPTDGNC 127 Thr на Pro 128 Val на Ala 130 Thr на Asn 134 Tyr на Phe 143 Ser на Thr 1 0,19802
а11 CTTLAQGTSMFPSCCCSKPSDGNC 127 Thr на Leu 128 Val на Ala 134 Tyr на Phe 140 Thr на Ser 3 0,594059
а12 CTTPAQGTSMFPSCCCTKPTDGNC 127 Thr на Pro 128 Val на Ala 134 Tyr на Phe 143 Ser на Thr 164 32,47525
Аминокислотная последовательность а-детерминанты у разных штаммов ВГВ Позиция в последовательности и характер замен Количество записей в вепВапк различных аминокислотных последовательностей а-детерминанты Процент от общего количества аминокислотных последовательностей белка S, занесенных в вепВапк
а13 CTTPARNTSMFPSCCCTKPSDGNC 127 Thr на Pro 128 Val на Ala 134 Tyr на Phe 129 Gln на Arg 130 Gly на Asn 134 Tyr на Phe 15 2,970297
а14 CTTPARNISMFPSCCCTKPSDANC 127 Thr на Pro 128 Val на Ala 134 Tyr на Phe 129 Gln на Arg 130 Gly на Asn 131 Thr на Ile 134 Tyr на Phe 145 Gly на Ala 1 0,19802
а15 CTTPARNTSMFPSCCCSKPSDGNC 127 Thr на Pro 128 Val на Ala 134 Tyr на Phe 129 Gln на Arg 130 Gly на Asn 134 Tyr на Phe 140 Thr на Ser 1 0,19802
а16 CTTPARNISMFPSCCCTKPSDGNC 127 Thr на Pro 128 Val на Ala 134 Tyr на Phe 129 Gln на Arg 130 Gly на Asn 131 Thr на Ile 134 Tyr на Phe 1 0,19802
а17 CTTPARNTSMFPSCRCTKPSDGNC 127 Thr на Pro 128 Val на Ala 134 Tyr на Phe 129 Gln на Arg 130 Gly на Asn 134 Tyr на Phe 138 Cys на Arg 1 0,19802
а18 CTTPAQGTSMFPSCCCTKPTDGNY 127 Thr на Pro 128 Val на Ala 134 Tyr на Phe 143 Ser на Thr 147 Cys на Tyr 9 1,782178
а19 CTTPAQGNSTFPSCCCTKPTDSNC 127 Thr на Pro 128 Val на Ala 131 Thr на Asn 133 Met на Thr 134 Tyr на Phe 143 Ser на Thr 145 Gly на Ser 2 0,39604
а20 CATPAQGTSMFPSCCCTKPTDGNC 126 Thr на Ala 127 Thr на Pro 128 Val на Ala 134 Tyr на Phe 143 Ser на Thr 1 0,19802
а21 CTTPAQGASMFPSCCCTKPTDRNC 127 Thr на Pro 128 Val на Ala 130 Gly на Ala 134 Tyr на Phe 143 Ser на Thr 145 Gly на Arg 1 0,19802
а22CTTPAQGTSMFPSCCRTKPTDGNC 127 Thr на Pro 128 Val на Ala 134 Tyr на Phe 139 Cys на Arg 1 0,19802
Аминокислотная последовательность а-детерминанты у разных штаммов ВГВ Позиция в последовательности и характер замен Количество записей в вепВапк различных аминокислотных последовательностей а-детерминанты Процент от общего количества аминокислотных последовательностей белка S, занесенных в вепВапк
а23 CTTPAQGTSMIPSCCCTKPTDGNC 127 Thr на Pro 128 Val на Ala 134 Tyr на Ile 143 Ser на Thr 2 0,39604
а24 CTIPAQGTSMFPSCCCTKPSDRNC 126 Thr на Ile 127 Thr на Pro 128 Val на Ala 134 Tyr на Phe 145 Gly на Arg 4 0,792079
а25 CTTPAQGNSMYPSCCCTKPSDGNC 127 Thr на Pro 128 Val на Ala 131 Thr на Asn 45 8,910891
а26 CTTPAQGTSLFPSCCCTKPTDGNC 127 Thr на Pro 128 Val на Ala 134 Tyr на Phe 133 Met на Leu 143 Ser на Thr 6 1,188119
а27 CTTPVQGTSMFPSCCCTKPTDGNC 127 Thr на Pro 134 Tyr на Phe 143 Ser на Thr 1 0,19802
а28 CTSPAQGNSTIPSCCCTKPSDGNC 126 Thr на Ser 127 Thr на Pro 128 Val на Ala 131 Thr на Asn 133 Met на Thr 134 Tyr на Iie 1 0,19802
а29 CTITAQGTSMFPSCCCTKPSDGNC 126 Thr на Ile 128 Val на Ala 134 Tyr на Phe 1 0,19802
а30 CTXPAQGTSMFPSCCCTKPSDGNC 126 Thr на ? 127 Thr на Pro 128 Val на Ala 134 Tyr на Phe 6 1,188119
а31 CTIPAQGXSMFPSCCCTKPSDGNC 126 Thr на Ile 127 Thr на Pro 128 Val на Ala 131 Thr на ? 134 Tyr на Phe 1 0,19802
а32 CTTXAQGTSMFPSCCCTKPTDGNC 127 Thr на ? 128 Val на Ala 134 Tyr на Phe 143 Ser на Thr 1 0,19802
а33 CTTPAQGTSMFPSCCCTKPMDGNC 127 Thr на ? 128 Val на Ala 134 Tyr на Phe 143 Ser на Met 3 0,594059
