CC BY
36УДК 575.112:004. 612.015
Е.А. Бородин, П.Е. Бородин
БИОИНФОРМАТИКА КАК МЕТОД СИСТЕМНОГО АНАЛИЗА В БИОЛОГИИ И МЕДИЦИНЕ. БИОИНФОРМАТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ СЕРПИНОВ РАСТЕНИЙ - ОСНОВЫ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ ДЛЯ КОРРЕКЦИИ НАРУШЕНИЙ ГЕМОСТАЗА И ФИБРИНОЛИЗА
Раскрывается сущность биоинформатики как метода системного анализа в биологии и медицине. Обосновывается возможность использования методов биоинформатики для создания на основе растительных ингибиторов протеаз-серпинов лекарственного препарата, предназначенного для регуляции процессов гемостаза и фибринолиза.
Ключевые слова: биоинформатика, серпины, гемостаз, фибринолиз.
BIOINFORMATICS AS A METHOD OF SYSTEM ANALYSIS IN BIOLOGY AND MEDICINE. BIOINFORMATIC ANALYSIS OF PLANT SERPINS AS A GROUND FOR THE DEVELOPMENT OF THE DRUGS DESIGNED FOR THE REGULATION OF
HEMOSTASIS AND FIBRINOLYSIS
Bioinformatics (the essence) is a method of system analysis in biology and medicine. The possibility of exploiting of bioinformatic methods for the development of plant serpins is based on a protease inhibitor drug designed for the regulation of hemostasis and fibrinolysisis (which are presented).
Key words: bioinformatics, serpins, hemostasis, fibrinolysis.
В 1970 г. Paulien Hogeweg впервые использовала термин «биоинформатика» применительно к изучению информационных процессов в биотических системах [1]. Современная биоинформатика является составной частью триады новых биологических наук, включающей геномику, протеомику и биоинформатику [2].Своим возникновением эти науки обязаны международному научному проекту «Геном человека» (1989-2002 гг.), позволившему установить последовательность 3,2 109 пар нуклео-тидов в молекуле ДНК Homo sapience. Биоинформатика основана на использовании персональных компьютеров для хранения и обработки информации, полученной в ходе секвенирования геномов живых организмов. Основным предметом биоинформатики являются нуклеиновые кислоты и белки как соединения, хранящие и реализующие генетическую информацию. Типичные задачи биоинформатики включают хранение информации о первичной структуре генов (т.е. нуклеиновых кислот) и белков; глобальное и локальное выравнивание последовательностей генов и белков, а также поиск их гомологов, прогнозирование 3D-структуры и функций белков на основе их первичной структуры; моделирование белок-белковых и белок-лигандных взаимодействий (docking algorithms); высокоточный анализ изображений; вычислительную эволюционную биологию и компьютерный дизайн лекарств.
Нами предпринята попытка использовать биоинформатический анализ растительных ингибиторов протеаз для оценки возможности создания на основе этих белков новых лекарственных средств с целью коррекции нарушений гемостаза и фибринолиза.
Гемостаз (свертывание крови) и фибринолиз (растворение кровяного сгустка) представляют каскады протеолитических ферментативных реакций, поддерживающих надлежащий ток крови в кровеносном русле. Нарушение тонкого баланса между этими процессами может привести к внутрисосу-дистому свертыванию крови (тромбозу) или к аномальным кровотечениям. В регуляции гемостаза и фибринолиза важнейшая роль принадлежит серпинам - ингибиторам сериновых протеаз, найденных во всех формах жизни (археи, бактерии и эукариоты). Большинство серпинов являются необратимыми ингибиторами сериновых протеиназ семейства химотрипсина, включающих белковые факторы свертывания крови (тромбин, факторы Ха и VIIa и др.) и растворения тромба (альфа-антиплазмин, антитромбин и др.) [3].
