CC BY
15
УДК 616.314.17-008.1+616.311.2-002]:611.018.2]-074-092.9
doi: 10.25298/2221-8785-2018-16-5-597-600
биохимические показатели соединительной ткани пародонта крыс при местном повреждении десны на
Фоне липополисахарид-индуцированного системного
воспалительного ответа
Елинская А. Н. (patofiziohg@umsa.edu.ua), Гришко Ю. М, Костенко В. А.
Высшее государственное учебное заведение Украины «Украинская медицинская стоматологическая академия», Полтава, Украина
Цель: оценка биохимических показателей соединительной ткани пародонта крыс (коллагена, протеогли-канов, гликопротеинов) при местном повреждении десны на фоне липополисахарид-индуцированного системного воспалительного ответа (СВО).
Материал и методы. В эксперименте на 40 белых крысах линии Вистар оценивали концентрацию продуктов коллагенолиза (свободного оксипролина), деполимеризации протеогликанов (гликозаминогликанов, ГАГ) и сиалогликопротеинов (N-ацетилнейраминовой кислоты, NANA) в мягких тканях пародонта (десна, периодон-тальная связка) и костной ткани альвеолярного отростка.
Результаты. Выявлено, что аппликация на десну 5% раствора гидроксида натрия на фоне СВО, индуцированного внутрибрюшинным введением липополисахарида Salmonella typhi (пирогенала) в дозе 0,4 мкг/кг массы трёхкратно в течение 1 недели и в течение следующих 7 недель - 1 раз в неделю - существенно увеличивает концентрацию свободного оксипролина, ГАГ и NANA в мягких и костной тканях пародонта, превышающую таковую при отдельном влиянии щёлочи и бактериального липополисахарида.
Выводы. Нанесение на десну местного повреждающего агента (раствора гидроксида натрия) в количестве, которое в обычных условиях не оказывает существенного гистолитического действия, на фоне липо-полисахарид-индуцированного СВО значительно усиливает в тканях пародонта реакции коллагенолиза, деполимеризации протеогликанов и сиалогликопротеинов в мягких и костной тканях пародонта.
Ключевые слова: системный воспалительный ответ, острый гингивит, биополимеры.
Введение
Известно, что основу соединительной ткани (СТ) составляет межклеточный матрикс, основными компонентами которого являются белки и полисахариды, образующие комплексы (протео-гликаны, гликопротеины и др.). Протеогликаны зрелой СТ пародонта содержат в основном суль-фатированные гликозаминогликаны (ГАГ) -хондроитин-4-сульфат, хондроитин-6-сульфат, дерматансульфат, гепарансульфат и кератан-сульфат [1]. Они обеспечивают стабилизацию и цементирование волокнистых структур, предохраняют клетки от проникновения микроорганизмов и их токсинов, регулируют водно-солевой обмен в тканях, участвуют в межклеточной сигнализации и регуляции активности факторов роста, в том числе и фактора роста фибробла-стов [1-3]. Среди волокнистых структур преобладают коллагеновые волокна. Межклеточный матрикс альвеолярной кости состоит на 90% из коллагена I типа. Другие биополимеры, главным образом протеогликаны, составляют 5% от общей массы. Протеогликаны декорин и бигликан и входящие в их состав сульфатированные ГАГ (хондроитинсульфат, дерматансульфат) играют важную роль в формировании костной ткани альвеолярного отростка [1].
Важным звеном патогенеза воспалительно-дистрофических заболеваний пародонта является деполимеризация биополимеров СТ и нарушение их ресинтеза [2, 4, 5]. С одной стороны, этому способствует выработка патогенными микроорганизмами экзотоксинов и гисто-
литических ферментов (гиалуронидазы, хон-дроитинсульфатазы, протеаз, глюкуронидазы, коллагеназы), что вызывает деполимеризацию коллагена, протеогликанов и гликопротеинов [4]. С другой стороны, деструкция СТ связана с эндогенной активацией матриксных металло-протеиназ (ММП), плазмина, реакции серино-вых протеиназ полиморфно-ядерных лейкоцитов и их фагоцитарной активности в ответ на выработку провоспалительных цитокинов [2, 4]. Эти механизмы обеспечивают разрушение тканей пародонта также при действии местных неинфекционных повреждающих агентов и при общих нарушениях в организме (нейрогенных, кардиоваскулярных, иммунных, эндокринных и метаболических). Так, к нарушениям структуры и функции пародонта приводит ряд соматических заболеваний, патогенез которых включает системный воспалительный ответ (СВО) [6-8]. Предполагается роль некоторых транскрипционных факторов (ОТ-кВ, АР-1, STAT-3 и др.) как связующего звена между системной патологией и заболеваниями пародонта [8, 9].
