Биохимические закономерности развития и поддержания популяции микроорганизмов в процессах производства пищевых продуктов Текст научной статьи по специальности «Математика»

© Пищиков Г. Б., Шанчуров С. М., 2010

Уральский государственный экономический университет

620144, РФ, г. Екатеринбург, ул. 8 Марта/Народной Воли, 62/45 Контактный телефон: (343) 251-96-36

Доктор технических наук, профессор, заведующий кафедрой машин и аппаратов пищевых производств

ПИЩИКОВ Геннадий Борисович

ШАНЧУРОВ Сергей Михайлович

Доктор технических наук, профессор, заведующий кафедрой менеджмента градостроительства

Уральский государственный экономический университет

620144, РФ, г. Екатеринбург, ул. 8 Марта/Народной Воли, 62/45 Контактный телефон: (343) 252-14-19 e-mail: ssm@usue.ru

Биохимические закономерности развития и поддержания популяции микроорганизмов в процессах производства пищевых продуктов

Ключевые слова: кинетика; микроорганизмы; биотехнологии; дрожжевые клетки; биохимия; размножение; рост и гибель микроорганизмов.

Аннотация. Рассмотрена кинетическая модель процесса роста и размножения микроорганизмов, учитывающая не только разнообразные формы клеток, но и способ их размножения. Сформулированы кинетические уравнения, позволяющие достаточно полно описать эволюционные процессы роста, размножения и гибели микроорганизмов в биореакторах периодического и непрерывного действия. Приведены примеры, представляющие как научный, так и практический интерес.

В настоящее время процесс культивирования микроорганизмов занимает важное место в биотехнологии, в технологии производства спирта, в пивоваренной и винодельческой промышленности [1-3]. Однако известные теории данного процесса построены в основном на балансовых соотношениях между биомассой дрожжей и концентрацией субстрата в культуральной жидкости и не учитывают стохастичность процесса.

В данной работе предлагается математическая теория процесса роста и размножения микроорганизмов на примере дрожжевых клеток как для случая, когда процесс лимитируется биохимическими превращениями внутри клетки, так и для случая, когда происходит диффузионный перенос питательных веществ к поверхности клетки.

Уравнения, описывающие рост (при х0 < х < 2х0 и деление дрожжевых клеток (при х = 2х0) на две равные части в проточном аппарате идеального смешения, представимы в следующем виде:

д 1 д д 1

—f + -f + — u(x, c)-—Dc f = yN[25(x - x0)-S(x - 2x0)]+-fa(x, t); (1)

где х0 - масса дрожжевой клетки после ее деления;/=/(х, 0 - плотность функции распределения числа клеток по их массам х в момент времени £ т - среднее время пребывания

У

элементов жидкости в аппарате (т = , где V - рабочий объем аппарата, Q - объемный

поток культуральной жидкости); и (х, с) - скорость роста отдельной клетки от х = х0 до х < 2х0; с = с (0 - концентрация субстрата; Бс - стохастический параметр (коэффициент «диффузии» в пространстве масс); у = у (с) - величина, определяющая скорость поступления дрожжевых клеток в систему в результате их размножения; N (О - число дрожжевых клеток в единице объема аппарата в момент времени £ 5 (() - дельта-функция Дирака;/ (х, ^ - плотность функции распределения числа клеток в единице объема входного потока культуральной жидкости; У - экономический коэффициент; знак -среднее значение указанной величины; с0 - концентрация субстрата во входном потоке.

Для однозначного решения уравнений (1) и (2) нужно задать начальные и граничные условия:

/(х, 0) = /01(х), с (0) = 0, (3)

где /01(х) - заданная функция;

/(х, 0 = 0 при х < х0 и х > 2х0, t > 0, (4)

т. е. функция/(х, 0 отлична от нуля только для х0 < х < 2х. Вне этого интервала она тождественно равна нулю, так как по предположению клетки массой 2х0 мгновенно разделяются. Если же по каким-либо причинам они не разделяются, удерживаются рядом, то условимся их считать за две клетки. Умножим выражение (1) слева и справа на хк—х и проинтегрируем по х от нуля до бесконечности, учитывая условие (4). Получим уравнение для определения к-го момента, к = 0, 1, 2, ...