а34 CTAPAQGTSMFPSCCCTKPTDGNC 126 Thr на Ala 127 Thr на Pro 128 Val на Ala 134 Tyr на Phe 143 Ser на Met 1 0,19802
а35CTNPAQGTSMFPSCCCTKPSDGNC 126 Thr на Asn 127 Thr на Pro 128 Val на Ala 134 Tyr на Phe 3 0,594059
Аминокислотная последовательность а-детерминанты у разных штаммов ВГВ Позиция в последовательности и характер замен Количество записей в вепВапк различных аминокислотных последовательностей а-детерминанты Процент от общего количества аминокислотных последовательностей белка S, занесенных в вепВапк
а36CTTPAQGTSMLPSCCCTKPTDGNC 127 Thr на Pro 128 Val на Ala 134 Tyr на Leu 143 Ser на Thr 2 0,39604
а37 CTMSAQGTSMFPSCCCTKPSDGNC 126 Thr на Met 127 Thr на Ser 128 Val на Ala 134 Tyr на Phe 1 0,19802
а38 CTSPAQGTSMFPSCCCTKPTDGNC 126 Thr на Met 127 Thr на Ser 128 Val на Ala 134 Tyr на Phe 143 Ser на Thr 1 0,19802
а39 CTTPAQGTSMFPSCCCTKPTDANC 127 Thr на Ser 128 Val на Ala 134 Tyr на Phe 143 Ser на Thr 145 Gly на Ala 1 0,19802
а40 CTTPAHGTSMFPSCCCTKPTDGNC 126 Thrна ? 127 Thr на Ser 128 Val на Ala 134 Tyr на Phe 1 0,19802
а41 CTTPAQGNSMYPSCCCTKPLDGNC 127 Thr на Pro 128 Val на Ala 130 Thr на Asn 143 Ser на Leu 1 0,19802
а42 CTTPAQGNSVYPSCCCTKPSDGNC 127 Thr на Pro 128 Val на Ala 131 Thr на Asn 133 Met на Val 1 0,19802
штаммов S143L. По информации, размещенной в генетическом банке, данная последовательность белка S была расшифрована от больного, проживающего на территории Лаоса. Аминокислотные последовательности а24 и а21 имели замену, делающую их «ускользающим» типом G145R. На филогенетическом древе видно, что у последовательностей а24 и а21 достаточно отдаленная степень родства. По данным генетического банка, последовательность а24 была выявлена в Индонезии, а21- в Китае. Другая особенность последовательности а21 заключается в наличии мутации в критическом положении 143 - аминокислота серин заменена на треонин. Подобную замену (серина на треонин в положении 143) несут последовательности а10, а12, а18, а19, а20, а21, а22, а23, а26, а27, а32, а34, а36, а38 и а40. Серин и треонин, близкие по свойствам, представляют собой аминокислоты, содержащие гидроксильную группу. Следовательно, данный тип замен не должен оказывать заметного влияния на связывание а-антигенной детерминанты и антител, выработанных на «дикий» штамм ВГВ. Однако это нуждается в экспериментальной проверке. Почти все последовательности, кроме а19, содержащие замену типа S143T на филоге-
нетическом древе (см. рис. 1), образуют единый кластер, что указывает на происхождение их от единого предка. Последовательность а19, вероятнее всего, сформировалась самостоятельно. Последовательность а33 в положении 143 имеет замену серина на метионин. Серин и метионин относятся к аминокислотам, входящим в разные классы, и обладают разными физико-химическими свойствами, что должно негативно сказываться на взаимодействии антиген-антитело. Вероятнее всего, ВГВ, в состав которого входит данная а-антигенная детерминанта, будет уходить от иммунного ответа. Последовательности а-антигенных детерминант, а39, а19, а7 и а5 в положении 145 белка S имеют замену глицина на аланин, серин, валин, лизин. Все указанные замены меняют свойства аминокислоты в положении 145. Следовательно, штаммы ВГВ, содержащие подобные замены, нуждаются в отдельных исследованиях на предмет сродства их антигенных детерминант к антителам, вырабатываемым на «дикий» штамм вируса.
