CC BY
14УДК 633.15.631.527 http://dx.doi.org/10.21498/2518-1017.3(32).2016.75972
Б101нформатичний анализ гена кукурудзи, що кодуе ензим розгалуження крохмалю SBEIIb
Г. I. Сл1'щук, Т. Ю. Жернаков, Н. Е. Волкова*
Селекцтйно-генетичний институт - Нац'ональний центр нааннезнавства та сортовивчення, вул. 0в1дюпольська дорога, 3, Одеса, 65036, *e-mail: natavotki@ukr.net
Мета. Досл1'дження пол1морф1зму гена ае1 кукурудзи б1о1нформатичними методами. Методи. Глобальне та локаль-не вир1внювання нуклеотидних та ам1'нокислотних постдовностей, in silico трансляц1я i транскрипц1я, моделювання транслялв, дизайн праймерiв, ф1логенетичний аналiз. Результати. Проаналiзовано 255 нуклеотидних постдовностей гена ае1 кукурудзи, 500 ам1'нокислотних посл1'довностей гомолоп'в транслят1'в гена ae1 кукурудзи (гомолоп'в ензиму SBEIIb) i 100 мРНК, що експресуються з гена ae1 кукурудзи, для встановлення його ф"логенетичних взаемозв'язк1'в. Б1'о1'нформатичними методами досл1'джено пол1'морф1'зм р1'зних д1'лянок гена ae1 кукурудзи. Зд1'йснено моделювання ензиму SBEIIb кукурудзи. Висновки. За результатами вир1'внювання ам1'нокислотних посл1'довностей гомолоп'в ензиму SBEIIb з'ясовано, що ортологи гена ae1 присутт лише в однодольних рослин, паралоги - в однодольних, дводольних та 1'нших таксот'в, включаючи водоросп та тварин. За результатами вирiвнювання мРНК рослин, з яких транслюеться ензим SBEIIb, встановлено як ортологи гена ae1 кукурудзи, так i найближчi паралоги, що кодують ензими розгалуження крохмалю з хлоропластною локалiзацieю; це св1дчить про можливе походження гена ae1 внаслiдок дуплп"кац1"1 гена, що кодуе 1,4-а-глюкан-ензим розгалуження крохмалю 2 з хлоропластною або ам1лопластною локалiзацieю. В структур" гена aе1 кукурудзи знайдено реп'они, що м1стять не визначен ранше пол1морфн1 д1лянки. До пол1морфних регiонiв розроблено дизайн праймер1в, як1 дають можлив1сть диференц1ювати л1н1Т кукурудзи. Визначено, що вста-новлений пол1морф1зм теоретично здатний впливати на функц'ю ензиму та внасл1док цього зм1нювати концентрац1ю ам1лопектину в зерн1 кукурудзи.
Ключов! слова: ген ае1, ензим розгалуження крохмалю SBEIIb, кукурудза, б^отнформатичт т'дходи.
Вступ
У б1осинтез1 крохмалю ензим його розгалуження (starch branching enzyme, SBE) (1,4-alpha-glucan 6-alpha-glucosyltransferase; EC 2.4.1.24) e одним з ключових, BiH формуе розгалужену структуру шляхом створення 1,6-зв'язшв розгалуження мiж лiнiйними ланцюгами. За результатами бiохiмiчних та генетичних досл1джень рослинних SBE ви-явлено три iзозимнi форми - SBEI, SBEII (двi високогомолоичш iзоформи SBEIIa та SBEIIb), SBEIII. Встановлено, що вони ма-ють субстратну специфiчнiсть. Так, SBEIIa i
Heorhii Slishchuk
http://orcid.org/0000-0003-4245-8557 Tymofii Zhernakov
http://orcid.org/ 0000-0001-9565-7715 Nataliia Volkova
http://orcid.org/0000-0002-9333-4872
SBEIIb ввддають перевагу розщепленню i трансферу коротших ланцюгiв i каталiзу-ють формування 1,6-глiкозидних зв'язкiв, у той час як SBEI ввддае перевагу трансферу довших ланцюгiв [1-3].