—(хк^ + Цхк^ = к(хк~1uJN + к(к -1)(хк-2Бс^ -2yN(2к-1 -1) + Цхк) N0, (5) dt т т 0

где N - число дрожжевых клеток во входном потоке культуральной жидкости.

Из выражения (5) при к = 0, 1, 2 соответственно имеем:

т ~Г + (1 -утЖ = N 0; (6)

—

— ( (и)Л

т-(х^ +(х) 1 -т^-[ N = (х)оN0, М = (х^, М0 = (х)оN0; (7)

\х,

т—(хN = 2^хи}тN + 2т ^-2утх^ + ^х2^ N0. (8)

Из выражений (6)-(8) можно найти такие величины, как N, М и ст2 = ^х2^ -^х^2, где

а2 - дисперсия распределения случайной величины х.

Очевидно, что установившийся процесс имеет место не при всех значениях величины N0 и т^Бс ^. В связи с этим полезно следующее утверждение: пусть N0 = 0, т(= 0, тогда существует установившийся процесс, при котором

(и) т / ,

тт= %)=1 (9)

Рассмотрим два наиболее важных аспекта теории.

1. Процесс лимитируется биохимическими превращениями внутри клетки. В этом случае справедливы соотношения

и(х, с) = цх, (и) = ц(х), ц = цтс/ (к + с), (10)

где ц и к - постоянные величины.

^ ” т $

Далее, из соотношения (9) следует, что цт = 1, а поэтому

с = к / (цит-1), М = (с0 - с)У, N = М/(х), у = ц. (11)

С другой стороны, из решения уравнения (1), для рассматриваемого варианта, имеем:

2х

Дх) = х^[е(х - х0)-0(х - 2х0)], (12)

где 0(г) - ступенчатая функция, равная единице при г > 0 и равная нулю при г < 0.

Зная явный вид функции /(х), можно легко вычислить величину х:

1 2х0

— | х/(х)—х = (21п2)х0. (13)

N х0

2. Процесс лимитируется диффузионным переносом питательных веществ к поверхности клетки.

В данном варианте

и(х, с) = Рс$, (и) = Рс($) = Рс 4-^ (х^, (14)

х

Ч \ / У

где $ - внешняя поверхность дрожжевой клетки. Из соотношения (9) имеем:

\$/ \$/

ут = 1, Ртс^- = 1, У = . (15)

<х> <х>

Функцию ф (х) = / (x)/N при Бс = N0 = д/ / дt = 0 найдем из решения уравнения (1):

(16)

/ \ -Л$/ 1

Ф( х) = 2^ТТТехР х 5 (у)

($)_ Г —у

1

(у)

где у = х/р (у - объем клетки, р - ее плотность).

В правую часть выражения (16) входит неизвестное отношение ^ / (у , которое можно найти в явном виде, подчинив функцию ф (х) условию нормировки:

2х0

Г ф(х)—х = 1. (17)

х0

Из формулы (17) с учетом выражения (16) следует важная формула

V = (—17 —. (18)

($) Ч 1п2у Г $ (у)

Пример. Если дрожжевые клетки имеют сферическую форму и размножаются почкованием, тогда

—у у? —у „Г I— (, п

Г = Г------------^=я[-

у0 $ (у) 0 $0 + $1 (у) О1 + ^

= 11 —I Я, (19)

где учтено, что —у = 4пг2—г, у0 = —лЯ3, $0 = 4пЯ2, $1(у) - поверхность почки радиуса г,

Я - радиус зрелой почки. Но у у = -%, следовательно,

$3

2

(х> х х

)-(- = 0,929— = ^-°, Х = 0,929. (20)

($) $0 $0

Легко проверить, что такое же значение коэффициент X имеет для клеток эллиптической формы; для цилиндрической клетки X = 1.

Для дрожжевых клеток, размножающихся с помощью деления, практически всегда X = 1.

Опираясь на вышеизложенное, не представляет особого труда определить такие величины, как с, М, N

х1

с = Х-^—, М = (с0 - с )У, N = М/(х). (21)

$0 Рт 10

Таким образом, предложенная выше кинетическая модель процесса роста и размножения дрожжевых клеток учитывает не только разнообразные формы микроорганизмов, но и способ их размножения. Однако в этой модели проанализирован процесс при отсутствии внешнего источника дрожжевых клеток.