Однако совместное влияние местного и общего патогенных агентов на состояние СТ паро-донта исследовано недостаточно. В этих условиях можно ожидать изменения резистентности тканей пародонта к действию локальных раздражителей, следствием чего может быть агрессивный характер воспалительного процесса или же его хронизация.
Целью работы была оценка биохимических показателей СТ пародонта крыс (коллагена, про-
теогликанов, гликопротеинов) при местном повреждении десны на фоне липополисахарид-ин-дуцированного СВО.
Материал и методы
Исследования были проведены на 40 белых крысах линии Вистар массой 180-220 г, распределённых на 4 группы: 1-я включала интактных животных (контрольная), 2-я - после моделирования СВО, 3-я - после нанесения на десну местного повреждающего агента (щелочи), 4-я - аппликацию последней проводили на фоне моделирования СВО.
СВО воспроизводили путем внутрибрю-шинного введения липополисахарида (ЛПС) Salmonella typhi (препарат «Пирогенал», фирма «Медгамал», Россия) в дозе 0,4 мкг/кг массы трёхкратно в течение 1 недели и в течение следующих 7 недель - 1 раз в неделю [10]. В качестве местного патогенного фактора за 7 дней до забоя на десну наносили 5% раствор гидроксида натрия (NaOH) путем орошения в течение 10 с (модель острого гингивита).
Крыс декапитировали под эфирным наркозом. Комиссией по вопросам биомедицинской этики Высшего государственного учебного заведения Украины «Украинская медицинская стоматологическая академия» (протокол № 162 от 22.02.2018) нарушений морально-этических норм при проведении научно-исследовательской работы не выявлено. Объектами исследования были мягкие ткани пародонта (десна, периодонтальная связка) и костная ткань альвеолярного отростка.
Уровень деполимеризации коллагена, проте-огликанов и сиалогликопротеинов оценивали по содержанию их мономеров - свободного окси-пролина [11], ГАГ [12] и N-ацетилнейраминовой кислоты (NANA) [13], соответственно.
Статистические расчеты проводили с использованием программы "StatisticSoft 6.0". Для проверки распределения на нормальность применяли расчет критерия Шапиро-Уилка. Если данные соответствовали нормальному распределению, для их сравнения использовали критерий t
Таблица - Показатели деполимеризации биополимеров СТ десны и периодонтальной связки при действии местного и системного пародонтопагогенных факторов (М+т)
Группы опытов Свободный оксипролин, мкмоль/г Гликозаминогликаны, мкмоль/г N-ацетилнейраминовая кислота, мкмоль/г
Мягкие ткани Костная ткань Мягкие ткани Костная ткань Мягкие ткани Костная ткань
Интактные животные 4,08 ±0,48 3,06 ±0,28 1,93 ±0,34 1,70 ±0,30 4,56 ±0,17 2,01 ±0,35
Системное введение ЛПС 6,78 ±0,35 * 5,20 ±0,19 * 3,22 ±0,34 * 2,93 ±0,22 * 7,43 ±0,33 * 4,33 ±0,37 *
Местная аппликация ШОН 4,58 ±0,45 2,62 ±0,37 2,13 ±0,34 1,88 ±0,20 5,34 ±0,37 2,62 ±0,37
Аппликация №ОН на фоне СВО 9,02 ±0,43 7,12 ±0,10 */**/*** 4,14 ±0,25 */*** 3,74 ±0,19 */**/*** 10,87 ±0,35 */**/*** 6,62 ±0,23 */**/***
Примечание: * -р<0,05 при сравнении с данными интактных крыс; * - 2-й группы, *** - 3-й группы
Стьюдента для независимых выборок. В случае, когда ряды данных не подлежали нормальному распределению, статистическую обработку осуществляли с использованием непараметрического метода - теста Манна-Уитни.