SBE кукурудзи мае три iзозимнi форми -SBEI, SBEIIa, SBEIIb, зокрема SBEI та SBEIIb наявш переважно в ендосперм^ тодi як SBEIIa - в зародку, ендосперм^ листку, шших тканинах. Саме SBEIIb в^аДграе важ-ливу роль у бiосинтезi молекул амiлопекти-ну в ендоспермi кукурудзи [4].
Ензим SBEIIb кодуеться геном amylose extender (ае1) (довге плече хромосоми 5), який експресуеться в ендоспермi з найви-щим рiвнем серед SBE-генiв i вiдiграe основ-ну роль у детермшаци структури ам1лопек-тину. Саме SBEIIb мае первмне значення для бюсинтезу молекул амiлопектину в ен-доспермi кукурудзи, а не SBEI i SBEIIa: втрата SBEIIa або нестача активносп SBEI
поодинщ не впливае (або мае незначний вплив) на склад крохмалю ендосперму та тонко! структури ам1лопектину. У кукуру-дзи з рецесивним алелем ael ензим SBEIIb в ендосперм1 мае низьку актившсть, що призводить до формування крохмалю з ви-щим вмятом амшози, 61льшою к1льк1стю пром1жних компоненив i довшим розгалу-женим ланцюгом амiлопектину, шж у нормально! кукурудзи з домшантним геном ае1. Вм1ст амiлози в ендоспермi пiдвищуeться з нормального середнього рiвня 27 до 50% (за деякими джерелами - до 70%) [5].
К1льк1сть i склад крохмалю мае важливе значення майже для вс1х напрямiв викорис-тання зерна кукурудзи - в1д традицiйного продовольчого до застосування як ввдновлю-вано! сировини для виробництва бюпалива. Для полiпшення якостi зерна кукурудзи активно використовують бiохiмiчний ефект мутантних генiв структури ендосперму, ям регулюють бiогенез крохмалю та зумовлю-ють iстотний перерозпод1л лшшних i роз-галужених сополiмерiв крохмалю. Оскшьки
и • U 1 1 • и и
найб1льший ефект на фракцшний склад крохмалю мають мутантнi гени wxl, ael, su2, бiоiнформатичнi та молекулярно-гене-тичш дослiдження генiв бiосинтезу крохмалю е необхiдним етапом розроблення моле-кулярних маркерiв для маркер-супутньо! селекци п1д час створення г16рид1в кукуру-дзи для промислового отримання високо-яксних крохмалiв.
Мета роботи - дослвдження пол1морф1з-му гена ае1 кукурудзи бiоiнформатичними методами для розроблення функщональних маркерiв, що будуть використаш в селек-ц1йних програмах для добору генотишв ку-курудзи з певною структурою крохмалю ен-досперму зерна.
Материали та методика досл1*джень
Hауково-дослiдну роботу виконано у в1дд1-л1 загально! та молекулярно! генетики СГ1 -НЦНС протягом 2015-2016 рр. Mатерiалом дослвджень були нуклеотиднi та амшокис-лотш посл1довност1 бази даних Нащонально-го центру бютехнолоично! шформаци (National Center for Biotechnology Information, NCBI) [6]. Використано 500 амшокислотних послвдовностей транслятiв гомолог1в гена ael кукурудзи, 100 мРНК - транскриптiв гомолоив гена ael кукурудзи, 255 нуклео-тидних послiдовностей гена ael кукурудзи (вс1 наявнi на той час у баз! даних NCBI).
Пошук нуклеотидних послвдовностей гена ael провадили локальним вирiвнюванням за алгоритмом Смгга-Вотермана [7] за допо-
могою он-лайн програми «blastn». Глобаль-не понуклеотидне та покодонне вир1внюван-ня нуклеотидних посл1довностей промотора, екзон1в та штрошв зд1йснювали за алгоритмом Нвдлмана-Вунша [8] з використанням програми MEGA5.2 за алгоритмом ClustalW та ClustalW (Codons).
