CC BY
11
https://doi/org/10.33647/2713-0428-17-3E-176-182
(«0
BY 4.0
БИОИНФОРМАЦИОННЫЙ АНАЛИЗ УРОВНЯ ОСТЕОМАРКЕРОВ В ДЕСНЕВОЙ ЖИДКОСТИ ПРИ СИСТЕМНОМ ОСТЕОПОРОЗЕ И МЕСТНЫХ ОСТЕОДЕСТРУКТИВНЫХ ПРОЦЕССАХ ДЕНТОАЛЬВЕОЛЯРНОЙ ОБЛАСТИ
А.В. Сафроненко1, В.А. Косенко1, Г.А. Айрапетов2, И.А. Демидов1*, М.И. Нажева1, В.М. Поляков1
1 ФГБОУ ВО «Ростовский государственный медицинский университет» Минздрава России 344022, Российская Федерация, Ростов-на-Дону, Нахичеванский пер., 29
2 ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии» Минздрава России 344037, Российская Федерация, Ростов-на-Дону, 14-я линия, 63
На 57 больных и 15 практически здоровых людях проанализирована информативность оценки биохимических маркеров в десневой жидкости при системных и местных изменениях костной ткани различного генеза. Выделены три группы больных: группа 1 — 20 пациентов с язвенным колитом и стероидным остеопорозом вследствие терапии глюкокортикоидами; группа 2 — 22 пациента, у которых диагностирован рак слизистой оболочки дна полости рта с эрозией кортикальной кости либо зубной лунки первичной опухолью; группа 3 — 15 человек со среднетяжёлым дентальным периимплантитом. В качестве исследуемого материала использовали десневую жидкость. Определяли содержание катепсина К, тартрат-резистентной кислой фосфатазы, костной фракции щелочной фосфатазы. Установлено, что при стероидном остеопорозе из трёх исследуемых маркеров в десневой жидкости статистически значимо повышался уровень катепсина К. В группе 2 при опухолевой остеодеструкции в десневой жидкости наблюдался десятикратный прирост концентрации катепси-на К и ТРКФ на фоне умеренного повышения содержания костной фракции щелочной фосфатазы. При остеодеструкции, сопряжённой с воспалительными дентоальвеолярными процессами, имело место умеренное повышение концентрации катепсина К и тартрат-резистентной кислой фосфатазы. Таким образом, определение остеомаркеров в десневой жидкости информативно для разграничения системных и местных изменений структуры костной ткани.
Ключевые слова: остеопороз, остеомаркеры, глюкокортикостероиды, рак слизистой оболочки полости рта, десневая жидкость
Конфликт интересов: авторы заявили об отсутствии конфликта интересов.
Для цитирования: Сафроненко А.В., Косенко В.А., Айрапетов Г.А., Демидов И.А., Нажева М.И., Поляков В.М. Биоинформационный анализ уровня остеомаркеров в десневой жидкости при системном остеопорозе и местных остеодеструктивных процессах дентоальвеолярной области. Биомедицина. 2021;17(3Е):176-182. https://doi/orgЛ0.33647/2713-0428-17-3E-176-Ш
Поступила 20.04.2021
Принята после доработки 03.06.2021
Опубликована 20.10.2021
BIOINFORMATICAL ANALYSIS OF THE LEVEL OF OSTEOMARKERS IN THE GINGIVAL FLUID IN SYSTEMIC OSTEOPOROSIS AND LOCAL OSTEO-DESTRUCTIVE PROCESSES IN THE DENTOALVEOLAR REGION
Andrey V. Safronenko1, Vladislav A. Kosenko1, Grigory A. Airapetov2, Igor A. Demidov1*, Marina I. Nazheva1, Valery M. Polyakov1
1 Rostov State Medical University of the Ministry of Health Сare of Russia 344022, Russian Federation, Rostov-on-Don, Nakhichevanskiy Lane, 29
2 National Medical Research Center of Oncology of the Ministry of Health Сare of Russia 344037, Russian Federation, Rostov-on-Don, 14th Line, 63
The informational value of assessing biochemical markers in the gingival fluid of patients with various systemic and local changes in bone tissue was analyzed in a sample of 57 patients and 15 healthy people. The patients were differentiated into 3 groups: 1) 20 patients with ulcerative colitis and steroid osteoporosis due to glucocorticoid therapy; 2) 22 patients diagnosed with cancer of the mucous membrane of the floor of the mouth with erosions of the cortical bone or dental socket by a primary tumor; 3) 15 patients with moderate dental peri-implantitis. Gingival fluid was used as a test material. The content of cathepsin K, tartrate-resistant acid phosphatase, and bone fraction of alkaline phosphatase was determined. In steroidal osteoporosis, the cathepsin K level in the gingival fluid was found to be statistically significantly increased compared to other markers under study. In group 2, with tumor osteodestruction in the gingival fluid, a 10-fold increase in the concentration of cathepsin K and tartrate-resistant acid phosphatase was observed against the background of a moderate increase in the bone fraction of alkaline phosphatase content. In osteodestruction associated with inflammatory dentoalveolar processes, a moderate increase in the concentration of cathepsin K and tartrate-resistant acid phosphatase was observed. Thus, the determination of osteomarkers in the gingival fluid can be considered informative in terms of distinguishing between systemic and local changes in the structure of bone tissue.
