CC BY
27
DOI: 10.14258/jcpim.2020048530
УДК 615.322+58.085
БИОХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ ВЕГЕТАТИВНЫХ ЭКСПЛАНТОВ И КАЛЛУСОВ PINUS SIBIRICA DU TOUR
© Ж.А. Кох12*, Ю.А. Литовка13, П.В. Маколова1, К.А. Шабанова3, И.Н. Павлов13
1 Институт леса им. В.Н. Сукачева СО РАН, ФИЦ КНЦ СО РАН,
Академгородок, 50/28, Красноярск, 660036 (Россия),
e-mail: jannetta-83@mail. ru
2 Красноярский государственный аграрный университет, пр. Мира, 90,
Красноярск, 660049 (Россия)
3 Сибирский государственный университет науки и технологий имени
академика М. Ф. Решетнёва, пр. Мира, 82, Красноярск, 660049 (Россия)
Подобраны способы стерилизации однолетних побегов Pinus sibirica DuTour и условия культивирования при введении их в культуру in vitro. Индукция каллусогенеза асептически жизнеспособных эксплантов P. sibirica интенсивнее протекает на модифицированной среде Мурасиге-Скуга при гормональном обеспечении КИН в концентрации 0.4%, 6-БАП - 0.25% и пониженном содержании сахарозы - 1.5% с частотой каллусообразования 83%. Установлены близкие количественные показатели содержания экстрактивных веществ (36 и 33% от абсолютно сухой массы соответственно для каллуса и экспланта); легкогидролизуемых полисахаридов (18 и 16%) и белковых соединений (11 и 10%). Каллусы P. sibirica характеризуются более высоким содержанием аскорбиновой кислоты, флаваноидов, токоферолов и зольных элементов на фоне невысокого количества трудногидролизуемых полисахаридов, танинов, липидов, пигментов и эфирных масел. Электрофоретический спектр водорастворимых белков каллусной ткани представлен одиннадцатью фракциями: 63% от суммы водорастворимых белков составляют фракции с молекулярной массой 33 кД и выше; максимально представлены фракции с молекулярными массами 50 и 62 кД (20 и 17%). В эксплантах P. sibirica преобладают низкомолекулярные фракции белков с молекулярными массами от 5 кД и ниже (59%). Аминокислотный состав каллусов и экс-плантов P. sibirica идентичен и представлен пятнадцатью индивидуальными аминокислотами. В каллусной ткани обнаружено более высокое содержание глутаминовой кислоты; достоверное увеличение содержания двух гидрофобных аминокислот (пролин и изолейцин)в период интенсивного каллусообразования проявляется на фоне уменьшения количества гидрофильной аминокислоты тирозин по сравнению с вегетативной частью растения.
Ключевые слова: Pinus sibirica, культивирование in vitro, стерилизация, каллусы, экспланты, биохимический состав, водорастворимые белки.
Введение
Накопление органической растительной массы в целом, и хвойными растениями в частности, приобретает особую значимость в современном мире, находящемся под угрозой исчерпания основных энергетических ресурсов. Хвойные растения имеют неоценимое экономическое значение как источник коммерческой древесины, сырья для изготовления бумаги, биологически активных веществ для различных отраслей промышленности, а также играют важную роль в поддержании экологического баланса планеты [1]. Представители семейства Pinaceae наряду с общими чертами, характерными для хвойных растений, обладают особенностями, которые обеспечили им широкое распространение в различных климатических зонах. На тер-
Кох Жанна Александровна - кандидат технических наук, научный сотрудник, доцент кафедры технологии, оборудования бродильных и пищевых производств, тел. (391)247-26-66, e-mail: jannetta-83@mail.ru Литовка Юлия Александровна - доктор биологических наук, старший научный сотрудник, профессор кафедры химической технологии древесины и биотехнологии, тел. (391) 227-36-54, e-mail: litovkajul@rambler.ru
Окончание на С. 396.
ритории Сибири одной их основных хозяйственно ценных древесных пород является Pinus sibirica Du Tour. Высокие технические качества ее древесины и широкое распространение обусловили многолетнюю масштабную эксплуатацию сосновых лесов и истощение естественных ресурсов.
* Автор, с которым следует вести переписку.
В настоящее время практическое лесоводство направлено на интенсификацию процессов восстановления хвойных лесов с применением агротехнических приемов, ускоряющих рост и накопление биомассы, повышающих в целом продуктивность древесных насаждений [2]. Биотехнологические методы также находят широкое применение в лесном секторе для производства высококачественного посадочного материала и создания лесосырьевых плантаций, производства биологических средств защиты, создания новых форм древесных растений с заданными признаками. Одним из эффективных методов, направленных на ограничение деградации хвойных древостоев, поддержание и восполнение востребованных и редких представителей флоры, является клональное микроразмножение растений, включая соматический эмбриогенез [1-3]. Основными преимуществами этого метода являются высокий коэффициент размножения, увеличение сезонности и продуктивности, получение заданного количества посадочного материала с улучшенными наследственными свойствами, возможность размножать отдельные деревья с уникальным генотипом и поддерживать биоразнообрание, сохраняя редкие и исчезающие виды [4].