Изложим математическую модель рассматриваемого процесса в аппарате идеального смещения при наличии стоков и внешних источников дрожжевых клеток и питательных веществ.

Дрожжевая клетка рассматривается нами как миниатюрный биореактор идеального смешения.

Проанализируем два крайних случая массообмена дрожжевых клеток с окружающим их субстратом.

1. Процесс роста микроорганизмов при заданной концентрации питательных веществ лимитируется биохимическими превращениями внутри самой клетки.

2. При заданной концентрации субстрата в биореакторе процесс роста клетки лимитируется доставкой питательных веществ к ее поверхности.

Уравнения, описывающие рост при х0 < х < 2х0 и мгновенное деление дрожжевых клеток при х > 2х0 на две равные части в проточном аппарате идеального смешения, представимы в следующем виде:

д 1 д

—/ +-/ + — дt т дх

д

и (х, с) -— Бс

дх

/ = yN [28(х - х0) - 8(х - 2х0)]+1 / (х, t); (22)

—с+'-с+!(и)« = ^ (23)

Л т У' ' т 0

Для однозначного решения уравнений (22) и (23) нужно задать начальные и граничные условия

/(х, 0) = /0(х), С (0) = 0, (24)

где /0(х) - заданная функция;

/(х, 0 = 0 при х < х0 и х > 2х0, t > 0, (25)

т. е. функция /(х, 0 отлична от нуля только для х0 < х < 2х0; вне этого интервала она

тождественно равна нулю, так как, по предположению, клетки массой 2х0 мгновенно

распадаются. Умножим выражение (22) слева и справа на хк—х и проинтегрируем по х от нуля до бесконечности; учитывая условие (25), получим уравнение для определенного к-го момента, к = 0, 1, 2, ...

—{xk)N + Ц хк^ = к(хк-1и^ + к(к -1)( хк-2 Бс ^ - 2ух0к (2к-1 - 1)N + х^о N0, (26)

где N - число дрожжевых клеток во входном потоке культуральной жидкости.

Из выражения (26) при к = 0, 1, 2 соответственно имеем

т— + (1 -yт)N = N 0;

—

1 -т-

N = (х)0N0, М = (х^, М0 = (х)0N0;

т—(х2)N - (х2}N = 2(xтU}N + 2т(Бс ^ -2утх^ + (х^о N0.

(27)

(28)

(29)

Из уравнений (27)-(29) с учетом (23) можно найти такие величины, как N, М, (х0) и ст2 = ^х2 ^ - ^х^2, где ст2 - дисперсия распределения случайной величины.

Рассмотрим два наиболее важных аспекта.

1. Процесс лимитируется биохимическими превращениями внутри клетки. В этом случае справедливы соотношения

и(х,с) = |нх, (и) = н(х), Н = Н-иС / (К$ + С), где ц и К - постоянные величины.

^ ~ и $

1.1. Пусть N0 = 0, Бс = 0, тогда для установившегося процесса имеет место равенство

ут = и)т / (х) = 1.

Поэтому, так как цт = 1,

С = К; / (Нит-1), М = У(С, - С), у = ц.

С другой стороны, из решения уравнения (22), для рассматриваемого варианта, имеем:

2х

/ (х ) = —Г [0( х - х0)-0( х - 2х0)] N,

где 0(г) - ступенчатая функция, равная единице при г > 0 и равная нулю при г < 0. Зная явный вид функции ф(х) = / (х) / N, можно определить к-й момент:

0 хк

Г ф(х)хк—х =——(2к -2), (х) = (21п2)х0, (х2^ = 2х^,

х0 1

но, так как М = ^х^, то N = М /(х .

1.2. Пусть/0(х) = N08(x - х0), Бс = 0. Тогда для установившегося процесса из решений уравнений (220, (28) и (29) следует, что М = М0 + У(С0 - С):

С=11-^-+С +- Н-тМ0

2 | н т-1 0 У (нт-1) \

г т 'Г т ' 1

К5 н тМ0

5 - + С0 + - и 0

Н т-1 0 У(Н т-1

~ т т

4К5С0

Н т-1

г т

2а аха

/ (х)=N • 2Г-7 • 1+а[0(х - х0) - 0(х - 2х0)];

2 -1 х

, а = —, N = N

1 - Нт 2а -1 Нт

2а -1 0 2а -2.