Среди всего количества последовательностей, представленных в таблице 1, варианты а19 и а21 имеют замены сразу в обоих критических поло-
Рисунок 1.
Филогенетическое древо 42 форм а-антигенных детерминант белка S БГБ
жениях - 143 и 145 белка S. Причем вариант а21 имеет важную замену G145R. В положении 143 варианта а21 замена серина на треонин не играет важной роли, как и последовательность а19 в положении 143 при замене серина на треонин. В положении 145 довольно значимую с точки зрения физико-химических свойств роль играет замена глицина на серин. Двойные мутанты в положениях 143 и 145 белка S вируса, вероятнее всего, будут менее подвержены связыванию антителами к «дикому» штамму ВГВ.
Таким образом, после филогенетического анализа и анализа аминокислотных замен в последовательностях нами было выделено 34 варианта а-антигенной детерминанты ВГВ, которые потенциально могут проявлять разную степень антигенной активности по отношению к антителам, вырабатываемым при вакцинации. К выделенным детерминантам относятся последовательности: а1, а2, а3, а4, а5, а6, а7, а8, а10, а11, а12, а13, а14, а18, а19, а20, а21, а22, а23, а24, а25, а26, а27, а28, а29, а33, а34, а35, а37, а38, а39, а40, а41, а42 (см. табл. 1). Все перечисленные последовательности отличаются друг от друга заменами, приводящими к значительным изменениям физи-
ко-химических свойств в мутантных положениях. Отдельно стоит выделить последовательности а5, а7, а19, а21, а24, а39 и 41, имеющие замены в положениях 143 и 145 белка ВГВ и влияющие на распознавание ангинена антителами. Все вышеперечисленные последовательности а-антигенных детерминант ВГВ нуждаются в детальной экспериментальной проверке на предмет их связывания с антителами, специфичными к «дикому» штамму вируса. Те последовательности, которые будут иметь достаточно низкое сродство с антителами к «дикому» штамму вируса, можно вносить в качестве дополнения к уже разработанным генетическим конструкциям на основе рекомбинатных дрожжей, трансгенных растений, а также использовать при создании абсолютно новых моделей, экспрес-сирующих основной антигенный белок ВГВ.
Современные научные данные указывают на высокую изменчивость ВГВ, обусловленную большой скоростью репликации и отсутствием механизма корректировки после репликационных процессов. Это создает большое количество клоновых квазивидов в популяции, в которых накапливаются мутантные формы вируса, способные обходить противовирусную систему организма [29].
Выводы
При анализе информации по представленным в генетическом банке последовательностям белка S ВГВ нами были обнаружены различные типы аминокислотных замен в а-антигенной детерминанте. Часть изменений в а-антигенной детерминанте не приводила к существенному изменению физико-химических свойств аминокислот в заданной позиции. Другая часть замен существенно изменяла свойства аминокислот в исследуемой позиции белка. В критических положениях 143 и 145 в исследуемом наборе данных были обнаружены как уже известные замены S143L и G145R, препятствующие связыванию антител с антигеном, так и ряд других замен, меняющих физико-химические
свойства аминокислот. Таким образом, в представленной работе с помощью методов биоинформатики осуществлен поиск аминокислотных сайтов, ответственных за изменение свойств антигенной детерминанты ВГВ. Выявленные мутантные варианты а-антигенной детерминанты ВГВ необходимо исследовать в эксперименте на предмет связывания с антителами к «дикому» типу вируса - с целью возможного использования их для получения перспективных вакцинных конструкций, которые с большой долей вероятности будут индуцировать формирование иммунного ответа организма по отношению к максимальному числу генетических вариантов вируса, циркулирующих в человеческой популяции. Ш
Литература
1. Амосов А.Д. Гепатит В. Новосибирск: Вектор-Бест; 2006: 128.
