CC BY
9Вестник защиты растений, 2, 2002 15
УДК 632.95.025.8:577.153
БИОХИМИЧЕСКИЙ МЕХАНИЗМ РЕЗИСТЕНТНОСТИ У ОТСЕЛЕКТИРОВАННЫХ НА УСТОЙЧИВОСТЬ К ДИМЕТОАТУ ЛИНИЙ ОБЫКНОВЕННОГО ПАУТИННОГО КЛЕЩА
И.А.Тулаева, О.В.Сундуков
Всероссийский НИИ защиты растений, Санкт-Петербург
У двух линий обыкновенного паутинного клеща Tetranychus urticae Koch., отселектиро-ванных на резистентность к диметоату, из географически удаленных популяций выявлена причастность эстеразной системы клещей к резистентности. У единичных самок изучаемых линий клеща сопоставлены спектры множественных молекулярных форм эстераз и определена удельная суммарная активность комплекса карбоксилэстераз и холинэстеразы. Холинэ-стераза паутинных клещей по субстратной специфичности отличается от типичной ацетил-холинэстеразы (КФ 3.1.1.7) и бутирилхолинэстеразы (КФ 3.1.1.8). С наибольшей активностью она гидролизовала пропионилтиохолиниодид (ПТХ I") и менее активно - ацетилтиохолинио-дид (АТХ I") и бутирилтиохолиниодид (БТХ I"). Установлено, что эстеразная активность резистентных клещей связана с отбором особей, обладающих повышенной активностью одного из ферментов карбоксилэстеразного комплекса, предположительно фосфолипазы.
Проводившееся ранее изучение биохимических механизмов резистентности членистоногих к инсектоакарицидам показало, что во многих случаях проявляющаяся устойчивость к токсикантам обусловлена повышенной активностью эстераз. Такая зависимость обнаружена у членистоногих различных таксонов - гусениц совок Spodoptera littoralis Boisd. (Riskallah,1983) и Heliothis virescens F. (Goh et al.,1995), цикадок Nilaparvata lugens Stal. (Miyata,1983) и Laodelphax striatellus Fallen. (Sakata, Miyata,1994), белокрылки Bemisia tabaci Gennadius. (Ishaaya et al.,1987), жука Oryzaephilus surinamensis L. (Conyers et al.,1998), клопа Lygus hesperus Knight. (Zhu,Brindley, 1990), паутинного клеща Tetranychus kanzawai Kishida (Kuwahara,1984) и других. На основании этой закономерности были разработаны методы, позволяющие по уровню активности эстераз в выборке из нескольких особей оценивать потенциальные возможности популяции проявлять устойчивость к инсектицидам определенных химических групп (Miyata, 1983; Brown, 1987; Georghiou,1988; AbdelAal et al.,1990).
Установлено, что увеличение количественного содержания эстераз в организме резистентных к инсектицидам насекомых происходит в результате умножения (амплификации) генных локусов, де-
терминирующих синтез какой-то из множественных молекулярных форм этих ферментов (Devonshire,Moores,1982; Devonshire et al., 1983,1986). Факт амплификации генов доказан с помощью меченых атомов 14С и 3Н как по увеличению фрагментов ДНК и транскрипционной активности, так и по уровню рибосо-мальной трансляции синтеза эстераз (Devonshire et al.,1986; Devonshire, Field,1991; Hick et al.,1996; Ono et al.,1999).