2. Процесс лимитируется диффузионным переносом питательных веществ к поверхности клетки.

и

х

2

х

В данном варианте

и(х, С) = РС$, (и) = РС($) = Р^тЦ-•(х),

где в - коэффициент массообмена; $ - внешняя поверхность дрожжевой клетки.

2.1. Пусть N = 0, Бс = 0. В этом случае установившийся процесс возможен только при выполнении следующих условий:

($) ($)

Ут =1, = 1 у = '

Опираясь на данные равенства, решение уравнения (22) относительно функции ф(х) = /(x)/N можно представить в виде

<$) 1 | ф(v) = 2^~\ • , А ехр

(V) $ (V

( V )

\$;

-м Г

$ (V

—V

[0(х - х0) - 0(х - 2х0)],

(30)

где V = х/р (V - объем клетки, р - ее плотность).

В правую часть выражения (30) входит неизвестное соотношение ^ /^V , которое можно найти в явном виде, подчинив функцию ф(^ условию нормировки. Выполнив указанную процедуру, получим следующее соотношение:

(х) = _^2х° —х ($) 1п2 Г $ ’

(31)

х х0 (х) „ х0

из которого следует, что величины и — связаны простой зависимостью уу = 0,

($) $0 ($) $0

X = 0,929 - для клеток сферической и эллиптической формы; для клеток цилиндричес-

кой формы X ~ 1.

С учетом вышеизложенного не представляет особого труда определить такие величины, как С, М и N

х 1 2х;

С = Х-^-----, М = (С0 - С) •У, N = М/(х), (х) = Г хф(х)—х.

$„ Рт -1

0 ' х„

2.2. Пусть/0(х) = N08(x - х0), Бс = 0. Тогда для установившегося процесса справедливы нижеследующие выражения:

М = Мп + (С - С)У;

N = N

1 -1

1 - 21

/ (х)=N ■1 -1 $

ехр

( хА\

г —х

-а1 1_

$

•[0(х - х0) - 0(х - 2x0)],

где 1 = ехр

—х

-а11 — с

л

$

:0 /

, а1 =

РСт

(32)

(33)

(34)

1

В выражения (32)-(34) входит неизвестная величина С, которую следует определить из системы уравнений

(

урт^с2 -

(х)

Л

У + Мтрх-Н-

х

Н = РСт

(5>

1 + хо(1 - 2/) /2

С + УСо = о, Ыт = Мо + УСо,

, /2 =| йх • ехр -а11 —

5

хо /

Анализируя полученные результаты, можно сделать следующие выводы. Через достаточно большой промежуток времени, при постоянных Со и ^, в рассматриваемой системе может установиться динамическое равновесие. При этом система «забывает» свое начальное состояние, вследствие чего, в зависимости от лимитирующего фактора, в системе формируется тот или иной «универсальный» спектр масс дрожжевых клеток ф (х) = /(х) / N.

Выше предложена кинетическая теория процесса роста и размножения микроорганизмов в аппаратах периодического и непрерывного действия. Однако во многих практически важных задачах возникает потребность учитывать не только рост и размножение дрожжевых клеток, но и их гибель.

Восполним указанный пробел. Условимся считать мертвыми клетками те, которые потеряли способность к росту и размножению, но сохраняют свою первоначальную форму и массу.

Итак, пусть /(х, 0 - плотность функции распределения (дифференциальная функция распределения) числа живых (способных к размножению) микроорганизмов в момент времени t по массам х в единице объема аппарата; /р(х, 0 - плотность функции распределения числа мертвых клеток по массам х в единице объема аппарата в момент времени £ №Г (х, 0 - число гибнущих микроорганизмов в единице объема аппарата в момент времени t массой х; и(х, с, 0 - скорость роста микроорганизмов от х = хо до х = 2хо; С (0 - концентрация питательных веществ в аппарате в момент времени Р, N - число живых дрожжевых клеток в единице объема аппарата в момент времени t.