С учетом важной роли серпинов в регуляции биологических процессов целесообразно использовать их в качестве лекарственных средств. Тем не менее к настоящему времени только два серпина животного происхождения нашли применение в качестве зарегистрированных лекарственных форм - антитромбин III и апротинин, выпускаемый с различными торговыми названиями (трази-лол, гордокс, контрикал и др.). Детальное исследование серпинов представляет императиву для создания совершенных лекарств, способных поддерживать баланс между свертывающей, противосвер-тывающей и фибринолитической системами крови. Серпины растений могут выступить кандидатами на эту роль [4].Традиционный подход при оценке способности серпина ингибировать ту или иную протеазу состоит в кинетическом анализе реакции, катализируемой протеазой в присутствии серпина, либо в выявлении серпин-протеиназных комплексов с помощью электрофореза в SDS-геле [5]. Альтернативный подход заключается в использовании биоинформатики, позволяющей сделать аналогичный выводы на основе выравнивания первичных и 3D-структур белков. В настоящем исследовании предпринята попытка сравнительной биоинформатической характеристики растительных серпи-нов с серпинами, вовлеченными в гемостаз и фибринолиз, с целью выявить в их строении общие и специфические черты.
Мы использовали базы данных UniProt http://www.uniprot.org и NCBI Protein http://www.ncbi. nlm.nih.gov/protein для нахождения первичных структур, характерных особенностей строения, активных центров, функциональной активности, а также для выполнения множественного и глобального попарного выравнивания первичных структур ингибиторов протеаз. Локальное выравнивание последовательностей серпинов осуществляли на сервере EMBL-EBI по алгоритму EMBOSS Water (PROTEIN) http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss water. 3-D структуры серпинов находили в RCSB PDB http://www.rcsb.org/ и осуществляли их выравнивание с использованием опции Analyze Option Sequence and Structure Alignment (Java-утилита RCSB PDB Protein Comparison Tool в оффлайн-режиме).
Суперсемейство серпинов на филогенетической основе разбито на 16 кладов, имеющих определенные структурно-функциональные различия [6]. Из 7 выбранных нами для исследования ингибиторов протеаз человека, участвующих в процессах гемостаза и фибринолиза, 5 относятся к серпинам: антитромбин III (serpinCl), протеин Z-зависимый ингибитор протеаз (serpinA10), ингибитор а1-антитрипсиш (serpinAl), плазменный ингибитор протеазыС1 (serpinG1),a2-антиплазмин (serpinF2). Буквы A - F означают клады, а цифры - индивидуальный номер серпина в кладе. Ингибиторы пути тканевого фактора 1 и 2относят к кунинам - белкам, гомологичным панкреатическому ингибитору трипсина - апротинину. Ингибиторы протеаз растений классифицируются в соответствии с базой данных MEROPS(8). Для сравнения с названными выше серпинами человека мы выбрали 7 растительных ингибиторов протеаз: серпин-1 резуховидки Таля (Arabidopsis Thailana) (serpin1),трипсин -ингибитор А соевых бобов (Glycine max) (L3a), трипсин/фактор XIIA - ингибитор кукурузы сахарной (Zea Mays) (L6), трипсин - ингибитор 1 горькой тыквы (Momordica charantia) (L7) ингибитор 1 цис-теиновых протеиназ японского риса (Oryza sativa subsp. Japonica) (L25b), субтилизин-химотрипсин -ингибитор WSCI пшеницы мягкой (Triticum aestivum) (L13) и ингибитор трипсинатипа Боумана-
Бирка соевых бобов (Glycine max) (L12). Сведения об идентификационных номерах (ID) в базе UNI-PROT, принадлежности к определенным кладам и длине аминокислотных (АМК) цепей выбранных ингибиторов протеаз - в табл. 1.