Традиционно эстеразам приписывается роль детоксицирующих фосфорорга-нические, карбаматные и пиретроидные инсектициды ферментов. Однако при этом не всегда принимается во внимание важное обстоятельство, вытекающее из классификационного определения этих ферментов - гидролаз эфиров карбоно-вых кислот (К.Ф. 3.1.1.). В списках инсек-тоакарицидов, к которым членистоногие с повышенной эстеразной активностью проявляют устойчивость, вместе с мала-тионом и некоторыми пиретроидами, относящимися к эфирам карбоновых кислот, часто указываются как детоксици-руемые эстеразами и инсектициды, не принадлежащие к этому классу химических соединений, и, следовательно, не гидролизуемые эстеразами. Некоторые авторы акцентировали внимание на этом обстоятельстве (Riskallah,1983; Holwerda, Morton,1983; Georghiou,1988). Последним
из них, в частности, отмечена сходимость результатов биохимического определения уровня эстеразной активности с показателями токсичности для комаров р.Си1ех 28 различных популяций только у инсектицидов, не гидролизуемых эстеразами
Вестник зашиты, растений, 2, 2002 (темофоса, дурсбана, байтекса), но не у малатиона. В этой связи дальнейшее изучение и обсуждение эстеразного механизма резистентности членистоногих к инсектоакарицидам должно считаться по-прежнему актуальной задачей.
Методы и
Объектом изучения служил обыкновенный паутинный клещ Tetranychus urticae Koch, двух отселектированных на резистентность к диметоату линий, выделенных из популяций, собранных с хлопковых полей в Южном Таджикистане, подвергавшихся интенсивным обработкам ФОС и другими акарицидами в течение многих лет, и популяции, полученной из московских теплиц. Обе популяции вредителя исходно характеризовались повышенной устойчивостью к фосфорорганическому препарату диметоату (показатель резистентности 250 и 320 соответственно). Селекция на устойчивость к диметоату привела к увеличению показателя резистентности до 480х и 350х соответственно. Селекция велась при инбредном разведении и индивидуальном посемейном тестировании дискриминирующей концентрацией акарицида. Для сравнения использовалась чувствительная к акарициду линия клеща.
Для установления возможного вклада различных ферментативных систем в механизм резистентности клеща к ФОС применяли токсикологический метод, основанный на использовании синергистов, специфически ингибирующих определенные ферментативные системы. В качестве синергистов использовали ингибиторы микросомальных монооксигеназ - пипе-ронилбутоксид (ППБ) и SCF-525A и ингибиторы карбоксилэстераз - БД-5 и ТБТФ. В наших опытах использовался показатель синергитического эффекта (ПСЭ), который является отношением процента смертности самок клеща при их обработке среднелетальной концентрацией диметоата с добавкой синергиста к смертности самок от той же концентрации акарицида без синергиста (Тулае-ва,1995). Применение такой методики бы-
ло связано с ограниченностью посемейно получаемого материала.
Исследование типов эстеразного полиморфизма сопоставляемых линий проводили методом гель-электрофореза в полиакриламидном геле (Sula,Weyda, 1983). Анализируемый образец в каждом отдельном случае готовился из одной самки, которая растиралась в микропробирке с 40 мкл 40% сахарозы, содержащей 1% тритона Х-100. Самцов гомогенизировали в количестве 10 особей с добавлением 60 мкл 40% сахарозы.
Холинэстеразные фракции в гомоге-натах клеща выявляли методом Карнов-ского (Karnovsky,Roots, 1964). В качестве субстратов в инкубационной среде использовали ацетилтиохолиниодид (АТХ I"), бутирилтиохолиниодид (БТХ I") и пропионилтиохолиниодид (ПТХ I"). Анализируемые образцы в этих вариантах готовили из 20 самок клеща одной семьи.
Для измерения каталитической активности карбоксилэстераз использовали колориметрический метод ван Асперна (Asperen,1962). Измерения проводили на спектрофотометре СФ-26 при длине волны 600 нм. Гомогенат готовили из 10 самок клеща в 1 мл в 0.04М фосфатного буфера, рН 7.0. Для учета спонтанного гидролиза субстрата в параллельных опытах раствор (1 часть 1% прочного синего В и 2.5 части 5% додецилсульфата натрия) добавляли в реакционную среду без раствора фермента. Активность эсте-раз рассчитывали из разности экстинк-ций опытной и контрольной проб.
Количество тиохолина, образующегося в результате ферментативного гидролиза холинэстеразой клеща тиохолиновых субстратов, определяли с помощью метода Эллмана (Ellman et al.,1961). Макси-
Вестник защиты растений, 2, 2002 мум поглощения при длине волны 412 нм. Гомогенаты готовили из 150 самок клеща в 1 мл в 0.1М фосфатного буфера, рН 7.9 с 0.8% тритона Х-100.