Для in silico трансляци, транскрипц11 та пошуку м1кросател1т1в використовували програму UGENE [9]. Моделювали трансля-ти in silico з використанням автономного сервера гомолог1чного моделювання структури протешу SWISS-MODEL [10]. Дизайн праймер1в та in silico пол1меразну ланцюго-ву реакц1ю (ПЛР) зд1йснювали за допомо-гою програми FastPCR. Умови ПЛР оптим1-зували зг1дно з термодинам1чними характеристиками матриц! та праймер1в, обчисле-ними у програм1. В1рог1дн1сть !снування по-будованих структур обчислювали !з застосу-ванням статистично! суми для будування матриц! в!рог!дност! термодинам!чних характеристик системи. Точн!сть передбаче-них структур за допомогою ц!е! програми становить 73% для посл!довностей розм!ром до 700 п. н. [11].
Ф!логенетичний анал!з виконували з використанням пакету MEGA5.2 [12]. Ф!логене-тичн! дендрограми реконструювали за методом UPGMA, еволюц!йн! дистанц!! розрахо-вано з використанням методу Maximum Composite Likelihood, критер!ем достов!рност! був бутстреп тест [13]. Сп!вв!дношення сино-н!м!чних та несинон!м!чних зам!н анал!зува-ли за допомогою функц!!' тестування добору за окремими кодонами програми MEGA5.2.
Результати досл1'джень
Фшогенетичний anani3 гена ael кукурудзи
Проанал!зовано 500 ам!нокислотних по-сл!довностей гомолог!в транслят!в гена ael кукурудзи (гомолог!в ензиму SBEIIb) для встановлення його ф!логенетичних взаемо-зв'язк!в на р!вн! великих таксон!в та 100 мРНК, що експресуеться з гена ael кукурудзи, - на р!вн! низьких таксон!в.
За результатами вир!внювання 500 ам!но-кислотних посл!довностей гомолог!в ензиму SBEIIb з'ясовано, що ортологи гена ael е лише в однодольних рослин. Паралоги гена ael наявн! в однодольних ! дводольних та !нших таксон!в, включаючи водорост! та тварин. Паралогами цього гена у тварин е гени, що кодують ензими, як! катал!зують розгалуження гл!когену. Це п!дтверджуе в!-домий факт, що однодольн!, до яких в!дно-сять злаков!, мають в!дм!нност! у ембр!оге-нез! та функц!онуванн! ендосперму. Завдя-
14
СОРТОВИВЧЕННЯ ТА ОХОРОНА ПРАВ НЛ СОРТИ рослин, 2016, № 3 (32)
ки наявностГ ензимiв розгалуження крохма-лю утворюеться особливий за будовою амь лопектин, здатний до компактизаци у виг-ляд: неводорозчинних гранул з нашвкриста-лГчною структурою, яка е найефектившшою формою зберГгання вуглеводГв.
За результатами вирГвнювання 100 мРНК рослин, з яких транслюеться ензим SBEIIb, встановлено як ортологи гена ae1 кукурудзи, так i найближчГ паралоги, що кодують ензи-ми розгалуження крохмалю з хлоропласт-ною локалГзащею. Це свГдчить про можливе походження гена ae1 в результат: дуплшаци гена, що кодуе 1,4-а-глюкан-ензим розгалуження крохмалю 2 (1,4-alpha-glucan-bran-ching enzyme 2; EC 2.4.1.18) з хлоропласт-ною або амшопластною локалГзащею. Про-дукти експресГ! предкового гена мали хлоро-пластну та/або амшопластну локалГзащю. Продукти експресГ! гена ае1 мають локалГзащю в клГтинах ендосперму. ЙмовГрно, що саме ця дуплшащя та подальша передисло-кащя продукту цього гена й зумовили ево-люцшну усшшнГсть злакових. Для цього мали в1дбутися змши в первиннш структур: зазначеного гена - як в промоторнш дшянщ для регулювання експресГ! цього гена у зв'язку зГ змшою локалГзаци активностГ йо-го продукту (в ендоспермГ зерна, що розви-ваеться, замГсть хлоропластГв для синтезу ам1лопектинових гранул для ефектившшого запасання глюкози, утворено! внаслГдок фотосинтезу), так i для забезпечення коректно! взаемоди продуктГв цього гена з шшими ен-зимами, що каталГзують реакци бюсинтезу крохмалю. Також замГни вГдбулись i в кодую-чих дГлянках гена для отримання конформа-цГ! ензиму, ефективно! для забезпечення розгалуження амГлопектину.