Работы по микроклональному размножению лиственных пород (Betula, Castanea, Fraxinus, Populus, Quercus, Salix) ведутся давно и достаточно успешно [5-9]. Хвойные растения являются более сложным объектом для культивирования in vitro за счет невысокой скорости роста и быстрой контаминации культуры, наличием фенольных соединений, ингибирующих рост и деление клеток, низкой укореняемостью. Одним из наиболее перспективных методов в микроклональном размножении пород деревьев (Larix sibirica, L. gmelini, L. sukaczewii, Pinus sibirica, P. sylvestris P. pumela, Piceaabies, P. ajaensis) считается соматический эмбриогенез, способный в дальнейшем обеспечить получение «искусственных семян» и существенно снизить стоимость посадочного материала [10-12]. Применение мегагаметофита, зрелых и незрелых зародышей, семядолей и гипокотиля в качестве исходных эксплантов обеспечивает высокие показатели морфогенеза, но не позволяет полностью воспроизвести генотип исходного растения. В связи с чем немалый интерес представляют исследования вегетативных частей растений (сегментов побегов и зрелой хвои) как первичных эксплантов для получения материала генетически идентичного исходной форме [13-17].
Культивирование растений in vitro сопровождается изменением цитофизиологических особенностей, биохимического состава и метаболической активности их клеток по сравнению с исходным растением. Сравнительное исследование основных групп биологически активных веществ каллусной ткани и интактного растения позволяет оценить метаболические изменения в клетках после их де-дифференциации и перспективность дальнейшего практического использования полученной каллусной культуры [17-20]. Успешное внедрение микроклональных методов в практику лесовосстановления невозможно без всестороннего исследования особенностей каллусогенеза хвойных растений на морфологическом, цитологическом и биохимическом уровнях, а разработка условий эффективного введения эксплантов в культуру, изучение биохимического состава каллусной ткани и растений-регенерантов является актуальной задачей.
Экспериментальная часть
Индукция морфогенеза в условиях in vitro зависит от подбора первичного экспланта, условий стерилизации растительного материала и питательной среды с оптимальным соотношением фитогормонов. Исходный материал получали от растений P. sibirica, произраставших на территории Ермаковского района Красноярского края (Южная Сибирь). В качестве первичных эксплантов использовали сегменты однолетних побегов P.sibirica (средняя часть) размером 2 см. Стерилизацию эксплантов проводили в два этапа: 1. предобработка растительного материалапутем погружения в 2% мыльный раствор в течение 2-10 мин с последующим промыванием в дистиллированной воде в течение 15 мин; 2. основная стерилизация эксплантов в условиях ламинар-бокса различными стерилизующими агентами (70% раствор C2H5OH; 2.5% раствор
Маколова Полина Васильевна - младший научный NaClO; 0.2% раствор диацида) с последующим 3-
сотрудник лаборатории лесных культур, микологии
и фитопатологии, e-mail: polinochka-makolova@rambler.ru Шабанова Ксения Александровна - студент,
кратным промыванием дистиллированной водой.
Каллусную ткань P. sibirica получали на ба-
e-mail: shabanova.ksenia@mail.ru зовой и модифицированной средах по прописи Му-
Павлов Игорь Штш^т - доктор биологических наук, расиге-Скуга (МС) (состав представлен в таблице
профессор, заведующий лабораторией лесных культур микологии и фитопатологии, заместитель директора
1) методом твердофазного культивирования. Гор-
по научной работе, заведующий кафедрой химической мональное обеспечение осуществляли, используя
технологии древесины и биотехнологии, КИН (Sigma, США) - 0.1-0.4 мг/л; 6-БАП (Sigma,
тел. (391) 227-36-54, e-mail: forester24@mail.ru
США) - 0.25-0.5 мг/л. В качестве источника углеродного питания использовали сахарозу в концентрации (1.5-3%). Пробирки с эксплантами инкубировали в климатокамере («JeioTech», Корея) при следующих условиях: фотопериод - 16 ч; освещенность - 2-3 кЛк; температура - 24±1 °С; влажность воздуха - 70%; продолжительность - 21-28 сут. Частоту каллусообразования оценивали по количеству эксплантов, продуцирующих каллус, от их общего числа (%).