Результаты и
На основе использования специфических ингибиторов монооксигеназ ППБ и СКГ-525, а также ингибиторов эстераз БД-5 и ТБТФ, косвенно удалось определить биохимические механизмы, ответственные за резистентность сопоставляемых линий паутинного клеща (табл.1).
Таблица 1. Вклад карбоксилэстераз и микро-сомальных монооксигеназ в образование резистентности обыкновенного паутинного клеща к диметоату Синергитический эффект смесей Ингиби- диметоата с ингибиторами
тор в соотношениях
1:0.1 1:1 1:10
Чувствительная (S) линия
ППБ 1.1 1.0 1.0
SCF-525A 0.8 0.9 0.7
БД-5 0.8 1.0 1.1
ТБТФ 1.1 1.3 1.9*
Московская (R17) линия
ППБ 1.0 1.3* 1.3*
SCF-525A 0.9 0.5 0.6
БД-5 1.1 1.2 2.4*
ТБТФ 1.4* 2.7* 2.8*
Пархарская (R19) линия
ППБ 1.2 1.3* 1.4*
SCF-525A 0.6 0.6 0.6
БД-5 0.9 0.8 1.8*
ТБТФ 1.6* 2.7* 2.8*
*Различия достоверны при Р>0.99.
СЭ= (СК5о диметоат+синергист)/(СК5о диметоат).
Достоверное увеличение токсичности диметоата (1.8-2.8 раз) имело место только в резистентных линиях при использовании ингибиторов эстераз. Дальнейшая серия биохимических исследований подтвердила это предположение.
Методом электрофореза и спектрофо-тометрическими методами исследовали активность и фракционный состав эсте-раз в отселектированных диметоатом линиях обыкновенного паутинного клеща. В выборках вредителя из московской и пархарской популяции были выявлены наиболее характерные спектры карбок-
Определение белка в растворах гомо-гената выполнялось методом Хартри (НаЛгее,1972), который является модификацией метода Лоури.
их обсуждение
силэстераз, присущие, как оказалось, разным видам паутинного клеща (рис.1).
Рис.1. Характерные типы эстеразных спектров у самок разных видов паутинных клещей (гидролизуемый субстрат 1 -нафтилацетат) а - Tetranychus turkestani Ug et Nik., б - Tetranychus urticae Koch., в - Tetranychus frater Wainf., г - Tetranychus sawzdargi Mitrof.
Визуальные различия в спектрах множественных молекулярных форм неспецифических эстераз особей клещей из двух географически удаленных популяций позволили предположить смешанный видовой состав последних. Проведенные
реципрокные скрещивания самок и самцов из выборок клещей обеих популяций показали их репродуктивную несовместимость, то есть скрещивания не происходило и из отложенных самками яиц появлялись только самцы. Определение выделенных линий, выполненное В.И.Митрофановым (Никитский ботанический сад, Ялта), позволило идентифицировать в пархарской популяции 3 вида клещей - T.urticae, TЛurkestani и, предположительно, T.frater Wainf. Последний вид часто образует смешанные популяции с T.urticae.
В московской популяции определено 2 вида - T.urticae и T.sawzdargi МгЬго! Селекцию на резистентность к диметоату вели только с обыкновенным паутинным клещом (T.urticae) из обеих популяций.
Выявленные типы эстеразных спектров разных видов клещей различались как по количественному составу, так и по активности отдельных фракций (рис.1).
Идентификацию эстеразных фракций осуществляли на основании их субстратной специфичности по отношению к тиохо-линовым субстратам, которые могли гид-ролизоваться только холинэстеразами. Хо-линэстеразная фракция (Е7) располагалась вблизи старта разделяющего геля (рис.2в).