Таблица 1
Ингибиторы гемостаза и фибринолиза человека и растительные ингибиторы протеаз, выбранные для сравнительного исследования
Ингибитор UNIPROT ID Клад */семейство * * Длина цепи (кол-во АМК)
Ингибиторы протеаз гемостаза и фибринолиза человека
Антитромбин III P01008 serpinC 1 464
Протеин 7-зависимый ингибитор протеаз Q9UK55 serpinA10 444
а!-антитрипсин P01009 serpinA1 418
Плазменный ингибитор протеазы С1 P05155 serpinG1 500
а2-антиплазмин P08697 serpinF2 491
Ингибитор пути тканевого фактора 1 P10646 304
Ингибитор пути тканевого фактора 2 P48307 235
Растительные ингибиторы протеаз
Серпин-1 резуховидки Таля (Arabidopsis Thailana) Q9S7T8 I04.087 391
Трипсини нгибитор А соевых бобов (Glycine max) P01070 I03.001 216
Трипсин/фактор XIIA - ингибитор кукурузы сахарной (Zea Mays) P01088 I06.001 155
Трипсин ингибитор 1 горькой тыквы (Momordica charantia) P10294 I07.001 30
Ингибитор 1 цистеиновых протеиназ японского риса (Ory-zasativasubsp. Japonica)** P09229 I25.028 140
Субтилизин-химотрипсин ингибитор WSCI - пшеницы мягкой (Triticum aestivum) P82977 I13.012 84
Ингибитор трипсина типа Боумана-Бирка соевых бобов (Glycinemax) P01055 I12.001 110
*- классификация по кладам; ** - MEROPSID.
Обращает на себя внимание различная длина АМК-цепей серпинов человека и растительных ингибиторов протеаз. Первые обычно содержат от 400 до 500 остатков АМК, а - вторые 100-200 [7]. Среди выбранных нами серпинов человека длина цепи варьировала в пределах 418-500, а у растительных ингибиторов протеаз - от 30 до 391 (табл. 1). У ингибиторов тканевого пути свертывания 1 и 2, относящихся к семейству кунинов, длина цепи была заметно меньше - 304 и 235 остатков АМК.
Наибольшее сходство последовательностей с серпинами гемостаза выявляет серпин-1 резухо-видки Таля Q9S7T8. Степень его идентичности по отношению к отдельным представителям последних варьирует в пределах 9-24 (табл. 2). Несколько меньшую идентичность демонстрируют трипсин ингибитор А соевых бобов Р01070 и трипсин/фактор Х11А - ингибитор кукурузы сахарной Р01088. Гомология последовательностей остальных растительных ингибиторов протеаз с серпинами гемостаза в целом существенно меньше, но с отдельными представителями достаточно высока. Например, идентичность первичных структур ингибитора трипсина типа Боумана-Бирка соевых бобов Р01055с ингибитором тканевого пути 2 Р48307 составляет 9,79. Если сопоставить результаты глобального попарного выравнивания последовательностей животных и растительных ингибиторов протеаз (табл. 2) с длиной их АМК-цепей (табл. 1), то нетрудно заключить, что степень идентичности тем выше, чем ближе длина сопоставляемых последовательностей. Именно этим обстоятельством можно объяснить наибольшую идентичность серпинам гемостаза серпина-1 резуховидки Таля Q9S7T8 (391 АМК) и наименьшую - трипсин ингибитора 1 горькой тыквы Р10294 (30АМК).