Каллусную ткань поддерживали в культуре путем ее регулярных пассажей на свежую питательную среду в оптимальных условиях культивирования. Для исследования химического состава использовали каллусы после пятой процедуры пассирования при суммарном накоплении сырой биомассы в количестве 100 г. Общее содержание белка в первичных эксплантах и каллусной ткани определяли по методу Бузуна [21]; фракционный состав и молекулярные массы водорастворимых белков - методом диск-электрофореза в по-лиакриламидном геле (ПААГ) с додецилсульфатом натрия по Орнстейну и Девидсу в современной модификации [22] ; содержание свободных аминокислот - методом тонкослойной хроматографии [22]. Определение экстрактивных веществ проводили гравиметрическим методом (многократной экстракцией) [23, 24]; витаминов - по методикам Девяткина [18]; суммарного количества углеводов - по методике Вознесенского [23, 24]; лигниновых веществ - модифицированным методом Комарова с 72%-ной серной кислотой [24, 25]. Количество зольных веществ определяли спектрофотометрическим методом [23, 25]; содержание и состав ли-пидов - по методикам Кейтс [26]; содержание эфирного масла - путем его перегонки с водяным паром с последующим измерением объема [23, 25]. Опыты проведены в 3-кратной повторности. Статистическая обработка данных проведена согласно общепринятым методам математической статистики при помощи стандартного пакета документов Microsoft Office Excel (2010). Статистическую значимость различий оценивали по t-критерию Стьюдента при p<0.05. На графике представлены средние значения и их стандартные ошибки.
Таблица 1. Компонентный состав базовой и модифицированной сред Мурасиге-Скуга для введения в культуру вегетативных эксплантов Pinussibirica
Состав компонентов из базовой прописи, идентичный для обеих сред, мг/л Компоненты, содержание которых различается Содержание вещества, мг/л
базовый состав модифицированный состав
KNOз - 1900; №N03 -1650; KH2PO4 - Тиамин гидрохлорид 0.1 0.5
1700; MgSO4 х 7^ - 370; CaCk х 2^ - Пиридоксин гидрохлорид 0.5 1.0
690; Na2Mo04 х 2^ - 0.25; CuSO4 х 5^ Глицин 0.5 -
- 0.025; HзBOз - 6.2; MnSO4 х 4^ - 22.3; Никотиновая кислота 0.5 1.0
ZnSO4 х 7H2O - 8.6; Ю - 0.83; ^к х Инозитол 100 150
6H2O - 0.025; FeSO4 х 7H2O - 27.85; КИН (кинетин) - 0.1-0.4
№2ЭДТА - 37.35; агар - 7000 6-БАП (6-бензиламинопурин) - 0.25-0.5
Сахароза 30000 15000-30000
Обсуждение результатов
Введение в культуру in vitro вегетативных частей P. sibirica и накопления каллусной ткани проводили при строгом соблюдении всех этапов стерилизации и условий культивирования. Доля асептически жизнеспособных эксплантов варьировала в широких пределах от 36 до 87% в зависимости от используемого стерилизующего агента и времени экспозиции. Доля асептически нежизнеспособных эксплантов изменялась от 0 до 60%; уровень контаминации составил 4-51% (табл. 2). Наиболее приемлемым вариантом стерилизации первичных эксплантов P. sibirica является использование 0.2% раствора диацида в течение 2 мин с предварительной экспозицией растительной ткани в 2% мыльном растворе в течение 2 мин. При таком способе предобработки доля асептически жизнеспособных эксплантов составила 87%, нежизнеспособных - 3%; уровень контаминации - 10%.
Стерильные побеги P. sibirica вводили на агаризованные питательные среды с минеральным составом по базовому составу компонентов среды МС и модифицированную питательную среду с различными концентрациями регуляторов роста, а также стандартным и пониженным содержанием сахарозы. Образование каллусной ткани отмечено только на средах с присутствием 6-БАП и КИН, что позволяет отнести культуру P. sibirica к ауксинозависимой. Максимальная частота каллусообразования 82.7% отмечена на модифицированной среде МС при гормональном обеспечении КИН в концентрации 0.4%; 6-БАП - 0.25% и пониженном содержании сахарозы - 1.5%. Ростовой цикл каллусных клеток P. sibirica начинался с размещения экспланта
на питательной среде МС (начало культивирования) и завершался в момент прекращения митоза (стационарная фаза). Общая продолжительность активного периода роста каллуса без потери жизнеспособности составила 21-28 сут. Для поддержания культуры куллусную ткань пассировали на свежую питательную среду в объеме 60-100 мг на 20-40 мл среды с периодичностью 4-6 недель. Отмечено формирование рыхлой и компактной ткани зеленого цвета (рис. 1); в большинстве случаев для субкультуры отбирали компактную ткань, так как культивирование рыхлой каллусной ткани способствовало только ризогенезу.
Сравнительное исследование биохимического состава растительной ткани проводили между первичными эксплантами и каллусами Р. $1Ътса после пятой процедуры пассирования (при суммарном накоплении сырой биомассы 100 г). Содержание (% от абсолютной сухой массы) исследуемых компонентов представлено в таблице 3. Установлено, что все исследуемые компоненты группового состава присутствовали в кал-лусной культуре и интактном растении, однако их содержание в большинстве случаев существенно различалось. В двух типах растительных образцов близкие показатели по количественному содержанию выявлены для экстрактивных веществ - 36 и 33% соответственно для каллуса и первичного экспланта; легкогид-ролизуемых полисахаридов - 18 и 16% и белковых соединений - 11 и 10%. В каллусной ткани значительно ниже содержание трудногидролизуемых полисахаридов (в 2.9 раз); водорастворимых веществ (в 3.1 раза), включая танины (в 21.3 раза); липидов (в 10.6 раза), в том числе фосфолипидов (в 4 раза) и восков (в 11.3 раза); пигментов хлорофиллов (в 3.6 раза) и каратиноидов (в 3 раза) и особенно эфирных масел. Каллусная культура Р. $1Ътса характеризуется более высоким содержанием витаминов - аскорбиновой кислоты (3.3 мг%), флавоноидов (2.5 мг%) и токоферолов (0.4 мг%), а также зольных элементов (соответственно в 2.5; 6.3; 10 и 1.5 раза больше по сравнению с вегетативными эксплантами).