Аналгз полгморфгзму гена ae1 кукурудзи
У базГ даних NCBI виявлено 255 нуклео-тидних послГдовностей, анотованих як ген ae1 кукурудзи. Зразки гена ae1 мають се-реднш розмГр 23449 п. н. та складаються з промотору, 22 екзонГв та 21 штрона.
255 нуклеотидних послГдовностей гена ae1 кукурудзи проаналГзовано з метою виявлен-ня паттершв еволюци. Для промоторно! дь лянки, представлено! 15 нуклеотидними по-слГдовностями, були характернГ однонуклео-тиднГ замши та делецГ! на фонГ значного рГвня консервативностГ.
РегГон екзонГв 1-3 був представлений 66 нуклеотидними послГдовностями. Тут також були наявн однонуклеотидн замГни та мно-жиннГ делецГ!. ВзагалГ рГвень полГморфГзму ще! дГлянки був невисокий, крГм Гнтрону 2. Щодо характеру еволюци цього гена, то для
нього був характерним стабГлГзуючий добГр, спрямований на збереження первГсно! амшо-кислотно! послГдовностГ ензиму. Про це свГд-чать негативш значення за HyPhy аналГзом - до -14, це означае, що превалюючими е си-нонГмГчнГ замГни. Можливо, цей регГон мае особливе значення для функщонування ензиму та е критичним, тому добГр був спрямований на елтшащю несинонГмГчних за-мГн, якГ призводять до замГни амшокислот, лише деякГ триплети показали позитивне значення, яке за абсолютним значенням не перевищувало негативш показники.
РегГон екзонв 4-8 представляли 17 нуклеотидних послГдовностей. РГвень його полГморфГзму був високий: наявш численш нуклеотидш замГни й делецГ!, а також мута-щя Гз зсувом рамки зчитування, яка е грубою нуклеотидною мутащею. Для цього ре-гГону був характерним диверсифшуючий добГр з превалюванням несинонГмГчних замш. Це, у поеднанш з наявнстю численних полГморфГзмГв, свГдчить про те, що, на вГд-мГну в1д регГону екзонв 1-3, вГн не вГдГграе тако! значно! ролГ i, навпаки, еволющя була спрямована на пошук альтернативних варь антГв та пГдвищення полГморфГзму.
РегГон екзошв 9-10, представлений 10 нуклеотидними послГдовностями, виявився кон-сервативним у зон екзонГв та високополь морфним у зонГ штрошв. Для цього регГону був характерним стабГлГзуючий добГр, для 11 сайтГв з 12 характерним е превалювання синонГмГчних замГн над несинонГмГчними. Цей регГон виявляеться досить цГкавим для подальшого дослГдження та пошуку можли-вих маркерГв.
РегГон екзона 11 був представлений 16 ви-сококонсервативними послГдовностями. Це означае, що добГр був спрямованим на ель мшащю майже всГх замГн, i свГдчить про важливГсть ще! дГлянки гена для функщонування протешу. РегГон екзонГв 12-14, представлений 81 нуклеотидною послГдов-шстю, показав аналоичн даш.