Предполагается, что при х = 2хо + о происходит мгновенное отделение дочерней клетки от материнской при равных массах. При массообменных процессах дрожжевая клетка рассматривается как миниатюрный биореактор идеального смешения. С учетом вышеизложенного, составляя баланс по числу частиц в единице объема аппарата, можно получить следующие кинетические уравнения, описывающие рассматриваемый процесс в проточном аппарате идеального смешения:

• для живых клеток

д/ +1 / + N Г(х, 0 + — дt t дх

д

и/--Г- Ос/

дх

= yN[28(х - х0 ]+- /0 (х, t);

для неразмножающихся клеток

д/р 1

+ -/р = NГ(х, t), дt т

(35)

(36)

где т = V/Q - среднее время пребывания элементов культуральной жидкости в аппарате; й - стохастический коэффициент (коэффициент «диффузии» в пространстве масс),

дБ г и

считается, что = о при хо < х < 2хо; и(х, с, I) > для всех х е |^хо, 2хо ^ у - величина,

характеризующая скорость поступления в систему дрожжевых клеток массой х = хо, образовавшихся при делении материнских клеток массой х = 2хо + о, численное значе-

х

ние величины у (при ограниченности функции Г (х, і) и/0(х0, і)) определяется из условия «самосогласования»:

уЫ =

и (х, о,і)-^ дх

/(х,і)Іх=2х - 0 (37)

5(() - дельта-функция Дирака;/р (х, 0 - плотность функции распределения числа дрожжевых клеток по массам х в единице объема входного потока в момент времени t.

Очевидно, что приведенных уравнений недостаточно для решения поставленной задачи, так как функция и зависит от величины С (0, которая сама подлежит определению. Поэтому для замыкания уравнений (35) и (36) следует воспользоваться законом сохранения вещества, опираясь на который можно получить недостающие уравнения:

— + 1С +--Шм =1С0; (38)

Л т У (х) т 0

11 г ^ 2х0 ^ /г т\

------+—М + N [ хГ(х, і)йх = — М0 + -Ц-М;

йі т 1 т (х)

х0 (39)

— 1 2?

-----р- + -М = N Ї хГ(х, і)йх,

йі т р :

х0 (40)

1

где У - экономический коэффициент; (и) = — | и(х, с, і)/(х, і)йх - средняя скорость

'■р

"х0

роста микроорганизмов в момент времени і; N = | х/(х, і)йх - средняя масса размно-

х0

жающихся клеток в аппарате в момент времени і; М = (х^Ы - масса живых дрожже-

2х0

вых клеток в единице объема аппарата в момент времени і; Ыр = | /р (х, і)йх - чис-

х0

ло мертвых дрожжевых клеток в единице объема аппарата в момент времени £

1 2х0

(х^ =-| х/р (х, t)йх - средняя масса мертвых микроорганизмов в аппарате в момент

Л Р х0

времени £ Мр = Лр - масса мертвых микроорганизмов в единице объема аппарата в момент времени £ С0 и М0 - концентрация питательных веществ и масса живых дрожжевых клеток в единице объема входного потока.

Уравнения (35)-(40) являются достаточно общими.

Так, при 1 = 0 они описывают изучаемый процесс в аппаратах периодического дейт 1 ствия идеального смешения. При — = 0 и t = г/и/, где г - пространственная координат

та, направленная вдоль оси аппарата, и - продольная скорость потока культуральной жидкости, преобразованные уравнения (35)-(40) будут описывать установившийся процесс роста, размножения и гибели дрожжевых клеток в проточном аппарате идеального вытеснения.

Система уравнений (35)-(40), несмотря на свою кажущуюся сложность, в практически интересных вариантах для установившегося процесса имеет достаточно простые решения [4]

Например, пусть ЛГ (х) = Г0/(х) = Г0/(х) = Г0Мф (х), где Г0 - постоянная величина; ф(х) - плотность функции распределения для спектра масс, нормированная на единицу.

Тогда решение системы уравнений (35)-(40) при/ = Бс = 0 для всех х е [х0,2х0 ] представимо в виде

ф( х )={<хМ5Ь) “р

-и}

{х)1 и (С, с)

[©(х - х0) -©(х - 2х0)],

где ©(г) - ступенчатая функция, ©(г) = 1 при г > 0 и ©(г) = 0 при г < 0;

/(х) = Лф(х); /р(х) = Лрф(х); Лр = Г0тЛ; Мр = Г0тМ; (х) = (х)р

Мр + М = (С0 - С^р )У; N = М /(х);

и ? — = >«2;

(х) { и(х,с)

(41)

(42)

“'и

(х} = 2 | йх - ехр

и; йС

/х\ J 1

(х)и(М

(43)

Уравнение для определения величины С = С_, где С_ - концентрация питательных веществ в аппарате при установившемся режиме, с учетом выражения (42) можно получить, воспользовавшись равенством

= 1 +Г т.