Таблица 2. Эффективность стерилизации вегетативных эксплантов Ртив $1Ътса
Предобработка Основная стерилизация Соотношение эксплантов, %
Время стерилизации в 2% мыльном растворе, мин Стерилизующий агент и его концентрация Длительность экспозиции, мин асептически жизнеспособные асептически нежизнеспособные инфицированные
2 64 0 36
5 70% С2Н5ОН 2 67 7 26
10 69 20 11
2 39 10 51
5 2.5% ЫаСЮ 15 57 12 31
10 65 25 10
2 87 3 10
5 0.2% диацид 2 42 37 21
10 36 60 4
Рис. 1. Морфология клеток компактной каллусной культуры Ртия siЪirica без окрашивания (вверху) и с применением сафранина (внизу), ><1000-2000
Каллусная культура P. sibirica в сравнении с химическим составом каллусов другого хвойного растения (Juniperus sibirica L.) характеризуется идентичным содержанием экстрактивных и зольных веществ, но существенно отличается по лигноцеллюлозной и белковой составляющей. Количество легкогидролизуемых полисахаридов и белковых веществ в каллусной культуре P. sibirica выше в 1.4 и 1.5 раз соответственно; трудногидролизуемых полисахаридов и лигниновых веществ - ниже в 3.3 и 3.9 раза по сравнению с каллусной культурой J.sibirica [27].
Количественное содержание белковых соединений в каллусах и эксплантах P. sibirica различалось несущественно, в связи с чем были дополнительно исследованы некоторые качественные характеристики водорастворимых белков и свободных аминокислот. использование метода электрофореза в полиакрила-мидном геле позволило разделить белки, выделенные из вегетативной части экспланта и каллусной ткани, на одиннадцать фракций. Результаты электрофоретического исследования и определения молекулярных масс водорастворимых белков приведены в таблице 4.
Полученные данные свидетельствуют, что в интактном растении преобладают низкомолекулярные фракции белков с молекулярными массами от 5 кД и ниже - их доля составляет 59.4% от суммы водорастворимых белков. Максимально представлены фракции с молекулярными массами 5 кД (35%) и 2 кД (18%); в меньшей степени - три фракции с молекулярными массами от 16 до 50 кД (13-14%). Белки с молекулярной массой более 50 кД представлены незначительно - около 9%. Электрофоретический спектр водорастворимых белков каллусной ткани P. sibirica также представлен одиннадцатью фракциями, однако их соотношение существенно отличается. Содержание фракций с молекулярной массой 33 кД и выше составляет 63% от суммы водорастворимых белков. Максимально представлены две фракции с молекулярными массами 50 и 62 кД -соответственно 20 и 17%; в меньшей степени - три фракции с молекулярными массами 82, 33 и 16 кД (1214%). В низкомолекулярной области спектра содержание отдельных фракций варьирует в пределах от 3 до 9%.
Таблица 3. Биохимический состав каллусной ткани и первичных эксплатов Pinus sibirica
Показатель Содержание компонентов, % от а.с.м.
каллусы экспланты
Экстрактивные вещества 36.1 33.2
Легкогидролизуемые полисахариды 17.5 15.7
Трудногидролизуемые полисахариды 7.3 21.2
Белковые вещества 11.3 10.4
Растворимые в воде вещества, в т.ч.: 7.5 23.4
- редуцирующие вещества 4.1 6.9
- танины 0.4 8.5
Лигнин 5.7 24.9
Аскорбиновая кислота (витамин С), мг% 3.3 1.3
Флавоноиды (витамин Р), мг% 2.5 0.4
Токоферолы (витамин Е), мг% 0.4 0.04
Липиды 0.8 8.5
- фосфолипиды 0.3 1.2
Воска 0.3 3.4
Хлорофиллы, мг% 0.5 1.8
Каратиноды, мг% 0.01 0.03
Эфирное масло 0.02 2.9
Зольные элементы 4.2 2.8
Таблица 4. Фракционный состав водорастворимых белков в каллусной ткани и эксплантах Pinus sibirica
Фракция Rf (шкала электрофоретиче-ской подвижности белков) Молекулярная масса, кД Содержание, % к сумме водорастворимых белков
каллусы экспланты
1 0.25 82 12.3 2.9
2 0.29 62 16.7 6.3
3 0.34 50 19.5 13.7
4 0.41 33 14.3 12.9
5 0.53 16 12.3 14.2
6 0.59 10 8.7 7.1
7 0.63 8 3.6 1.2
8 0.67 5 3.4 34.7
9 0.69 4 6.5 4.2
10 0.76 3.5 6.3 2.4
11 0.90 2 7.9 18.1
Аминокислотный состав первичных эксплантов и каллусов Р. вШпса. идентичен и представлен пятнадцатью индивидуальными аминокислотами (рис. 2). Количественный анализ не выявил статистически значимых различий между содержанием большинства идентифицированных аминокислот в исследуемых растительных тканях, за исключением тирозина (содержание в 1.6 раза выше в экспланте), а также изолейцина и пролина (содержание выше в каллусной ткани в 1.9 раза).