2. Gerlich W.H. Medical virology of hepatitis B: how it began and where we are now. Virol. J. 2013; 10: 239.
3. World Health Organization. Hepatitis B vaccines. Wkly. Epidemiol. Rec. 2004; 79 (28): 255 - 263.
4. Онищенко Г.Г., Дементьева Л.А. Распространение вирусных гепатитов как угроза национальной безопасности. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2003; 4: 93, 94.
5. Садикова Н.В., Кузин С.Н., Ершова О.Н., Кириллова И.Л., Забелин Н.Н., Кузина Л.Е. и др. Количественные характеристики эпидемического процесса гепатита В на территории Российской Федерации. Эпидемиология и Вакцинопрофилактика. 2008; 5: 4 - 9.
6. Ежлова Е.Б., Мельникова А.А., Чернявская О.П., Жилина Н.Я., Кононенко И.Н. Вакцинопрофилактика вирусного гепатита В. Инфекция и иммунитет. 2012; 2 (1 - 2): 67.
7. Goldstein S.T., Fiore A.E. Toward the global elimination of hepatitis B virus transmission. J. Pediatr. 2001; 139 (3): 343 - 345.
8. Kollmann T.R. Variation between populations in the innate immune response to vaccine adjuvants. Front Immunol. 2013; 4: 81.
9. Millman I., Toby Eisenstein K., Baruch S. Blumberg. Hepatitis B: the virus, the disease, the vaccine. New York and London: Plenum Press; 1984: 144.
10. Karthigesu V.D., Allison L.M., Fortuin M., Mendy M.,Whittle H.C., Howard C.R. A novel HBV variant in sera of immunized children. Journal of General Virology. 1994; 75: 443 - 448.
11. Крымский М.А., Крымский РМ., Буданов М.В., Борисова В.И. Соответствие вакцин против гепатита В типу вируса, превалирующего на территории Российской Федерации. Биофармацевт. журн. 2010; 2 (5): 8 - 15.
12. Cupps T.R., Hoofnagle J.H. In vitro T-cell immune response to the pre-S antigen of hepatitis B virus. J. Immunol. 1993; 151: 3353 - 3358.
13. Майер К.П. Гепатит и последствия гепатита. Москва: ГЭОТАР-Медиа; 1999: 38.
14. Gerner P., Friedt M., Oettinger R. The HBV seroconversion in children with chronic hepatitis. Virology. 1998; 245 (1): 163.
15. Yong-Lin Y., Qiang F., Ming-Shun Z., Jie C., Gui-Ming M., Zu-Hu H. et al. Hepatitis B surface antigen variants in voluntary blood donors in Nanjing. (China). Virol. J. 2012; 9: 82.
16. Heijtink R.A., Bergen P., Melber K. Hepatitis B surface antigen (HBsAg) derived from yeast cells (Hansenula polymorpha) used to establish an influence of antigenic subtype (adw2, adr, ayw3) in measuring the immune response after vaccination. Vaccine. 2002; 20: 2191 - 2196.
17. Баженов А.И., Эльгорт Д.А., Фельдшерова А.А. Будницкая П.З., Никитина Г.И., Xaц Ю.С. и др. Выявление антител к мутантным формам HBSAG у лиц, иммунизированных против гепатита В вакцинами разных субтипов. Эпидемиология и Вакцинопрофилактика. 2011; 5: 49 - 53.
18. Баженов А.И., Коноплева М.В., Эльгорт Д.А., Фельдшерова А.А., Будницкая П.З., Никитина Г.И. и др. Алгоритм серологического поиска и оценка распространенности серологически значимых HBsAg-мутаций у носителей вируса гепатита В. ЖМЭИ. 2007; 6: 30 - 37.
19. Баженов А.И., Эльгорт Д.А., Фельдшерова А.А. Будницкая П.З., Никитина Г.И., Xaц Ю.С. и др. Сравнительная оценка активности анти-HBS, индуцированных естественным путем или вакцинацией, в отношении различных вариантов HBSAG. Эпидемиология и Вакцинопрофилактика. 2012; 2: 76 - 81.
20. Wilson J.N., Nokes D.J., Carman W.F. The predicted pattern of emergence of vaccine-resistant hepatitis B: A cause for concern? Vaccine. 1999; 17: 973 - 978.