"I
+
а б в
Рис.2. Идентификация эстеразных фракций у самок обыкновенного паутинного клеща (линия И19) а - гидролизуемый субстрат 1-нафтилацетат, б - белковые фракции при окраске Кумасси, в - гидролизуемый субстрат ацетилтиохоли-ниодид
Реакцией Кумасси на белки выявленная плотная фракция на старте разделяющего геля по своему месторасположению соответствовала расположению холинэстеразной фракции Е7 (рис.2б).
Все прочие фракции ферментов, выявленные с помощью 1 -нафтилацетата (рис.2а), считались карбоксилэстеразны-ми. Активность этих фракций тормозилась фосфорорганическими токсикантами - параоксоном, малооксоном, БД-5 в концентрации 0.00001-0.0001М после 5 мин прединкубации гелей в растворах этих соединений.
Фракций с подвижностью альбумина, активность которых не тормозилась бы параоксоном в этих концентрациях, вследствие чего их можно было бы считать арилэстеразными КФ. 3.1.1.2. в соответствии с использовавшимися ранее тестами (Аугустинссон,1972), у клещей обнаружено не было.
Известно, что попытка идентификации хроматографически разделенных карбоксилэстеразных фракций по их чувствительности к различным фосфо-рорганическим ингибиторам привела к заключению о ее некорректности. Оказалось, что фракции, которые могли бы рассматриваться как отдельные ферменты - КФ 3.1.1.1, КФ 3.1.1.2 и КФ 3.1.1.6 в соответствии с ранее принятыми критериями, являются комбинациями одних и тех же полипептидных субъединиц, то есть множественными молекулярными формами одного и того же фермента, часто называемого амфифильной эстера-зой. Их составом в упаковке мультимера определяется степень его чувствительности к ингибиторам и скорость гидролиза ими различных субстратов (СЬои<ЗЬигу, 1972). Использованные нами методики исследования не позволяли более точно идентифицировать состав карбоксилэсте-разных фракций и они рассматривались как комплекс кабоксилэстераз. Отдельно от них у паутинного клеща исследовались свойства холинэстеразы, являющейся аллостерическим ферментом. Модификации конформационного состояния одной из двух образующих этот фермент полипептидных субъединиц определяет
Использование стратов показало, клещей проявляет
Вестник защиты растений, 2, 2002 особый биохимический механизм устойчивости членистоногих к токсикантам (Villatte et al.,2000).
тиохолиновых суб-что холинэстераза наибольшую активность по отношению к ПТХ I", в меньшей степени к АТХ I" и наименее активна к БТХ I" (рис.3). При этом различия наблюдались не только в количестве образующегося конечного продукта реакции фермента с субстратом, но и в скорости протекания самой реакции. То, что холи-нэстераза клеща проявляет наибольшее сродство к холиновому эфиру пропионо-вой кислоты и при этом достаточно активно гидролизует БТХ I", свидетельствуют о том, что она по основному классификационному критерию - субстратной специфичности, не соответствует ферментам существующей номенклатуры -ни ацетилхолинэстеразе (КФ 3.1.1.7), ни холинэстеразе (КФ 3.1.1.8).
En —
Ел —
б
+
Рис. 3. Относительное сродство холинэстераз
к тиохолиновым субстратам самок обыкновенного паутинного клеща (линия R17) Гидролизуемые субстраты: а - пропионил-тиохолиниодид, б - ацетилтиохолиниодид, в - бутирилтиохолиниодид.
Сопоставление эстеразных спектров клещей исследуемых линий показало, что резистентные к диметоату клещи в отличие от клещей чувствительной линии обладают более высокой активностью множественных молекулярных форм карбоксилэстераз, если судить об этом по интенсивности окраски выявляемых
фракций (рис.4 а,б).
Скорость гидролиза тиохолиновых субстратов холинэстеразой различалась также и у клещей сопоставляемых линий. У клещей резистентных линий хо-линэстеразные фракции при использовании одних и тех же субстратов выявлялись в значительно более коротком временном интервале. При этом фракции фермента у клещей чувствительной и резистентных линий визуально четко отличались по интенсивности окраски, то есть по количеству образующегося конечного продукта реакции гидролиза (рис.4 а,б).