(44)

Так, если и(х, с) = ху(с), где у(с) - заданная функция от С, то (и^ = ^х^у(с). Подставляя данное значение (и^ в уравнение (44), получим уравнение для определения неизвестной величины С = С :

ту(с) = 1+Г0 т.

(45)

Если же и(х, с) = вс5, где в - коэффициент массообмена, 5 - внешняя поверхность растущей дрожжевой клетки, 5(х) = 5(х0 + £) = 5(х0) + 5(0; 5(х) = 50 - поверхность материнской клетки, 5(0 - поверхность дочерней клетки, то (и^ = рс^5 .

В данном варианте уравнение (44) преобразуется к виду

С=

1 +Г0 т М

Рт М ’

(46)

но в правую часть этого выражения входит неизвестная величина (х^/(5 . С другой стороны, из уравнения (42) следует, что

М = _^_ р]-^ = х ь.,

(5) (1п2) 0 50 + 5(у) 50

(47)

где р = (х^ /(V - удельная масса дрожжевой клетки. Ранее было показано, что X = 0,929 для сферических и эллиптических дрожжевых клеток, X = 1 - для цилиндрических клеток.

С учетом формулы (47) окончательное выражение (46) для определения величины С_ примет следующий вид:

1+Г т‘х" (48)

с„=:

Рт

0 ^. 5П

В связи с вышеизложенным:

• для первого варианта, когда у(с) = ———, где ц и К - постоянные величины,

К + С

с

2х

ф(х) = —0 [©(х - х0) - ©(х - 2х0)]; х

/(х) = Лф(х), /р (х) = Лрф(х);

(х) = (х)р = х021п2;

Ся= (1 + Г0 т)/ [цт т- (1 + Г0 т)];

• для второго варианта, когда и(х, с) = 0с5(у), для всех V е [v0,2v0], где 5(у) = 5(у0 +

V - У0) = 5(у0) + 5(у - У0),

2 [

ф(х)=/ \ / О еХР

(х)5^) I

[©(х - х0) -©(х - 2х0)]; vе[v0,2v0], /(х) = Лф(х);

/р(х) = Лрф(х), Лр = Г0тЛ, ^ = к^.

Не представляет принципиального труда для установившегося процесса с указанными выше ограничениями получить решение системы уравнений (35)-(40) и тогда, когда функция Г(х) имеет достаточно общий вид:

ЛГ(х) = Ф(х)/(х) = ЛФ(х)ф(х),

где Ф(х) - произвольная ограниченная функция на отрезке [х0, 2х0]. В этом варианте для функций/(х) и/р(х) имеют место нижеследующие представления:

2[1 + (Ф)т] I

ф(х) = -±-^^ехр

тМ (х, с) I

}>[©(х - х0) - (х - 2х0)];

/(х) = Лф(х), /р(х) = тЛФ(х)ф(х), Лр =тЛ(ф.

Откуда, при Ф(х) = Г0 с учетом условия (42), следуют ранее полученные результаты.

Замечание. Влияние флуктуации (коэффициента й) на процесс роста и размножения микроорганизмов, по-видимому, значительно только при М(х, с), близких к нулю. Однако данный случай обычно не представляет особого интереса в инженерной практике.

Таким образом, сформулированные в данной работе кинетические уравнения позволяют достаточно полно описывать эволюционные процессы роста, размножения и гибели дрожжевых клеток в биореакторах периодического и непрерывного действия.

Источники

1. Иванова А. А., Войно Л. И., Иванова И. С. Пищевая биотехнология. М. : Колос С, 2008.

2. Саришвили Н. Г., Рейтблат Б. Б. Микробиологические основы технологии шампанизации вина. М. : Пищепромиздат, 2000.

3. Пищиков Г. Б. Адсорбция дрожжевых клеток на контактных поверхностях продольно секционированных аппаратов шампанизации вина // Виноделие и виноградарство. 2009. № 6.

4. Пищиков Г. Б. Научное обоснование и разработка технологии, процессов и аппаратов шампанизации вина : дис. ... д-ра техн. наук. М., 2000.