В каллусной ткани Р. $1Ътса обнаружено более высокое содержание глутаминовой кислоты - 702 мкг/г (в экспланте 655 мкг/г), которая играет ключевую роль в аминокислотном обмене, в том числе во время активной стадии каллусогенеза. Глутаминовая кислота является донором аминогруппы в реакциях трансаминирова-ния а-кетокислот, которые считаются одним из основных биохимических путей введения а-аминогруппы при биосинтезе других аминокислот. В каллусах и эксплантах Р. $1Ътса также выявлено значительное количество аспарагиновой кислоты (464 и 445 мкг/г соответственно). Активный биосинтез глутаминовой и аспарагиновой кислот свидетельствует о высокой активности азотного метаболизма в исследуемых растительных тканях и предотвращает накопление в нихизбыточных концентраций аммиака. В меньшей степени в каллусе и интакт-ном растении представлены аминокислоты гистидин, аланин, глицин, фенилаланин, лейцин, лизин, валин, а также изолейцин (в эксплантах) - содержание их находится в пределах от 203 до 301 мкг/г; присутствие остальных аминокислот было менее значимым - от 105 до 199 мкг/г. В целом, аминокислотный состав отличается незначительно: увеличение содержания двух гидрофобных аминокислот (пролин и изолейцин) в период интенсивного каллусообразования Р. $1Ътса проявляется на фоне уменьшения количества гидрофильной аминокислоты тирозин по сравнению с вегетативной частью растения.
Рис. 2. Аминокислотный состав в каллусной ткани и первичных эксплантах Pinus sibirica
Выводы
Оптимальным способом стерилизации вегетативных частей P. sibirica при введении их в культуру in vitro является обработка первичных эксплантов в 0.2% растворе диацида в течение 2 мин с предварительной экспозицией растительной ткани в 2% мыльном растворе в течение 2 мин. Доля асептически жизнеспособных эксплантов составила 87%, нежизнеспособных - 3%; уровень контаминации - 10%. Индукция каллусогенеза первичных эксплантов P. sibirica интенсивнее протекает на модифицированной среде Мурасиге-Скуга при гормональном обеспечении КИН в концентрации 0.4%, 6-БАП - 0.25% и пониженном содержании сахарозы - 1.5% с частотой каллусообразования 82.7%.
Биохимическое исследование двух типов растительных тканей выявило близкие показатели по количественному содержанию экстрактивных веществ (36 и 33% соответственно для каллуса и первичного экс-планта); легкогидролизуемых полисахаридов (18 и 16%) и белковых соединений (11 и 10%). В каллусной ткани значительно ниже содержание трудногидролизуемых полисахаридов, водорастворимых веществ, ли-пидов, пигментов и эфирных масел. Каллусы P. sibirica характеризуется более высоким содержанием аскорбиновой кислоты, флаваноидов, токоферолов и зольных элементов по сравнению с интактным растением.
Электрофоретический спектр водорастворимых белков каллусной ткани P. sibirica представлен одиннадцатью фракциями, соотношение которых существенно отличается от эксплантов. Содержание фракций с молекулярной массой 33 кД и выше составляет 63% от суммы водорастворимых белков; максимально
БИОХИМИ^^ИЙ СОСТАВ ВEГEТAТИВНЫХ ЭКСПЛАНТОВ И КАЛЛУСОВ PINUS SIBIRICA DU TOUR
401
представлены две фракции с молекулярными массами 50 и 62 кД (20 и 17% соответственно). В низкомолекулярной области спектра содержание отдельных фракций варьирует в пределах от 3 до 9%. В вегетативных эксплантах преобладают низкомолекулярные фракции белков с молекулярными массами от 5 кД и ниже -их доля составляет 59% от суммы водорастворимых белков.
Аминокислотный состав каллусов и эксплантов P. sibirica идентичен и представлен пятнадцатью индивидуальными аминокислотами. В каллусной ткани обнаружено более высокое содержание глутаминовой кислоты; достоверное увеличение содержания гидрофобных аминокислот пролина и изолейцина (в 1.9 раза) в период интенсивного каллусообразования проявляется на фоне уменьшения количества гидрофильной аминокислоты тирозин по сравнению с вегетативной частью растения.