А
Е7_
Е6б Е6Г Е5 -
Е4_
Е3 _
Е2 -Е1 -
3
+
Б
Е7 _
Е6б_ Е6а~ Е5 Е4 Е3 '
< I
б
+
д
Рис. 4. Различия в активности эстераз у клещей T.urticae чувствительной и резистентных к диметоату линий у самок (А) и самцов (Б) а, б, в - гидролизуемый субстрат 1-нафтил-ацетат; г, д, е - гидролизуемый субстрат ацетилтиохолиниодид у самок и пропионилтио-холиниодид у самцов; а, г - линия S, б, д - линия R17, в, е - линия R19
Количественные различия каталитических свойств изучаемых эстераз оценивались по удельной активности ком-
б
а
в
г
д
е
а
в
а
в
г
е
плекса карбоксилэстераз и холинэстера-зы в сравниваемых линиях. Полученные результаты показали (табл.2), что активность карбоксилэстераз у клещей резистентных линий была в 1.4-1.6 раза достоверно выше, чем у клещей чувствительной линии.
Существенных различий в активности холинэстеразы к тиохолиновым субстратам между клещами чувствительной и резистентных линий не было получено. Этот фермент не показал также различий у клещей сопоставляемых линий в чувствительности к ингибиторам его активности - ДДВФ, параоксону и БД-5.
Таблица 2. Сравнительная эстеразная активность самок обыкновенного паутинного клеща чувствительной и резистентных к диметоату
_линий ( х ± S х, п=5)_
Удельная активность
_(н.моль/мин/мг белка)_
Ли- Карбокси- Холинэстеразы по отношения лэстераз нию к тиохолиновым эфирам кле по отно-
ща шению к нафтил-ацетату
АТХ I" ПТХ I" БТХ I"
S 465.3 ±25.8* 11.5 ±0.6** 16.6 ±2.1** 8.1 ±0.6**
R17 670.4 ±51.7* 12.7 ±0.8 16.8 ±1.1 8.6 ±0.7
R19 763.9± 83.0* 13.9 ±1.6 17.8 ±1.6 10.6 ±1.4
*Различия между клещами R и S линий достоверны при Р < 0.05.
**Различия в скорости гидролиза субстратов достоверны при Р < 0.05.
Вместе с тем спектрофотометриче-ским методом подтверждены данные электрофоретических исследований по субстратной предпочтительности холинэстеразы обыкновенного паутинного клеща. Наиболее активно фермент гидроли-зует ПТХ I", несколько слабее АТХ I" и в наименьшей степени БТХ I" (табл.2).
В целом, полученные с помощью элек-трофоретических и колориметрических методов данные согласуются с результатами токсикологических экспериментов со специфическими ингибиторами эсте-раз и позволяют считать, что повышенная активность какого-то из ферментов комплекса карбоксилэстераз обыкновенного паутинного клеща определяет его
Вестник защиты растений, 2, 2002 резистентность к диметоату. Биохимический механизм резистентности в данном случае не заключается в детоксицирую-щей активности этого фермента, поскольку диметоат не является карбокси-эфиром, а карбоксиамидную связь в его молекуле карбоксилэстеразы разрывать не могут (Дотерман,1972). По имеющимся литературным сведениям, инсектоакари-циды острого токсического действия встраиваются в плазматическую мембрану клеток - в места, занимаемые в углеводородных цепях мембранных липидов холестерином (Antunes-Madeira,Madeira, 1979,1989; Голубев,1993). Липидный бис-лой мембран, как известно, представляет собой подвижную систему множества структурных фрагментов - высших жирных кислот, спиртов, глицерина, углеводов, азотистых оснований, аминокислот, холестерина, фосфорной и фосфоновой кислот и прочих соединений. Он находится в состоянии непрерывного разрушения и ресинтеза, что позволяет меняться вязкости и геометрии липидного бислоя, вследствие чего осуществляется все многообразие мембранных функций, обеспечивающих жизнеспособность клеток. Эфирные связи жирных кислот и фосфатные диэфирные связи в этом процессе динамического обновления липидного матрикса разрываются и восстанавливаются карбоксилэстеразами.