Keywords: osteoporosis, osteomarkers, glucocorticosteroids, cancer of the oral mucosa, gingival fluid Conflict of interest: the authors declare no conflict of interest.
For citation: Safronenko A.V., Kosenko V.A., Airapetov G.A., Demidov I.A., Nazheva M.I., Polyakov V.M. Bioinformatic Analysis of the Level of Osteomarkers in the Gingival Fluid in Systemic Osteoporosis and Local Osteo-Destructive Processes in the Dentoalveolar Region. Journal Biomed. 2021;17(3E):176-182. https://doi/org/10.33647/2713-0428-17-3E-176-182
Submitted 20.04.2021 Revised 03.06.2021 Published 20.10.2021
Введение состояние в период реабилитации и проВ клинической лабораторной практике гнозировать обострение хронических вос-широко используется определение медиа- палительных заболеваний полости рта [2]. торов воспаления в биологических жидко- Однако воспалительные процессы ротовой стях полости рта. Измерение концентрации полости часто сопряжены с деструктив-цитокинов, белков острой фазы воспале- ными процессами в костной ткани паро-ния, антимикробных пептидов в слюне донта, альвеолярных отростков челюстей и десневой жидкости, экссудате позволя- [5]. Для контроля поражения костной тка-ет контролировать степень воспаления, ни в стоматологии используется широкий эффективность лечения, мониторировать спектр методов лучевой диагностики, пре-
имущественно компьютерная томография [1, 6]. Информационный потенциал определения остеомаркеров в жидкостях полости рта при контроле местной остеодеструкции остаётся невостребованным как при воспалительных, так и при опухолевых заболеваниях. Между тем, остеомаркеры являются чувствительными индикаторами состояния костного ремоделирования, баланса между остеорезорбтивными и остеообразующими процессами [3], их определение неинвазив-но, не требует дорогостоящей аппаратуры и может выполняться в любой лаборатории с сертифицированным аппаратным обеспечением для иммуноферментного анализа. Много неясных моментов остаётся в отношении того, насколько изменения остеомаркеров при системном остеопорозе сказываются на составе десневой жидкости как транссудате крови. Часто изменения остеомедиаторов в биологических жидкостях происходят раньше, чем остеодеструк-ция выявляется впоследствии при лучевых методах исследования костной ткани [4].
Целью работы явилось определить информативность оценки биохимических маркеров в десневой жидкости при системном остеопорозе, деструктивных костных изменениях в дентоальвеолярной области воспалительного и опухолевого генеза.
Материалы и методы
Проведённое исследование явилось многоцентровым и одобрено локальным независимым этическим комитетом ФГБОУ ВО «Ростовский государственный медицинский университет» Минздрава России и ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии» Минздрава России.
Всего в исследование были включены 57 больных в возрасте 30-75 лет обоего пола. В зависимости от распространённости, локализации и генеза деструкции костной ткани выделяли три группы боль-
ных: группа 1 — 20 пациентов с язвенным колитом и стероидным остеопорозом вследствие терапии глюкокортикоидами; группа 2 — 22 пациента, у которых диагностирован рак слизистой оболочки дна полости рта с эрозией кортикальной кости либо зубной лунки первичной опухолью; группа 3 — 15 пациентов со среднетяжёлым дентальным периимплантитом.