Для регГону екзонГв 16-18, представлено-му 34 нуклеотидними послГдовностями, характерним е високий рГвень полГморфГзму, встановлено численш однонуклеотидш замГни та делецГ!, якГ призводили до зсуву рамки зчитування.
РегГон екзонГв 19-22 був висококонсерва-тивним з наявними однонуклеотидними замшами по дешлькох сайтах.
З огляду на наведене, ймовГрним е те, що рГзш дГлянки ензиму SBEIIb мають рГзне значення для функщонування. Можна та-кож зробити висновок про те, що цей ген
зазнав д!! доместиф!кац!!, що проявилося у вигляд! даних, отриманих шд час анал!зу сшвввдношення синон!м!чних та несинон!-м!чних зам!н. Враховуючи його очевидну агроном!чну важлив!сть, це е ц!лком зрозу-м!лим.
До найб!льш пол!морфних д!лянок цього гена - !нтрон!в 2, 6 та 8 був розроблений дизайн праймер!в (див. табл.). Проведений in silico ПЛР-анал!з св!дчить, що розроблен! пари праймер!в дають можлив!сть детекту-вати пол!морф!зм у нуклеотидн!й посл!дов-ност! гена ael.
Таблиця
1нформац1'я щодо розроблених пар праймер1*в до гена ael кукурудзи
Репон гена Пара праймер1'в Розм1'р фрагмента амплпфшафТ, п. н.
назва посл1'довтсть (5' - 3') (прямого / зворотного)
1нтрон 2 Zty2 tcctgagggcgagaatgatg ctaaatqqtqqtacaqtaca 261, 264
1нтрон 6 Zty6 ttatttcttcttaatataat aaaaatttcccaaacaccaa 137, 138, 139
1нтрон 8 Zty8 aatggtcatcaatatgttat aaaatgatagccggaaaagg 221, 222, 223, 225
Моделювання ензиму SBEIIb кукурудзи
Для дослвдження впливу пол!морф!зму гена ael на функц!ональн!сть ензиму розга-луження крохмалю SBEIIb проведено in silico трансляцию проанал!зованих нуклеотидних послвдовностей. Отриман! in silico трансляти використано для гомолог!чного моделювання тривим!рно! структури ензиму SBEIIb кукурудзи з метою виявлення найперспективн!-ших з погляду впливу на функц!ювання протешу сайт!в. Прототипом для моделювання структури ензиму слугував аналог!чний ен-зим, що кодуеться геном у рецесивному стан!, який був структурно найближчим гомологом досл!джуваного ензиму серед структур, пред-ставлених у баз! даних Protein data bank (PDB). В результат! анал!зу даних виявлено зм!ну в конформац!!' протешу. За результатом моделювання знайдено сайт, який, мож-ливо, й зумовлюе р!зницю м!ж дом!нантними та рецесивними алелями гена ael кукурудзи.
Враховуючи те, що саме ген ael кодуе ен-зим розгалуження крохмалю SBEIIb, що бере участь у перетворюванн! ам!лози в ам!-лопектин та результати проведеного досл!-дження, можна зробити припущення щодо впливу пол!морф!зму цього гена на сп!вв!д-ношення ам!лоза/ам!лопектин, яке визна-чае напрям використання зерна кукурудзи. Однак для п!дтвердження цього припущен-ня необх!дно проведення експериментально!
вериф!кац!! з використанням розроблених пар праймер!в у ПЛР in vitro на широк!й виб!рц! л!н!й та г!брид!в кукурудзи в!тчиз-няно! та заруб!жно! селекц!!, що р!зняться за вм!стом ам!лози та ам!лопектину. Для встановлення кореляц!! м!ж алельним станом гена ае1 та концентрац!ею ам!лози/ам!-лопектину необх!дно провести б!ох!м!чний анал!з зразк!в нас!ння кукурудзи та екстра-поляц!ю отриманих даних на результати ПЛР-анал!зу.