Ферментам, относящимся к подпод-классу карбоксилэстераз (КФ 3.1.1), присуща широкая перекрывающаяся субстратная специфичность к карбоксиэфи-рам. Такие нефизиологические субстраты, как производные карбоновых кислот и нафтолов или фенолов, используемые в лабораторных экспериментах, гидроли-зуются всеми ферментами этого подпод-класса (Берстон,1965; Луппа,1980). В выявлявшемся нами методом диск-электрофореза с помощью 1-нафтилацетата эсте-разном спектре несомненно присутствовали множественные молекулярные формы как неспецифических амфифиль-ных эстераз, так и фосфолипаз (КФ 3.1.1.4) - энзимов, специфически действующих на эфирные связи жирных кислот в фосфолипидах - основных струк-
Вестник защиты растений, 2, 2002 турных элементах липидного бислоя. Исходя из представлений о физиологической значимости фосфолипаз как ферментов, непосредственно участвующих в динамическом обновлении биомембран, можно предположить, что элиминирующая селекция членистоногих на резистентность к пестицидам должна быть направлена на отбор особей с более высокой активностью у них этих ферментов. Обнаруживаемые спектрофотомет-рическим методом количественные различия в суммарной активности эстераз по отношению к 1-нафтилацетату у резистентных и чувствительных к диметоа-ту клещей, скорее всего, были обусловлены более высоким содержанием у них фосфолипазы.
Таким образом, выявляющийся у резистентных к пестицидам членистоногих повышенный уровень карбоксилэстераз-ной активности может рассматриваться как способ усиления защитных функций организма, направленный на предотвращение или устранение вызываемой токсикантом разупорядоченности липидного матрикса биомембран. Это достигается путем увеличения синтеза какой-то из множественных молекулярных форм фермента, участвующего в процессе динамического обновления того участка липидной структуры биомембран, в который, в зависимости от своих физико-химических свойств, встраивается токсикант.
Как было показано ранее, наследова-
ние признака резистентности в линиях клеща к диметоату имеет доминантный характер. Закономерности наследования этого признака и его сохранение в выделенных линиях по данным гибридологического анализа ближе всего соответствуют механизму моногенной амплификации (Анисимов, Тулаева,1998; Тулаева, Анисимов,1998). Выявляемые электрофо-ретическим методом различия в скорости появления холинэстеразных фракций и интенсивности их окраски у клещей чувствительной и резистентных линий, дающие основание предполагать наличие у них неодинаковой активности также и этого фермента, не соответствуют данным гибридологического анализа об ответственности за резистентность одного амплифицированного гена. Возможным объяснением этого факта могут быть имеющиеся сведения о том, что амплификация основного гена, увеличение копий которого поддерживается отбором, может в некоторых случаях происходить вместе с соседними участками хромосомы (Сингер,Берг,1998). В пользу такого объяснения свидетельствует отсутствие различий у клещей сопоставляемых линий в чувствительности холинэстеразы к ингибиторам ее активности, что должно было бы наблюдаться в том случае, если бы генетическим механизмом резистентности была модификация аллосстериче-ских взаимодействий субъединиц холи-нэстеразы.
Литература
Анисимов А.И., Тулаева И.А. Гибридологический анализ устойчивости к рогору обыкновенного паутинного клеща Tetranychus urticae Koch. (Acarina, Prostigmata) из природной популяции в Таджикистане. /Проблемы энтомологии в России. Сборник научных трудов РЭО, 1, СПб, 1998, c.18-20.
Аугустинссон К.Б. Сравнительное изучение методов очистки и свойств холинэстераз. /Бюлл. ВОЗ, 44, 1-3, 1972, c.81-90.
Берстон М. Гистохимия ферментов. М., Мир, 1965, 464 с.
Голубев В.Н. Механизмы взаимодействия пестицидов с липидным бислоем клеточных мембран. /Успехи химии, 62, 7, 1993, с.726-734.
Дотерман У. Биологические и небиологические превращения фосфорорганических со-
единений. /Бюлл. ВОЗ, 44, 1-3, 1972, с.135-151.