15 человек представляли собой практически здоровых лиц, которые вошли в группу контроля.
Критерии включения пациентов в группу 1: верифицированный язвенный колит (ЯК) с длительностью заболевания не менее года и наличием не менее двух рецидивов в анамнезе; левосторонний и тотальный ЯК, средняя степень активности, показания для системного введения глюкокортикоидов (отсутствие эффекта от 5-аминосалициловой кислоты через 2 недели применения), информированное согласие пациента.
Критерии включения пациентов в группу 2: рак слизистой оболочки дна полости рта с эрозией кортикальной кости либо зубной лунки первичной опухолью; возраст больных до 75 лет включительно; отсутствие до момента исследования специализированного лечения онкологического заболевания. В группу 2, согласно классификации стадий развития злокачественных опухолей TNM (8-е издание), включали больных с умеренно местно-распространённым раком Т4аШ-2M0. Наличие только поверхностных эрозий кости/зубной лунки первичной опухолью десны было недостаточно для её классифицирования как стадии Т4Ь. Согласно критериям гистопатологической дифференци-ровки, у 15 (68%) пациентов наблюдалась низкая и у 7 (32%) — средняя степень диф-ференцировки опухолевых клеток.
Критерии включения пациентов в группу 3: дентальный периимплантит; возраст больных 30-75 лет, локализация — нижняя челюсть.
Критерии исключения: тяжёлая общесоматическая патология — ВИЧ, СПИД, сопутствующая патология с декомпенсацией дыхательной, сердечно-сосудистой и моче-выделительной систем, системный приём стероидных или нестероидных противовоспалительных препаратов.
Группа контроля из 15-ти практически здоровых лиц (8 мужчин и 7 женщин) без воспалительных заболеваний пародон-та в возрасте 40-60 лет была сформирована для определения контрольных значений биохимических маркеров.
Средний возраст пациентов группы 1 составлял 45,8±2,24 года (медиана — 46 лет), группы 2 — 53,2±2,5 года (медиана — 51 год), группы 3 — 55,7±2,3 года (медиана — 56 лет). В группу 1 вошли 14 (70%) женщин и 6 (30%) мужчин. В группу 2 — 15 мужчин (68%) и 7 (32%) женщин. В группе 3 состояли 7 (78%) мужчин и 2 (22%) женщины.
Лабораторную часть исследования проводили с привлечением иммунофермент-ного и биохимического анализа. В качестве исследуемого материала использовали десневую жидкость или экссудат периим-плантационных карманов. Сбор жидкости осуществляли при помощи пинцета стерильным бумажным эндодонтическим штифтом размером № 25, помещая его в карман или зубодесневую борозду не менее чем на 10 секунд на максимальную глубину. Объём экссудата определяли по разнице весов бумажного штифта до и после сорбции экссудата.
Содержание катепсина К (КК) в десневой жидкости определяли с помощью набора реактивов Cathepsin K (CTSK) (Human) ELISA Kit («Cloud-Clone Corp.», США). Для определения концентрации тартрат-ре-зистентной кислой фосфатазы использовали набор реактивов Bone TRAP (TRAP5b) Assay (Immunodiagnostic Systems, «IDS», Англия). TRACP 5b представлял собой активный фермент, выделяющийся из осте-
окластов. Для проведения иммунофер-ментного анализа использовали фотометр Multiscan-Р 2 («Thermo Fisher Scientific Inc.», Финляндия) при длине волны 450 нм. Определение активности костной фракции щелочной фосфатазы (ЩФ) проводили кинетическим методом. Активность ЩФ в биологической жидкости определялась путём измерения скорости гидролиза эфира фосфорной кислоты — n-нитрофенилфос-фата с получением n-нитрофенола и фосфорной кислоты. Скорость гидролиза субстрата прямо пропорциональна активности фермента.
Статистический анализ результатов исследования проводился с помощью программы Statistica 12.0 («StatSoft Inc.», США) и применением теста на нормальность с использованием критерия Шапиро — Уилка, описательной статистики, дисперсионного анализа.
Результаты и их обсуждение
У пациентов контрольной группы в десневой жидкости концентрация КК составила 1,71±0,34 пмоль/л (медиана — 1,8 пмоль/л), тартрат-резистентной кислой фосфатазы (ТРКФ) — 3,7±0,5 Ед/л (медиана — 3,64 Ед/л), активность ЩФ была 4,2±0,6 мкмоль/л (медиана — 4,11 мкмоль/л). Полученные значения использовали в качестве контрольных.