Висновки
За результатами б!о!нформатичного ана-л!зу гена ael кукурудзи знайдено рег!они, що м!стять ран!ше не визначен! пол!морфн! д!лянки. Для пол!морфних рег!он!в розроб-лено дизайн праймер!в, як! дають можли-в!сть диференц!ювати л!н!! кукурудзи. Ви-значено, що встановлений пол!морф!зм теоретично здатний впливати на функц!ю ензи-му розгалуження крохмалю та, як насл!док, зм!нювати концентрац!ю ам!лопектину в зерн! кукурудзи. Ц! результати е основою розроблення функц!ональних маркер!в гена ael, як! можна використовувати в селекц!й-них програмах для добору генотип!в куку-рудзи з певною структурою крохмалю ен-досперму зерна.
Використана литература
1. Farooq M. Physiology of grain development in cereals / M. Fa-rooq, A. Wahid, K. H. M. Siddique // Handbook of Plant and Crop Physiology / M. Pessarakli (ed.). - 3rd ed. - Boca Raton, FL, USA : CRC Press, Taylor & Francis Publishing Group, 2014. -P. 301-308.
2. James M. Seed starch synthesis / M. James, A. Myers // Handbook of Maize: Its Biology / J. L. Bennetzen, S. C. Hake (Eds.).
- New York, USA : Springer, 2009. - P. 439-456. doi: 10.1007/978- 0-387-79418-1_22.
3. Seed development: OMICS technologies toward improvement of seed quality and crop yield / G. K. Agrawal, R. Rakwal (Eds). -Dordrecht, NL : Springer, 2012. - 576 p.
doi: 10.1007/978-94-007-4749-4
4. Starch biosynthetic enzymes from developing maize endosperm associate in multisubunit complexes / T. A. Hennen-Bierwagen, F. Liu, R. S. Marsh [et al.] // Plant Physiol. - 2008.
- Vol. 146, Iss. 4. - P. 1892-1908. doi: 10.1104/pp.108.116285
5. Hennen-Bierwagen T. A. Genomic specification of starch biosynthesis in maize endosperm / T. A. Hennen-Bierwagen, A. M. Myers // Seed Genomics / P. W. Becraft (Ed.). - Hoboken, NJ : John Wiley & Sons, 2013. - P. 123-137.
doi: 10.1002/9781118525524.ch7
6. National Center for Biotechnology Information (NCBI) data base [Електронний ресурс]. - Режим доступу : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
7. Smith T. F. Identification of common molecular subsequences / T. F. Smith, M. S. Waterman // J. Mol. Biol. - 1981. - Vol. 147, Iss. 1. - P. 195-197. doi: 10.1016/0022-2836(81)90087-5
8. Needleman S. B. A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins / S. B. Needleman, C. D. Wunsch // J. Mol. Biol. - 1970. - Vol. 48, Iss. 3. - Р. 443-453.
9. Okonechnikov K. Unipro UGENE: a unified bioinformatics toolkit / K. Okonechnikov, O. Golosova, M. Fursov // Bioinformatics. - 2012. - Vol. 28, Iss. 8. - P. 1166-1167.
doi: 10.1093/bioinformatics/bts091
10. The SWISS-MODEL workspace: a web-based environment for protein structure homology modelling / K. Arnold, L. Bordoli, F. Kopp, T. Schwede // Bioinformatics. - 2006. - Vol. 22, Iss. 2.
- P. 195-201. doi: 10.1093/bioinformatics/bti770
11. Sneath P. H. A. Numerical taxonomy: The principles and practice of numerical classification / P. H. A. Sneath, R. R. Sokal.
- San Francisco : W. H. Freeman & Co, 1973. - 573 p.
12. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods / K. Tamura, D. Peterson, N. Peterson [et a l.] // Mol. Biol. Evol. - 2011. - Vol. 28, Iss. 10. - P. 2731-2739. doi: 10.1093/molbev/msr121
13. Tajima F. Statistical method for testing the neutral mutation hypothesis by DNA polymorphism / F. Tajima // Genetics. -1989. - Vol. 123, Iss. 3. - P. 585-595.