Луппа Х. Основы гистохимии. М., Мир, 1980, 343 с.
Сингер М., Берг П. Гены и геномы, 2, М., Мир, 1998, 391 c.
Тулаева И.А. Исследование биохимических механизмов резистентности с помощью синер-гистов. /Сб. трудов СПбГАУ "Защита растений и окружающая среда". СПб., 1995, с.531.
Тулаева И.А., Анисимов А.И. Выделение высокоустойчивых к рогору линий обыкновенного паутинного клеща Tetranychus Urticae Koch. (Acarina, Prostigmata) из природной популяции в Таджикистане. /Проблемы энтомологии в России. Сб. науч. трудов РЭО, 2, СПб, 1998, c.172-173.
Abdel-Aal Y.A.I., Wolff M.A., Roe R.M.,
Lampert E.P. Aphid carboxylesterases: biochemical aspects and importans in the diagnosis of insecticide resistance. /Pestic Biochem Phi-siol., 38, 1990, p.255-266.
Antunes-Madeira M.C., Madeira V.M.C. Interaction of insecticides with lipid membranes. /Biochim. Biophys. Acta., 550, 1979, p.384-392.
Antunes-Madeira M.C., Madeira V.M.C. Membrane partitioning of organophosphorus and organochlorine insecticides and its implications for mechanisms of toxicity. /Pestic. Sci., 26, 1989, p.167-179.
Asperen K.van. A study of the housefly esterases by means of a sensitive colorimetric method. /J. Insect. Physiol., 8, 1962, p.401-406.
Brown Th. Improved detection of insecticide resistance through conventional and molecular techniques. /Annu. Rev. Entomol., 32, 1987, p.145-162.
Choudhury S.R. The nature of nonspecific esterases. A subunit concept. /J. Histochem. Cytochem., 20, 1972, p.507-517.
Conyers Ch. M., MacNicoll A. D., Price N. R. Purification and characterization of an esterase involved in resistance to organophosphorus insecticides in the saw-toothed grain beetle, Ory-zaephilus surinamensis. /Insect. Biochem. Mol. Biol., 28, 1998, p.435-448.
Devonshire A.L., Moores G.D. A carboxyles-terase with broad substrate specificity causes organophosphorus, carbamate and pyrethroid resistance in the peach-potato aphids (Muzus persicae). /Pestic. Biochem. Physiol., 18, 1982, p.235-246.
Devonshire A.L., Moores G.D., Chiang Ch.-L. The biochemistry of insecticide resistance in the peach-potato aphid, Myzus persicae. /JUPAC Pestic. Chem.;Hum Wotfare. Enveron. Proc 5 th. Int. Congr., Kyoto, 1983, p.191-196.
Devonshire A.L., Moores G.D., ffrench-Constant R.H. Detection of insecticide resistance by immunological estimation of carboxyleste-rase activity in Myzus persicae (Sulzer) and cross reaction of the antiserum with Phorodon humuli (Schrank). /Bull. Entomol. Res., 76, 1986, p.97-107.
Devonshire M.L., Field L.M. Gene amplification and insecticide resistance. /Annu. Rev. En-tomol., 36, 1991, p.1-23.
Devonshire M.L., Searle L.M., Moores G. D. Quntitative and qualitative variation in the mRNA for carboxylesterases in insecticide-susceptible and resistant Myzus persicae (Sulz). /Insect Biochem., 16, 1986, p.659-665.
Ellman G.L., Courtney K.D., Andres V., Featherstone R.M. A new and rapid colorime-tric determination of acetylcholinesterase activity. /Biochem. Pharmacol., 1961, p.88-95.
Georghiou G.P. Novel tests for detection of resistance mechanisms in single insects. /Proc. 18-th Int. Congr. Entomol., Vancouver, 1988, p.461.
Goh D.K.S., Anspaugh D.D., Motoyama N. et al. Isolation and characterization of an insecticide-resistance-associated esterase in the tobacco budworm Heliothis virescens F. /Pestic. Biochem. Physiol., 51, 1995, p.192-204.