У пациентов об активности остеорезорб-ции альвеолярных отростков челюстей судили по концентрации в десневой жидкости лизосомального фермента КК и фермента шероховатого эндоплазматического рети-кулума ТРКФ, которые высвобождаются при активации остеокластов в костные лакуны и участвуют в резорбции кости [7-9].
В группе 1 при формировании стероидной зависимости выявлены повышенные концентрации КК в десневой жидкости (4,1±0,5 пмоль/л). Концентрация остальных изучаемых остеомаркеров не отличалась от контрольных величин.
В группе 2 было установлено многократное превышение концентрации КК в десне-вой жидкости при раке слизистой оболочки дна полости рта с распространением на альвеолярный отросток (11,4±0,6 пмоль/л). Содержание КК в десневой жидкости в группе 2 по сравнению с контрольной группой было выше в 6,6 раза (р<0,001).
В группе 3 в экссудате периимплан-тационной борозды содержание КК (4,7±0,4 пмоль/л) возрастало по сравнению с контролем в 2,5 раза (р<0,001) (табл.).
В группах 2 и 3 относительно похожее различие было установлено и для концентрации ТРКФ в десневой жидкости. В группе 2 в десневой жидкости кратность превышения маркера остеорезорбции составила 3,2 раза (11,7±0,7 Ед/л), а в группе 3 в экссудате периимплантационной борозды концентрация ТРКФ (5,9±0,7 Ед/л) была выше в 1,6 раза ф<0,05) относительно контрольного значения (3,7±0,5 Ед/л).
Таким образом, определение маркеров остеорезорбции КК и ТРКФ в десневой жидкости позволило дать оценку изменения костного метаболизма при системной и местной остеодеструкции различного генеза. В исследовании было установ-
лено, что при системном остеопорозе в десневой жидкости из остеомаркеров статистически значимо повышалась концентрация только КК. КК и ТРКФ в значительной мере накапливались в десневой жидкости при опухолевой остеодеструк-ции. При воспалительно-деструктивных процессах у пациентов с периимпланти-том маркеры остеорезорбции накапливались локально (в периимплантационной области), прирост накопления не превышал трёхкратного повышения по сравнению с контрольными значениями.
Стадия резорбции костной ткани в норме находится в паритете с процессами косте-образования, осуществляемыми остеобластами [10]. Механизмы дифференцировки остеобластов изучены недостаточно [6]. Однако известно, что молодые клетки синтезируют главным образом костную ЩФ, в то время как зрелые клетки синтезируют остеокальцин и осуществляют процессы кальцификации, превращаясь в остеоци-ты [5]. В содержимом десневой жидкости в группах 1 и 3 активность ЩФ по сравнению с контролем не изменялась, а в группе 2 была в 3,6 раза ф<0,05) выше (табл.). Таким образом, в группе 2 наблюдалось
Таблица. Значения концентрации остеомаркеров в десневой жидкости в клинических группах Table. Concentration of osteomarkers in the gingival fluid in the research groups
Показатель Величина Группа 1 (n=20) Группа 2 (n=22) Группа 3 (n=15) Контрольная группа(n=15) р
M±m 4,1±0,5 11,4±0,6 4,7±0,4 1,71±0,34 Р1-к 2-к
КК, пмоль/л Me 4,3 11,8 4,5 1,8 3-к<0,001
[25; 75] 3,7; 4,8 6,7; 14,3 3,8; 5,4 1,3; 2,4 рмн<0,001
M±m 4,0±0,3 11,7±0,7 5,9±0,7 3,7±0,5 р1-к>0,05
ТРКФ, Ед/л Me 3,9 11,6 5,6 3,64 р2к<0,001 Р31=0,03 р <0,001
[25; 75] 3,5; 4,6 8,6; 14,4 4,3; 6,7 3,1; 4,4
ЩФ, мкмоль/л M±m 4,8±0,6 14,3±0,5 5,6±0,8 4,2±0,6 Р1-к,3-к>0,05 р2-к<0,001
Me 4,7 14,7 9,5 4,11
[25; 75] 3,9; 5,3 10,3; 18,5 7,8; 11,4 3,8; 4,7 рмн>0,05
Примечание: Me — медиана, [25; 75] — межквартильный диапазон, при дисперсионном анализе использовали критерий Краскела — Уоллиса и Манна — Уитни, поправочный коэффициент на число сравниваемых пар Бон-феррони, р — доверительная вероятность сравнения всех групп.