21. Iwarson S., Tabor E., Thomas H.C. Neutralization of hepatitis В virus infectivity by a murine monoclonal antibody: an experimental study in the chimpanzee. J. Med. Virol. 1985; 16: 89 - 96.
22. Stirk S.J., Thornton J.M., Howard C.R. A topological model for hepatitis В surface antigen. Intervirology. 1992; 33: 148 - 158.
23. Hall T.A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucl. Acids. Symp. 1999; 41: 95 - 98.
24. Балаян М.С., Михайлов М.И. Энциклопедический словарь: вирусные гепатиты. Москва: Новая слобода; 1994: 208.
25. Felsenstein J. PHYLIP - Phylogeny Inference Package (Version 3.2). Cladistics. 1989; 5: 164 - 166.
26. Dayhoff M.O., Schwartz R.M., Orcutt B.C. A Model of еvolutionary сhange in proteins. Atlas of Protein Sequence and Structure. 1978; 5 (Suppl. 3): 345 - 352.
27. Мари Р, Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека. Т. 2. Москва: Мир; 1993: 415.
28. Зверева В.В., Бойченко М.Н. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. Т. 1. Москва: ГЭОТАР-Медиа; 2010: 581.
29. Yim H. J. Hepatitis B virus genetic diversity and mutant. Korean J. Hepatol. 2008;14 (4): 446 - 464.
30. Zhang M., Ge G., Yang Y., Cai X., Fu Q., Cai J., Huang Z. Decreased antigenicity profiles of immune-escaped and drug-resistant hepatitis B surface antigen (HBsAg) double mutants. Virol. J. 2013; 10: 292.
References
1. Amosov A. D. Hepatitis B. Novosibirsk: Vector-Best; 2006: 128 (in Russian).
2. Gerlich W. H. Medical Virology of Hepatitis B: how it began and where we are now. Virol. J. 2013; 10: 239.
3. World Health Organization. Hepatitis B vaccines. Wkly. Epidemiol. Rec. 2004. 79; (28): 255 - 263.
4. Onyshchenko G.G., Dementyeva L.A. Distribution of virus hepatitises as threat of national security. J. Microbiol., Epidemiol. and Immunobiol. 2003; 4: 93, 94 (in Russian).
5. Sadikova N.V., Kuzin S.N., Ershova O.N., Kirillova I.L., Zabelin N.N., Kuzina L.E. et al. Quantitative characteristics of epidemic process of hepatitis B in the territory of the Russian Federation. Epidemiology and vaccinal prevention. 2008; 5: 4 - 9 (in Russian).
6. Yezhlova E.B., Melnikova A.A., Chernyavskaya O.P., Zhilina N.Y., Kononenko I.N. Vaccinal prevention of virus hepatitis B. Infection and Immunity. 2012; 2 (1 -2): 67 (in Russian).
7. Goldstein S.T., Fiore A.E. Toward the global elimination of hepatitis B virus transmission. J. Pediatr. 2001; 139 (3): 343 - 345.
8. Kollmann T.R. Variation between populations in the innate immune response to vaccine adjuvants. Front. Immunol. 2013 Apr. 2; 4: 81.
9. Millman I., Toby Eisenstein K., Baruch S. Blumberg. Hepatitis B: the virus, the disease, the vaccine. New York and London: Plenum Press; 1984: 144.
10. Karthigesu V.D., Allison L.M., Fortuin M., Mendy M., Whittle H.C., Howard C.R. A novel HBV variant in sera of immunized children. Journal of General Virology. 1994; 75: 443 - 448.
11. Krymskiy M.A., Krymskiy R.M., Budanov M.V., Borisov V.N. Compliance of vaccines against hepatitis B to type of the virus prevailing in the territory of the Russian Federation. Russian Journal of Biopharmaceuticals. 2010; 2 (5): 8 - 15 (in Russian).
12. Cupps T.R., Hoofnagle J.H. In vitro T-cell immune response to the pre-S antigen of hepatitis B virus. J. Immunology. 1993; 151: 3353 - 3358.
13. Mayer K.R Hepatitis and hepatitis consequences. Moscow: GEOTAR-Media; 1999: 38 (in Russian).
14. Gerner R, Friedt M., Oettinger R. The HBV seroconversion in children with chronic hepatitis. Virology. 1998; 245 (1): 163.
15. Yong-Lin Y., Qiang F., Ming-Shun Z., Jie C., Gui-Ming M., Zu-Hu H. et al. Hepatitis B surface antigen variants in voluntary blood donors in Nanjing (China). Virol. J. 2012 Apr. 14; 9: 82.