Таблица 2
Результаты попарного выравнивания АМК последовательностей животных и растительных ингибиторов протеаз (идентичность в %)
Ингибитор протеаз Антитромбин III P01008 а^антитрип-син P01009 Плазменный ингибитор протеазы С1 P05155 а2-антиплаз-мин P08697 Протеин Z-зависимый ингибитор протеаз Q9UK55 Ингибитор тканевого пути 1 P10646 Ингибитор тканевого пути 2 P48307
Серпин-1 резу-ховидки Таля 0987Т8 23,78 22,37 16,04 17,59 20,69 13,01 9,11
Трипсин-ингибитор А соевых бобов Р01070 7,83 9,37 9,52 6,96 3,14 10,72 11,82
Трипсин/фактор Х11А-ингибитор кукурузы сахарной Р01088 7,07 9,15 7,18 7,07 7,83 10,09 13,00
Трипсин-ингибитор 1 горькой тыквы Р10294 1,72 0,69 1,2 1,63 1,80 3,94 3,74
Ингибитор 1 цистеиновых протеиназ японского риса Р09229 5,77 6,68 4,64 7,07 8,24 9,90 8,06
Субтилизин-химотрипсин -ингибитор №8С1 - пшеницы мягкой Р82977 3,88 3,83 3,6 3,67 3,15 5,73 5,74
Ингибитор трипсина типа Боумана-Бирка соевых бобов Р01055 3,98 4,84 5,2 5,38 3,15 5,14 9,79
Результаты глобального выравнивания не в полной мере отражают сходства в функциональной активности сравниваемых белков, поскольку последняя может определяться не всей АМК цепью, а отдельными доменами. Так, идентичность последовательностей ингибитора трипсина типа Боума-на-Бирка соевых бобов и антитромбина III составляет всего 3,97 (рис. 1), что не удивительно, если учесть различную длину полипептидных цепей этих белков - 110 и 464 АМК соответственно. Если же осуществить локальное выравнивание участков цепей ингибитора трипсина типа Боумана-Бирка с 5 по 45 АМК и антитромбина III с 15по 69 АМК, то идентичность составит 20 (рис. 2).
Аналогичный вывод можно сделать на основании результатов структурного выравнивания этих ингибиторов (рис. 3), свидетельствующих, что при практическом отсутствии сходства 3Б-струк-тур белков в целом (идентичность 0, схожесть 7,84) отдельные домены этих белков весьма схожи.
Сравнительный биоинформатический анализ растительных серпинов с серпинами, вовлеченными в гемостаз и фибринолиз, свидетельствует, что, несмотря на различия в их первичных и третичных структурах, между ними имеются определенные черты сходства. Для 3Б-структуры серпинов характерно наличие консервативного домена из 9 а-спиралей (А-I) и трех ß-структур (A-C). Главный участок ß-структуры содержит петлю в активном центре белка (reactive center loop), образованную 20
АМК, расположенную между Р17 АМК от Оконца цепи и Р3' АМК от С-конца (рис. 4). Поэтому существует реальная возможность создания новых лекарственных средств, предназначенных для коррекции нарушений гемостаза и фибринолиза на основе растительных ингибиторов протеаз.
Таблица 3
Результаты попарного выравнивания АМК последовательностей и ЗБ-структур антитромбина III и растительных ингибиторов протеаз (идентичность в % )
Антитромбин III Р01008
Растительный ингибитор Выравнивание АМК последовательностей Структурное выравнивание
Серпин-1резуховидкиТаля Q9S7T8 23,78 25,1
Трипсин - ингибитор А соевых бобов Р01070 7,83 3,0
Трипсин/фактор ХПА - ингибитор кукурузы сахарной Р01088 7,07 3,3