Note: Me — median, [25;75] — interquartile range, analysis of variance using the Kruskal — Wallis and Mann — Whitney test, a correction factor for the number of compared Bonferroni pairs, р — the confidence level of comparison between the groups.
умеренное усиление продукции активированными остеобластами ЩФ.
Итак, биохимические маркеры являются чувствительными индикаторами остеоремо-делирования костной ткани как при системных, так и при локальных деструктивных процессах, при периимплантите и первичном опухолевом поражении челюстей. Оценка маркеров костного метаболизма в биологических жидкостях может использоваться как при диагностике, так и в последующем, при лечении остеомодифицирую-щими лекарственными средствами.
Выводы
1. Для контроля стероидного осте-опороза у больных язвенным колитом
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ | REFERENCES
1. Гончаров И.Ю., Ломакин М.В., Козлова М.В., Гончаров Ю.И. Особенности архитектоники подбородочного отдела нижней челюсти и применение методов лучевой диагностики для их объективизации. Российский вестник дентальной имплантологии. 2013;1(27):14-22. [Goncharov I.Yu., Lomakin M.V., Kozlova M.V., Goncharov Yu.I. Osobennosti arkhitektoniki pod-borodochnogo otdela nizhney chelyusti i primenenie metodov luchevoy diagnostiki dlya ikh ob"ektivizatsii [Features of the architectonics of the chin of the lower jaw and the use of methods of radiation diagnostics for their objectivity]. Rossijskij vestnik dental'noj im-plantologii [Russian Bulletin of Dental Implantology]. 2013;1(27):14-22. (In Russian)].
2. Зорина О.А., Амхадова М.А., Хамукова А.А., Алескеров Э.Ш., Айрапетов Г.А., Демидова А.А. Особенности остеоиммунологических аспектов остеорезорбции при периимплантите, хроническом пародонтите и раке альвеолярного отростка и альвеолярной части челюстей. Стоматология. 2020;99(4):27-32. [Zorina O.A., Amhadova M.A., Hamukova A.A., Aleskerov E.Sh., Ajrapetov G.A., Demidova A.A. Osobennosti osteoimmunologicheski-kh aspektov osteorezorbtsii pri periimplantite, khron-icheskom parodontite i rake al'veolyarnogo otrostka i al'veolyarnoy chasti chelyustey [Osteoimmunological aspects of periodontal inflammatory destructive changes at periimplantitis, chronic periodontitis and oncological diseases of the oral cavity]. Stomatology. 2020;99(4):27-32. (In Russian)]. DOI: 10.17116/ stomat20209904127.
при системном применении глюкокортико-идов необходимо исследовать активность катепсина К иммуноферментным методом в десневой жидкости.
2. При раке слизистой оболочки дна полости рта десятикратный прирост концентрации катепсина К и тартрат-резистентной кислой фосфатазы, трёхкратный прирост активности костной фракции щелочной фосфатазы в десневой жидкости сопряжён с распространением опухолевого процесса на костную ткань.
3. При периимплантите для контроля выраженности остеорезорбции в периимплан-тационной области в экссудате рекомендуется определять концентрацию катепсина К и тартрат-резистентной кислой фосфатазы.
3. Любимова Н.В., Кушлинский Н.Е. Биохимические маркеры метастазирования в кости. Успехи молекулярной онкологии. 2015;1(2):61-75. [Lyubi-mova N.V., Kushlinskij N.E. Biokhimicheskie markery metastazirovaniya v kosti [Biochemical markers of bone metastasis]. Uspekhi molekulyar-noj onkologii [Advances in molecular oncology]. 2015;1(2):61-75. (In Russian)]. DOI: 10.17650/2313-805X.2015.2.1.061-075.