Список литературы
1. Жигунов А.В. Применение биотехнологий в лесном хозяйстве России // Лесной журнал. 2013. №2. С. 27-35.
2. Третьякова И.Н., Ворошилова Е.В., Шуваев Д.Н., Пак М.Э. Перспективы микроклонального размножения хвойных в культуре in vitro через соматический эмбриогенез // Хвойные бореальной зоны. 2012. Т. 30. №1-2. С. 180-186.
3. Бабикова А.В., Гафицкая И.В., Журавлев Ю.Н. Микроклональное размножение древесных лесных растений Дальнего Востока России: перспективы развития // Размножение лесных растений в культуре invitro как основа плантационного лесовыращивания: материалы Международной научно-практической конференции. 2014. С. 4-8.
4. Красноперова В.В., Власевский Д.Н. Роль вегетативного размножения хвойных растений в культуре in vitro для нужд лесного и садово-паркового хозяйства // Пермский аграрный вестник. 2017. №4. С. 18-22.
5. Машкина О.С., Табацкая Т.М., Исаков Ю.Н. Клональное размножение березы карельской // Лесное хозяйство. 2000. №4. С. 33-34.
6. Машкина О.С., Табацкая Т.М., Горобец А.И., Шестибратов К.А. Методы клонального микроразмножения различных видов и гибридов ивы // Биотехнология. 2010. №1. С. 51-59.
7. Машкина О.С., Табацкая Т.М., Стародубцева Л.М. Длительное микрочеренкование для массового клонального размножения карельской березы и тополя // Физиология растений. 1999. Т. 46. №6. С. 950-952.
8. Жигунов А.В. Рост триплоидной осины в лесных культурах, созданных посадочным материалом, полученным по технологии in vitro // Труды СПбНИИЛХ. 2009. №1(18). С. 143-152.
9. Шабунин Д.А. Перспективы микроклонального размножения лиственных пород для плантационного лесовыращивания // Труды СПбНИИЛХ. 2011. Ч. 1. №1(24). С. 49-55.
10. Божков П.В. Соматический эмбриогенез и полиэмбриогенез хвойных in vitro на примере ели обыкновенной (Piceaabies L. Karst): автореф. дис. ... канд. биол. наук. СПб., 1994. 20 с.
11. Лебедев В.Г., Шестибратов К.А. Органогенез сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) в культуре invitro // Хвойные бореальной зоны. 2012. №1-2. С. 114-119.
12. Sarvas R. Investigations on the flowering and seed crop of Pinus sylvestris // Comm. Inst. For. Finniae. 1962. Vol. 53. Pp. 1-198. DOI: 10.1016/0378-1127(87)90009-0.
13. Третьякова А.В., Демина Е.А., Рекославская Н.И., Саляев Р.К., Столбиков А.С. Особенности получения каллусной культуры пихты сибирской Abies sibirica Ledeb. // Известия ИГУ. 2014. Т. 10. С. 11-23.
14. Brodelius P., Pedersen H. Increasing secondary metabolic production in plant cell culture by redirecting transport // Trends in Biotechnology. 1993. Vol. 11. N1. Pp. 30-36.
15. Murashige T.A., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. 1962. Vol. 15. N4. Pp. 473-497.
16. Koski V. Generative reproduction and genetic processes in nature // Genetics of Scots Pine. Amsterdam: Elsevier, 1991. Pp. 59-72.
17. Tretyakova I.N., Park M.E., Kazachenko A.S., Shuklina A.S., Kudoyarova G.R., Akhiyarova G.R., Korobova A.V., Veselov S.U. Content and immunohistochemical localization of hormones during in vitro somatic embryogenesis in long-term proliferating Larix sibirica cultures // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 2019. Vol. 136. N3. Pp. 511-522. DOI: 10.1007/s11240-018-01533-y.
18. Stasolla C., Yeung E. Recent advances in conifer somatic embryogenesis: improving somatic embryo quality // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 2003. Vol. 74. Pp. 15-35. DOI: 10.1023/A:1023345803336.
19. Park Y.'S., Bonga J. Application of somatic embryogenesis in forest // Management and research IUFRO working party 2.09.02 somatic embryogenesis of forest trees conference advances in somatic embryogenesis of trees and its application for the future forests and plantations. Su-won, Republic of Korea, 2010. Pp. 3-8.
20. Klimaszewska K., Park Y-S., Overton C. et al. Optimized somatic embryogenesis in Pinus strobus L. // In vitro Cell. Dev. Biol.-Plant 2001. Vol. 37. Pp. 392-399. DOI: 10.1007/s11627-001-0069-z.
21. Бузун Г.А., Джемухадзе К.М., Милешко Л.Ф. Определение белка в растениях с помощью амидо-черного // Физиология растений. 1982. Т. 29. №1. С. 198-203.
22. Ермаков А.Е., Арасимович В.В., Ярош Н.П. Методы биохимического исследования растений. Л., 1988. 430 с.