Трипсин ингибитор 1 горькой тыквы Р10294 1,72 *
Ингибитор 1 цистеиновых протеиназ японского риса Р09229 5,77 *
Alignment_
*sf How to print an alignment in color
P0100S ANI3JiUMAtT 1 --------MY5NVIEr^;-E®KVYIi5^Li;-FWDm'C:-:e5P---VEICi:-.:-rPRDIPM 49
P01055 IBB1 SO YBN 1 MVVLKVOLVDLFL'VMGllS.-ITLRLSKL}ÜKH5DHSHSNDDEBSKPCCDQCA"TK3H------57
: ::+ ,++. : : : +,++: . : . , + + *: , , :
P0100S ANI3 HUMAN 50 NEMCIYR^P~KKAIEDEGSEQKIFTAII1RR7WELSKAN=RE----AIIFX£HLAiSranjN 105
P01055 IBBl_SOYBN 5S PPQCRCSIMRLNS---------CHrSCKSCIO^YPA^CFCVDIIDFCTEPCKPSEDDK 10a
+ + - ■ _ * . + ; + ; * ; ; * ;
Р0100Й ANI3_EiUliAtJ 106 INIFLS FLSISI AFAlilKLSACNDILQQLMEVFKFDIIS E KT SDQIHFFFAKLNCRLYRK 165
P01055 IBB1 SOYBN 109 IN--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------110
; *
P01008 ANI3 166 AW КЗ 5 KLVSANRLFaDKS LI FNE IYQDIS E LVYGAKLCFLUFKENAE £SRAAINKWSNEf 225
P01055 IBBl_SOYBN 111 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------110
P01ÜÜS ANI3_fiUiaN 226 IE SRI I DVT FS EAINELTVLVLVNI IYFKGLWKS KF5 PENIRKELFYKADGES CSASMMY 2S5
P01055 IBB1_5ОYBN 111 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------110
P01008 ANI3_HUKAN 2S6 QEGKFRYiEV7^SI2VXELFFKSDDIlMVLILFKFEKSLAKVTKELIFEVTj2ElibI)ELEE 345
P01055 IBB1_S О YBN 111 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------110
Р0100Й ANI3_EiUliAtJ 346 MMLWHMPRFRIE DGFS LKEQLQDMGLVDLFS FE KS KLPGIVAE GRDDLYV5 DAFHKAFL 405
P01055 IBB1_S О YBN 111 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------110
P01008 ANI3_BUiaN 406 EVSEEGSEAAASTKVVIAGRSLNPMEVTFKAKRPFLV1TIEEVPLUT11FMGEVÄliPCVK 464
P01Ü55 IBB1 SOYBN 111 ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------110
Субтилизин-химотрипсин - ингибитор WSCI -пшеницы мягкой Р82977 3,88 *
Ингибитор трипсина типа Боумана-Бирка соевых бобов Р01055 3,98 0
Рис. 1. Попарное глобальное выравнивание последовательностей ингибитора трипсина типа Боумана-Бирка соевых бобов и антитромбина III.
EMBOSS Water
protein alignment j Nucleotide: alignment i web services i Help & Documentation
T00I& > P^wi^e, Sequence..Alignment > EMBOSS Water
Results for job emboss water-120161130-103056-0924-33151886-oy
Submission Details
Alignment
üligned_aequences: 2 l: мгтз_нитаы
2: IBB1_SDYBN Matrix: EBLDSUM62 Sap_penalty: 10,0 Extend_penalty: 0.5
Length: 55 Identity: Similarity: Gaps:
Seere: 2S.5
11/55 <20.01) 21/55 <33.2%) 14/55 (25.5%)
ДНТЗ_НПМАЫ IBBl_SOraN АНТЗ (ШКЙН
15 KVYUjSLLLIGFHDCVTCHGS FVDICIfiKPRDI EMHEHCIYRS PEKKME
I I . I : . I . I : I.........I . : . : :.: I ..:.:. :
5 KVULVLLFLVGGI I SäHLRLS KL&L--------------LMK5 DHQHSND
1ВВ1_50™ 41 ЭЕЗЗК 45
Рис. 2. Локальное выравнивание участков цепей ингибитора трипсина типа Боумана-Бирка
(5-45 АМК) и антитромбина 111(15-69 АМК).
PROTEIN DATA BANK
I IMfWknJ.
Ал information Portal to 11&137 Bkoiogicai Macromotecuiar Structures
I Ш
Searcn Dy РОВ ID. autnor macroimMecuie. sequence or nganös ААотсеа Ssarcft I Browse oy Armoiations
Structure Alignment View
Pre-calculated JFATCATflexible results for 1 AN T.I vs. 1K9B.A .