16. Heijtink R.A., Bergen Rv., Melber K., Janowicz Z.A., Osterhaus A.D. Hepatitis B surface antigen (HBsAg) derived from yeast cells (Hansenula polymorphs) used to establish an influence of antigenic subtype (adw2, adr, ayw3) in measuring the immune response after vaccination. Vaccine. 2002; 20: 2191 - 2196.
17. Bazhenov A.I., Elgort D.A., Feldsherova A.A. Budnitskaya R.Z., Nikitina G.I., Xats Yu.S. et al. Detection of antibodies to HBsAg mutant forms in individuals immunized of different subtypes hepatitis B vaccines. Epidemiology and Vaccinal Prevention. 2011; 5: 49 - 53 (in Russian).
18. Bazhenov A.I., Konopleva M.V., Elgort D.A. Feldsherova A.A., Budnitskaya R.Z., Nikitina G.I. et al. Algorithm of serologic screening and assessment of prevalence of serologically meaningful mutations of HBsAg in hepatitis B virus carriers. J. of Microbiol. Epidemiol. and Immunol. 2007; 6: 30 - 37 (in Russian).
19. Bazhenov A.I., Elgort D.A., Feldsherova A.A. Budnitskaya R.Z., Nikitina G.I., Xats Yu.S. et al. The Comparative estimation of anti-HBs activity against native and recombinant ype HBsAg. Epidemiology and Vaccinal Rrevention. 2012; 2: 76 - 81 (in Russian).
20. Wilson J.N., Nokes D.J., Carman W.F. The predicted patternof emergence of vaccine-resistant hepatitis B: A cause for concern? Vaccine. 1999; 17: 973 - 978.
21. Iwarson S., Tabor E., Thomas H.C. Neutralization of hepatitis B virus infectivity by a murine monoclonal antibody: an experimental study in the chimpanzee. J. Med. Virol. 1985; 16: 89 - 96.
22. Stirk S.J., Thornton J.M., Howard C.R. A topological model for hepatitis B surface antigen. Intervirology. 1992; 33: 148 - 158.
23. Hall T.A. BioEdit: a user-friendly biologicalsequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT.Nucl. Acids. Symp. 1999; 41: 95 - 98.
24. Balayan M.S. Mikhailov M.I. Encyclopedia the dictionary: virus hepatitises. Moscow: Novya Sloboda; 1994: 208 (in Russian).25. Felsenstein J. RHYLIR -Rhylogeny Inference Rackage (Version 3.2). Cladistics.1989; 5: 164 - 166.
26. Dayhoff M.O., Schwartz R.M., Orcutt B.C. A model of evolutionary change in proteins. Atlas of Rrotein Sequence and Structure. 1978; 5 (Suppl. 3): 345 - 352.
27. Murray R., Granner D., Mayes R, Rodwell B. Biochemistry of the person: V. 2. Moscow: Mir; 1993: 415 (in Russian).
28. Zvereva V.V., Boychenko M.N. Medical microbiology, virology and immunology: V. 1. Moscow. GEOTAR-Media; 2010: 581 (in Russian).
29. Yim H. J. Hepatitis B virus genetic diversity and mutant. Korean J. Hepatol. 2008; 14 (4): 446 - 464.
30. Zhang M., Ge G.,Yang Y., Cai X., Fu Q., Cai J., Huang Z. Decreased antigenicity profiles of immune-escaped and drug-resistant hepatitis B surface antigen (HBsAg) double mutants. Virol. J. 2013; 10: 292.
ГДЕ КУПИТЬ ВАКЦИНЫ
immc
многопрофильная медицинская компания
федеральная лицензия на фармацевтическую деятельность № 99-02-009852
всегда в наличии широкий ассортимент медицинских иммунобиологических препаратов отечественных и иностранных производителей
^ ВАКЦИНЫ
СЫВОРОТКИ ^ АНАТОКСИНЫ ^ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ^¡Ь ДИАГНОСТИКУМЫ ^ ИММУНОГЛОБУЛИНЫ
поставки без посредников
только по прямым контрактам с производителями
осуществляем доставку вакцин с соблюдением «холодовой цепи» во все регионы РФ авиа или собственным рефрижераторным транспортом
ЗАО «Многопрофильная Медицинская Компания «ФОРМЕД»
ф 8-800-333-62-54 е-таП^огплес^тесКги
электронный каталог вакцин www.vakcina.ru www.fmed.ruwww.kollagen.ruwww.rapid-test.ru