23. ГОСТ 24027.2-80. Сырье лекарственное растительное. Методы определения влажности, содержание золы, экстрактивных и дубильных веществ, эфирных масел. Лекарственное растительное сырье. М., 1980. С. 284-294.
24. Ушанова В.М., Лебедева О.И., Девятловская А.Н. Основы научных исследований: учеб. пособие. Красноярск, 2004. Т. 3. 359 с.
25. Оболенская А.В., Ельницкая З.П., Леонович А.А. Лабораторные работы по химии древесины и целлюлозы: учеб. пособие для вузов. М., 1991. 320 с.
26. Кейтс М. Техника липидологии. М., 1975. 322 с.
27. Зырянова Ю.В., Аёшина Е.Н., Величко Н.А. Химический состав можжевельника сибирского, каллусной ткани и послеэкстракционного остатка // Химия растительного сырья. 2012. №2. С. 145-150.
Поступила в редакцию 29 сентября 2020 г.
Принята к публикации 13 ноября 2020 г.
Для цитирования: Кох Ж.А., Литовка Ю.А., Маколова П.В., Шабанова К.А., Павлов И.Н. Биохимический состав вегетативных эксплантов и каллусов Pinus sibirica Du Tour // Химия растительного сырья. 2020. №4. С. 395-403. DOI: 10.14258/jcprm.2020048530.
Koh Zh.A.12*, Litovka Yu.A.1,3, Makolova P.V.1, Shabanova K.A.3, Pavlov I.N.1-3BIOCHEMICAL COMPOSITION OF VEGETATIVE EXPLANTS AND CALLUS PINUS SIBIRICA DU TOUR
1 Institute of Forest named after V.N. Sukachev SB RAS, FRC KSC SB RAS, Akademgorodok, 50/28, Krasnoyarsk,
660036 (Russia),e-mail: jannetta-83@mail.ru
2 Krasnoyarsk State Agrarian University, pr. Mira, 90, Krasnoyarsk, 660049 (Russia)
3 Siberian State University of Science and Technology named after academician M.F. Reshetneva, pr. Mira, 82,
Krasnoyarsk, 660049 (Russia)
The methods of sterilization of annual shoots Pinus sibirica Du Tour and the conditions for their introduction into in vitro culture were studied. Induction of callusogenesis of aseptically viable explants of P. sibirica proceeds more intensively on the modified Murasige-Skoog medium: hormonal supply of 0.4% kinetin and 0.25% 6-benzylaminopurine; reduced sucrose concentration of 1.5%. The frequency of callus formation was 83%.
Close quantitative indicators of extractive substances were established (36 and 33% of absolutely dry weight for callus and explant, respectively); easily hydrolyzable polysaccharides (18 and 16%) and proteins (11 and 10%).Callus P. sibirica has a higher content of ascorbic acid, flavanoids, tocopherols and ash elements compared to explants and a low amount of hard-hydro-lyzable polysaccharides, lipids, tannins, pigments, and essential oils.The electrophoretic spectrum of water-soluble callus proteins is represented by eleven fractions: 63% of the total water-soluble proteins are fractions with a molecular weight of 33 kD and above. Fractions with molecular weights of 50 and 62 kD (20 and 17%, respectively) are represented as much as possible.In the explants of P. sibirica, low molecular weight fractions of proteins with molecular masses of 5 kD and lower (59%) predominate. The amino acid composition of calli and explants of P. sibirica is identical and is represented by fifteen individual amino acids. Callus tissue has a higher content of glutamic acid and two hydrophobic amino acids (proline and isoleucine) compared to the vegetative part of the plant and low tyrosine content.
Keywords: Pinus sibirica, in vitro cultivation, sterilization, callus, explants, biochemical composition, water-soluble proteins.
* Corresponding author.
References
1. Zhigunov A.V. Lesnoy zhurnal, 2013, no. 2, pp. 27-35. (in Russ.).
2. Tret'yakova I.N., Voroshilova Ye.V., Shuvayev D.N., Pak M.E. Khvoynyye boreal'noy zony, 2012, vol. 30, no. 1-2, pp. 180-186. (in Russ.).
3. Babikova A.V., Gafitskaya I.V., Zhuravlev Yu.N. Razmnozheniye lesnykh rasteniy v kul'ture invitro kak osno-va plantatsionnogo lesovyrashchivaniya. Materialy mezhdunarodnoy nauchno-prakticheskoy konferentsii. [Reproduction of forest plants in in vitro culture as the basis for plantation forest growing. Materials of the international scientific and practical conference]. 2014, pp. 4-8. (in Russ.).
4. Krasnoperova V.V., Vlasevskiy D.N. Permskiy agrarnyy vestnik, 2017, no. 4, pp. 18-22. (in Russ.).
5. Mashkina O.S., Tabatskaya T.M., Isakov Yu.N. Lesnoye khozyaystvo, 2000, no. 4, pp. 33-34. (in Russ.).
6. Mashkina O.S., Tabatskaya T.M., Gorobets A.I., Shestibratov K.A. Biotekhnologiya, 2010, no. 1, pp. 51-59. (in Russ.).
7. Mashkina O.S., Tabatskaya T.M., Starodubtseva L.M. Fiziologiya rasteniy, 1999, vol. 46, no. 6, pp. 950-952. (in Russ.).