Hartree E.F. Determination of protein: a modification of the louwry method that gives a linear photometric response. /Ann. Biochem., 48, 1972, p.422-427.
Hick C.A., Field L.M., Devonshire A.L. Changes in the methylation of amplified esterase DNA during loss and reselection of insecticide resistance in peach-potato aphids, Myzus persicae. /Insect Biochem. Molec. Biol., 26, 1996, p.41- 47.
Holwerda B.C., Morton R.A. The in vitro degradation of [14 C] malathion by enzymatic extracts from resistant and susceptible strains of Drosophila melanogaster. /Pestic. Biochem. Physiol., 20, 1983, p.151-160.
Ishaaya I., Mendelson L., Ascher K.R.S., Casida J.E. Cypermethrin synergism by pyrethro-id esterase inhibitors in adults of the whitefly Bimisia tabaci. /Pestic. Biochem. Physiol., 28, 1987, p.155-162.
Karnovsky M.G., Roots L. A "direct-coloring" thiocholine method for cholinesterases. /J. Histochem. Cytochem., 12, 1964, p.219-221.
Kuwahara M. Studies on the resistance of the Kanzawai spider mite, Tetranychus kanza-wai Kishida to acaricides. /Bull. Nat. Inst. Agr. Sci., 39, 1984, p.1-75.
Miyata T. Detection and monitoring methods for resistance in arthropods based on biochemical characteristics. /Pest. Resist. Pes-tic., N.Y., Plenum Press, 1983, p.99-116.
Ono M., Swanson J.J., Field L.M., Devonshire A.L., Siegfried B.D. Amplification and mettyla-tion of an esterase gene associated with insecticide-resistance in greenbugs, Schizaphis grami-num (Rondani). /Insect Biocheem. Molec. Biol., 29, 1999, p.1065-1073.
Riskallah M.R. Esterases and resistance to synthetic pyrethroids in the egyptian cotton leafworm. /Pesstic. Biochem. Physiol., 19, 1983, p.184-189.
Sakata K., Miyata T. Correlation of esterase isosymes to malathion resistance in the small brown plant hopper (Hemoptera: Delphacidae). /J. Econ. Entomol., 87, 1994, p.326-333.
Sйla J., Weyda F. Esterase polymorphism in several populations of the two-spotted spider mite, Tetranychus urticae Koch. /Experient., 39, 1983, p.78-79.
Villatte F., Ziliani Ph., Marcel V., Menozzi Ph., Fournier D. A high number of mutations in insect acetylcholinesterase may provide insecticide resistance. /Pestic. Biochem. Physiol., 67, 2000, p.95-102.
Zhu K.Y., Brindley W.A. Properties of esterases from Lygus hesperus Knight. (Hemiptera: Miridae) and the roles of the esterases in insecticide resistance. /J. Econ. Entomol., 83, 1990, p.725-732.
THE BIOCHEMICAL MECHANISM OF RESISTANCE IN RED SPIDER MITE LINES SELECTED BY RESISTANCE TO DIMETOATE I.A.Tulaeva, O.V.Sundukov The testing has been carried out on red spider mite Tetranichus urticae Koch. Lines resistant to dimetoate have been isolated from two geographically remote populations. The responsibility of esterases for resistance to dimetoate has been revealed with the help of inhibitors of monooxygenases PPB and SCF-525, and also esterases TBTF and BD-5. The spectra of multiple molecular forms of carboxylesterases hve been isolated in few females of investigated spider mite lines, and specific activity of carboxylesterase and cholinesterase has been determined by the spectrophotometric method. It is found that the high esterase activity in resistant mites is related to selection of individuals having a superactivity of a complex of the multiple molecular forms of carboxylesterases. The cholinesterase of spider mite differs from an acetylcholinesterase (KF 3.1.1.7) and butirilcholinesterase (KF 3.1.1.8) by substrate specificity. The acetylcholinesterase of spider mite has hydrolyzed propionilthiocholiniodid with the greatest activity and acetylthiocholiniodid and butirilthiocholiniodid less actively.