References
1. Farooq, M., Wahid, A., & Siddique, K. H. M. (2014). Physiology of grain development in cereals. In M. Pessarakli (Ed.), Handbook of Plant and Crop Physiology. (3rd ed.). (pp. 301-308). Boca Raton, FL, USA: CRC Press, Taylor & Francis Publishing Group.
2. James M., & Myers, A. (2009). Seed starch synthesis. In J. L. Bennetzen & S. C. Hake (Eds), Handbook of Maize: Its Biology. (pp. 439-456). New York, USA: Springer.
doi: 10.1007/978-0-387-79418-1_22.
3. Agrawal, G. K., & Rakwal, R. (Eds). (2012). Seed development: OMICS technologies toward improvement of seed quality and crop yield. Dordrecht, NL: Springer. doi: 10.1007/978-94-007-4749-4
4. Hennen-Bierwagen, T. A, Liu, F., Marsh, R. S., Kim, S., Gan, Q., Tetlow, I. J., ... Myers, A. M. (2008). Starch biosynthetic en-
zymes from developing maize endosperm associate in multi-subunit complexes. Plant Physiol., 146(4), 1892-1908. doi: 10.1104/pp.108.116285
5. Hennen-Bierwagen, T. A., & Myers, A. M. (2013). Genomic specification of starch biosynthesis in maize endosperm. In P. W. Becraft (Ed.), Seed Genomics. (pp. 123-137). Hobo-ken, NJ: John Wiley & Sons.
doi: 10.1002/9781118525524.ch7
6. National Center for Biotechnology Information (NCBI) data base. (n.d.). Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov
7. Smith, T. F., & Waterman, M. S. (1981). Identification of common molecular subsequences. J. Mol. Biol., 147(1), 195-197.
doi: 10.1016/0022-2836(81)90087-5
8. Needleman, S. B., & Wunsch, C. D. (1970). A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins. J. Mol. Biol., 48(3), 443-453.
9. Okonechnikov, K., Golosova, O., & Fursov, M. (2012). Unipro UGENE: a unified bioinformatics toolkit. Bioinformatics, 28(8), 1166-1167. doi: 10.1093/bioinformatics/bts091
10. Arnold, K., Bordoli, L., Kopp, F., & Schwede, T. (2006). The SWISS-MODEL workspace: a web-based environment for protein structure homology modeling. Bioinformatics, 22(2), 195201. doi: 10.1093/bioinformatics/bti770
11. Sneath, P. H. A., & Sokal, R. R. (1973). Numerical taxonomy: The principles and practice of numerical classification. San Francisco: W. H. Freeman & Co.
12. Tamura, K., Peterson, D., Peterson, N., Stecher, G., Nei, M., & Kumar, S. (2011). MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol. Biol. Evol., 28(10), 27312739. doi: 10.1093/molbev/msr121
13. Tajima, F. (1989). Statistical method for testing the neutral mutation hypothesis by DNA polymorphism. Genetics, 123(3), 585-595.