8. Zhigunov A.V. Trudy SPbNIILKh, 2009, no. 1(18), pp. 143-152. (in Russ.).
9. Shabunin D.A. Trudy SPbNIILKh, 2011, no. 1(24), pp. 49-55. (in Russ.).
10. Bozhkov P.V. Somaticheskiy embriogenez ipoliembriogenez khvoynykh in vitro naprimere yeli obyknovennoy (Pice-aabiesL. Karst): avtoref. dis. ... kand. biol. nauk. [Somatic embryogenesis and polyembryogenesis of conifers in vitro on the example of Norway spruce (Piceaabies L. Karst): author. dis. ... Cand. biol. sciences]. St. Petersburg, 1994, 20 p. (in Russ.).
11. Lebedev V.G., Shestibratov K.A. Khvoynyye boreal'noy zony, 2012, no. 1-2, pp. 114-119. (in Russ.).
12. Sarvas R. Comm. Inst. For. Finniae, 1962, vol. 53, pp. 1-198. DOI: 10.1016/0378-1127(87)90009-0.
13. Tret'yakova A.V., Demina Ye.A., Rekoslavskaya N.I., Salyayev R.K., Stolbikov A.S. Izvestiya IGU, 2014, vol. 10, pp. 11-23. (in Russ.).
14. Brodelius P., Pedersen H. Trends in Biotechnology, 1993, vol. 11, no. 1, pp. 30-36.
15. Murashige T.A., Skoog F. Physiol. Plant, 1962, vol. 15, no. 4, pp. 473-497.
16. Koski V. Genetics of Scots Pine, Amsterdam: Elsevier, 1991, pp. 59-72.
17. Tretyakova I.N., Park M.E., Kazachenko A.S., Shuklina A.S., Kudoyarova G.R., Akhiyarova G.R., Korobova A.V., Veselov S.U. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 2019, vol. 136, no. 3, pp. 511-522. DOI: 10.1007/s11240-018-01533-y.
18. Stasolla C., Yeung E. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 2003, vol. 74, pp. 15-35. DOI: 10.1023/A:1023345803336.
19. Park Y.'S., Bonga J. Management and research IUFRO working party 2.09.02 somatic embryogenesis of forest trees conference advances in somatic embryogenesis of trees and its application for the future forests and plantations, Su-won, Republic of Korea, 2010, pp. 3-8.
20. Klimaszewska K., Park Y-S., Overton C. et al. In vitro Cell. Dev. Biol.-Plant, 2001, vol. 37, pp. 392-399. DOI: 10.1007/s11627-001 -0069-z.
21. Buzun G.A., Dzhemukhadze K.M., Mileshko L.F. Fiziologiya rasteniy, 1982, vol. 29, no. 1, pp. 198-203. (in Russ.).
22. Yermakov A.Ye., Arasimovich V.V., Yarosh N.P. Metody biokhimicheskogo issledovaniya rasteniy. [Biochemical research methods of plants]. Leningrad, 1988, 430 p. (in Russ.).
23. GOST 24027.2-80. Syr'ye lekarstvennoye rastitel'noye. Metody opredeleniya vlazhnosti, soderzhaniye zoly, ekstraktivnykh i dubil'nykh veshchestv, efirnykh masel. Lekarstvennoye rastitel'noye syr'ye. [GOST 24027.2-80. Herbal medicinal raw materials. Methods for determining moisture content, ash content, extractive and tannins, essential oils. Medicinal herbal raw materials]. Moscow, 1980, pp. 284-294. (in Russ.).
24. Ushanova V.M., Lebedeva O.I., Devyatlovskaya A.N. Osnovy nauchnykh issledovaniy: ucheb. posobiye. [Fundamentals of scientific research: textbook. allowance]. Krasnoyarsk, 2004, vol. 3, 359 p. (in Russ.).
25. Obolenskaya A.V., Yel'nitskaya Z.P., Leonovich A.A. Laboratornyye raboty po khimii drevesiny i tsellyulozy: ucheb. posobiye dlya vuzov. [Laboratory work on the chemistry of wood and cellulose: textbook. manual for universities]. Moscow, 1991, 320 p. (in Russ.).
26. Keyts M. Tekhnika lipidologii. [Technique of lipidology]. Moscow, 1975, 322 p. (in Russ.).
27. Zyryanova Yu.V., Ayoshina E.N., Velichko N.A. Khimiya Rastitel'nogo Syr'ya,, 2012, no. 2, pp. 145-150. (in Russ.).
Received September 29, 2020 Accepted November 13, 2020
For citing: Koh Zh.A., Litovka Yu.A., Makolova P.V., Shabanova K.A., Pavlov I.N. Khimiya Rastitel'nogo Syr'ya, 2020, no. 4, pp. 395-403. (in Russ.). DOI: 10.14258/jcprm.2020048530.