4. Цориев Т.Т., Белая Ж.Е., Рожинская Л.Я., Мельниченко Г.А., Ильин А.В., Никанкина Л.В., Дедов И.И. Новые биомаркеры регуляции костного ремоделирования при акромегалии и эндогенном гиперкортицизме. Ожирение и метаболизм. 2018;15(3):33-41. [Tsoriev T.T., Belaya Z.E., Rozhinskaya L.Ya., Mel'nichenko G.A., Ilyin A.V., Nikankina L.V., Dedov I.I. Novye biomarkery reguly-atsii kostnogo remodelirovaniya pri akromegalii i en-dogennom giperkortitsizme [New biomarkers of bone remodelling regulation in patients with acromegaly and endogenous hypercortisolism]. Ozhirenie i metabolism [Obesity and Metabolism]. 2018;15(3):33-41. (In Russian)]. DOI: 10.14341/OMET9447.
5. Bessueille L., Mebarek S., Briolay A., Gleizes M. Tissue-nonspecific alkaline phosphatase is an antiinflammatory nucleotidase. Bone. 2020;133:115262. DOI: 10.1016/j.bone.2020.115262.
6. Bishop N. Bone material properties in osteogenesis imperfecta. J. Bone Miner Res. 2016;31(4):699-708. DOI: 10.1002/jbmr.2835.
7. Dai R., Wu Z., Chu H.Y., Lu J., Lyu A., Liu J., Zhang G. Cathepsin K: The action in and beyond bone.
Front. Cell Dev. Biol. 2020;8:433. DOI: 10.3389/ fcell.2020.00433.
8. Drake M.T., Clarke B.L., Oursler M.J., Khosla S. Cathepsin K inhibitors for osteoporosis: Biology, potential clinical utility, and lessons learned. Endocr. Rev. 2017:38;325-350. DOI: 10.1210/er.2015-1114.
9. Hu Y., Yu J., Wang Q., Zhang L., Chen X., Cao Y., Zhao J., Xu Y. Tartrate-resistant acid phospha-
tase 5/ACP5 interacts with p53 to control the expression of SMAD3 in lung adenocarcinoma. Molecular Therapy: Oncolytics. 2020:16;272-288. DOI: 10.1016/j.omto.2020.01.010. 10. Takito J., Inoue S., Nakamura M. The sealing zone in osteoclasts: A self-organized structure on the bone. Int. J. Mol. Sci. 2018;19:984. DOI: 10.3390/ ijms19040984.
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ | INFORMATION ABOUT THE AUTHORS
Сафроненко Андрей Владимирович, д.м.н., доц., ФГБОУ ВО «Ростовский государственный медицинский университет» Минздрава России; e-mail: andrejsaf@mail.ru Косенко Владислав Анатольевич, ФГБОУ ВО «Ростовский государственный медицинский университет» Минздрава России; e-mail: kosenkovla@rambler.ru Айрапетов Григорий Арамович,
ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии» Минздрава России; e-mail: stomat@mail.ru
Демидов Игорь Анатольевич*, к.м.н., ФГБОУ ВО «Ростовский государственный медицинский университет» Минздрава России; e-mail: demidova-66@yandex.ru Нажева Марина Ибрагимовна, к.м.н., доц., ФГБОУ ВО «Ростовский государственный медицинский университет» Минздрава России; e-mail: nazheva@mail.ru Поляков Валерий Михайлович, ФГБОУ ВО «Ростовский государственный медицинский университет» Минздрава России; e-mail: polyakovvalm@rambler.ru
Andrey V. Safronenko, Cand. Sci. (Med.), Assoc. Prof., Rostov State Medical University of the Ministry of Health Care of Russia; e-mail: andrejsaf@mail.ru Vladislav A. Kosenko, Rostov State Medical University of the Ministry of Health Care of Russia; e-mail: kosenkovla@rambler. ru
Grigory A. Airapetov, National Medical Research Center of Oncology of the Ministry of Health Care of Russia;
e-mail: stomat@mail.ru
Igor A. Demidov*, Cand. Sci. (Med.), Rostov State Medical University of the Ministry of Health Care of Russia;
e-mail: demidova-66@yandex.ru
Marina I Nazheva, Cand. Sci. (Med.), Assoc. Prof.,
Rostov State Medical University of the Ministry
of Health Care of Russia;
e-mail: nazheva@mail.ru
Valery M. Polyakov, Rostov State Medical
University of the Ministry of Health Care of Russia;
e-mail: polyakovvalm@rambler. ru
* Автор, ответственный за переписку / Corresponding author