УДК 633.15.631.527
Слищук Г. И., Жернаков Т. Ю., Волкова Н. Е.* Биоинформатический анализ гена кукурузы, кодирующего энзим ветвления крахмала SBEIIb // Сортовивчення та охорона прав на сорти рослин. - 2016. - № 3. -С. 13-18. http://dx.doi.org/10.21498/2518-1017.3(32).2016.75972
Селекционно-генетический институт - Национальный центр семеноведения и сортоизучения, ул. Овидиопольская дорога, 3, Одесса, 65036, Украина, *e-mail: natavolki@ukr.net
Цель. Исследование полиморфизма гена ае1 кукурузы биоинформатическими методами. Методы. Глобальное и локальное выравнивание нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, in silico трансляция и транскрипция, моделирование транслятов, дизайн праймеров, филогенетический анализ. Результаты. Проанализированы 255 нуклеотидных последовательностей гена ае1 кукурузы, 500 аминокислотных последовательностей гомологов транслятов гена ae1 кукурузы (гомологов энзима SBEIIb) и 100 мРНК, экспрессирующихся с гена ae1 кукурузы, для установления его филогенетических взаимосвязей. Биоинформатическими методами исследован полиморфизм различных участков гена ae1 кукурузы. Осуществлено моделирование фермента SBEIIb кукурузы. Выводы. По результатам выравнивания аминокислотных последовательностей гомологов фермента SBEIIb установлено, что орто-логи гена ae1 присутствуют лишь у однодольных растений, паралоги - у однодольных, двудольных и других таксонов,
включая водоросли и животных. По результатам выравнивания мРНК растений, с которых транслируется энзим SBEIIb, определены как ортологи гена ae1 кукурузы, так и ближайшие паралоги, кодирующие ферменты ветвления крахмала с хлоропластной локализацией; это свидетельствует о возможном происхождении гена ae1 в результате дупликации гена, кодирующего 1,4-а-глюкан-энзим ветвления крахмала 2 с хлоропластной или амилопластной локализацией. В структуре гена ае1 кукурузы найдены регионы, которые включают в себя не определенные ранее полиморфные участки. К полиморфным регионам разработан дизайн праймеров, которые позволяют дифференцировать линии кукурузы. Определено, что обнаруженный полиморфизм теоретически способен влиять на функцию фермента и в результате этого изменять концентрацию амилопектина в зерне кукурузы.
Ключевые слова: ген ае1, энзим ветвления крахмала SBEIIb, кукуруза, биоинформатические подходы.
UDC 633.15.631.527
Slishchuk, G. I., Zhernakov, T. Yu., & Volkova, N. E.* (2016). Bioinformatic analysis of maize gene encoding starch branching enzyme SBEIIb. Sortovivcenna ohor. prav sorti roslin [Plant Varieties Studying and Protection], 3, 13-18. http://dx.doi.org/10.21498/2518-1017.3(32).2016.75972
Plant Breeding and Genetics Institute - National center of Seed and Cultivar Investigation, 3, Ovidiopolska Doroga st., Odesa, 65036, Ukraine, *e-mail: natavolki@ukr.net
Purpose. Investigation of maize ael gene polymorphism by bioinformatic methods. Methods. Global and local alignment of the nucleotide and amino acid sequences, in silico translation and transcription, translates modeling, primers design, phylogenetic analysis. Results. 255 nucleotide sequences of maize ael gene, 500 amino acid sequences of homology translates of maize ael gene (SBEIIb enzyme homologs) and 100 mRNA expressed from the maize ael gene were analyzed to establish phylogenetic relationships. Polymorphism of maize ael gene different regions was investigated by bioinformatic methods. Modeling of the maize enzyme SBEIIb was performed. Conclusions. According to the results of amino acid sequences of SBEIIb enzyme homologs alignment, it was found that ael gene orthologs are present only in monocots, paralogs - in monocots, dicots, and other taxa, including algae and animals. Based on the results
of alignment of plants mRNA from which enzyme SBEIIb is translated, maize ael gene orthologs and the nearest paralogs encoding starch branching enzymes with chloroplast localization were defined; this suggests a possible origin of ael gene due to duplication of the gene encoding the 1,4-alpha-glucan-branching enzyme 2 with chloroplast or amyloplast localization. In the maize ael gene structure, regions were found that include polymorphic sites not defined previously. For the polymorphic sites design primers were developed that allowed to differentiate the maize lines. It was determined that the detection of polymorphism in theory can influence the enzyme function and, as a result, change the concentration of amylopectin in maize grain.
Keywords: ael gene, starch branching enzyme SBEIIb, maize, bioinformatic.
Hadiuuina 23.05.20l6