This page provides a summary view of the protein structure alignment
Structure Alignment Results
Alignment Qu б rv: t огзлде/<загк grey )□ Subject; ( cyarVllght jrey)
ANTITHROMBIN 80WMAN-BIRK TYPE PROTEINASE
INHIBITOR
3.61e-01 PCB ID tAHT рщю жвв
47 35 '^NfiSb- с nan id I A Chain 10 A
3 02 - 4P Lengih 402 Length S8
OJJ'i 84. 57%
EC number EC number
К
Alignment Block(s) Alignment with Sequence Conservation
Align lANT.I.pdb 462 with lWB.A.pdb 58
Twists 0 ini-len 24 ini-rmsd 2.4B opt-equ 33 opt-rrosd 3.02 chain-rmsd 2.43 Score 47.35 align-len 51 gaps 13 (3S.293S) P-value S.61e-01 Afp-num 6653 Identity 0,0056 Similarity 7.34S Block 0 afp 3 score 47.35 reisd 2.48 gap 21 (0.47S)
Рис. 3. Структурное выравнивание ингибитора трипсина типа Боумана-Бирка соевых бобов
и антитромбина III.
SerpinbS
SERPINB6
SERPINB8
SERPINB9
Serpinb2
SERPINB2
Serpinb12
SERPINB12
MENT
SerpinblQ
SERPiNBIO
Ovalbumin
Gene Y
Gene X
Serpinb5
SERP1NB5
rriaAAATAGIAML
rrf aaaatagiatf Iaaaatagvmvl Iaaaatiaaimmn Iaaaatav^ns
jTEAAAASSCFW,
Iaaaassasl
ÜGTTAAAATGATIV
Ingtqaaaatgav
.GAt--VIFVA LPLI--JVFIfl
L0sw--V|fna
Ivw.tav i i s HttJs v i ffiv L J!f IaaaatgvlvlS sjiгрЦ---vtf |I|I2I2vpT
SA|agv|AA^VS-
[Svps--i1fna
Рис. 4. Элементы 3Б-структуры серпинов (слева) и АМК последовательность консервативного
домена у С-конца цепи (справа).
1. Hesper, B., Hogeweg, P. Bioinformatica: eenwerkconcept // Kameleon. - 1970. - № 1 (6). - P. 28-29.
2. Арчаков, А.И. Биоинформатика, геномика и протеомика -науки о жизни XXI столетия // Вопросы медицинской биохимии. - 2000. - Т. 47, № 1. - С. 2-9.
3. Rau, J.C., Beaulieu, L.M., Huntington, J.A., Church, F.C. Serpins in thrombosis, hemostasis and fibrinolysis // J. Thromb Haemost. - 2007.- № 5 (Suppl. 1). - P. 102-15.
4. Borodin, Eugene A., Pamirsky, Igor E., Shtarberg, Mikhail A., Dorovskikh, Vladimir A., Korotkikh, Alexander V. Chie Tarumizu, Kiyoharu Takamatsu and Shigeru Yamamoto Effects of Soy Bean Trypsin Inhibitor on Hemostasis. // Soybean - A Review (ed. by Hany A. El-Shemy). - In-Tech, Croatia. - 2013. - P. 495-512.
5. Patston, P.A., Church, F.C. & Olson, S.T. Serpin-ligand interactions// Methods. - 2004. - № 32.- P. 93-109.
6. Irving, J.A., Pike, R.N., Lesk, A.M., Whisstock, J.C. Phylogeny of the serpin superfamily: implications of patterns of amino acid conservation for structure and function // Genome Res. - 2000. - № 10. - P. 1845-1864.
7. Law, R.H.P., Zhang Q.W., McGowan, S., Buckle, A.M., Silverman, G.A., Wong, W., Rosado, C.J., Langendorf, C.G., Pike, R.N., Bird, P.I., Whisstock, J.C. An overview of the serpin superfamily // Genome Biol. - 2006. -№ 7. - P. 216 (1-11).