Результаты и обсуждение
Моделирование СВО сопровождалось существенными изменениями концентрации мономеров биополимеров СТ как в мягких, так и костной тканях пародонта (табл.). Так, в его мягких тканях содержание свободного оксипролина, ГАГ и NANA увеличивалось на 66,2% (p<0,01), 66,8% (p<0,05) и 62,9% (p<0,001), соответственно, а в ткани альвеолярного отростка - на 69,9% (p<0,001), 72,4% (p<0,02) и 115,0% (p<0,01), соответственно, что свидетельствует об активации коллагенолиза, деполимеризации протеоглика-нов и сиалогликопротеинов.
Такие изменения связывают с выработкой активированными нейтрофилами и макрофагами, а также некоторыми другими клетками пародонта (эпителиоцитами десен, фибробластами, эндоте-лиоцитами, плазматическими клетками), ММП (коллагеназы, желатиназы, матрилизина, стро-мелизина) [2, 4]. Этому способствует продукция ряда провоспалительных цитокинов - фактора некроза опухолей а (ФНО-а), интерлейкинов (ИЛ) 1 и 6). Так, ФНО-а и ИЛ-ф стимулируют секрецию ММП 3, 8 и 9 фибробластами десны. Коллагено-литическая активность в тканях пародонта обеспечивается преимущественно ММП-8 [4].
Деструкция биополимеров СТ также может быть связана с развитием окислительно-нитроза-тивного стресса в тканях пародонта, что вызывает окислительную модификацию белков и углеводов или же индуцирует выработку гистолитических ферментов вследствие активации редокс-чув-ствительных транскрипционных факторов (NF-kB, AP-1, STAT-3 и др.) [8, 9]. NF-кВ-зависимые процессы, связанные с активатором рецептора NF-kB (RANK), его лигандом (RANKL) и ошибочным рецептором остеопротегерином, являются важными регуляторами резорбтивной активности остеокластов [4], что также может быть дополнительным звеном деструктивного процесса в костной ткани пародонта.
Ранее нами показано, что воспроизведение ЛПС-индуци-рованного СВО сопровождается увеличением продукции супероксидного анион-радикала в мягких тканях пародонта ми-тохондриальной и НАДФН-за-висимыми электронно-транспортными цепями микро-сом и NO-синтазы, а также НАДФН-оксидазой лейкоцитов [10]. Выявлены нарушения механизма ауторегуляции физиологической концентрации NO в тканях пародонта, что приводит к одновременному увеличению образования NO посредством
NO-синтазного и нитрат/нитрит-редуктазного механизма с последующим развитием окисли-тельно-нитрозативного стресса с увеличением концентрации пероксинитрита и активацией пе-роксидного окисления липидов [14].
В литературе подчеркивается, что активация гистолитических ферментов является важным механизмом хронизации воспалительно-дистрофических заболеваний пародонта [2].
Действительно, моделирование острого гингивита путём аппликации на десну 5% раствора NaOH на 7-й день после воздействия не оказывало существенного влияния на изучаемые показатели в мягких и костной тканях пародонта.
На 7-е сутки после воздействия щелочи на десну на фоне моделирования СВО концентрация свободного оксипролина превышала результаты во 2-й и в 3-й группах на 33,0% (p<0,01) и 96,9% (p<0,001) в мягких тканях пародонта. и на 36,9% (p<0,001) и 101,0% (p<0,001) в ткани альвеолярного отростка. Содержание ГАГ в мягких тканях пародонта было выше соответствующего значения в третьей группе на 94,4% (p<0,01), а в костной ткани - на 27,6% (p<0,05) и 98,9% (p<0,001) превосходило соответствующие результаты во 2-й и в 3-й группах. Концентрация NANA превышала результаты 2-й и 3-й групп
Литература
1. Ларионов, Е. В. Роль сульфатированных гликозами-ногликанов (сГАГ) в физиологии и патофизиологии тканей пародонта / Е. В. Ларионов, Т. А. Глыбина // Стоматология сегодня. - 2007. - № 2. - С. 52-53.
2. Pisoschi, C. Growth factors and connective tissue homeostasis in periodontal disease / C. Pisoschi, C. Stanciulescu, M. Banita // Pathogenesis and treatment of periodontitis / ed.: N. Buduneli. - London : InTech, 2012. - P. 55-80. -doi: 10.5772/33669.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
на 46,3% (p<0,001) и 103,0% (p<0,001) в мягких тканях пародонта, на 52,9% (p<0,001) и 152,0% (p<0,001) в ткани альвеолярного отростка.
Согласно полученным результатам, моделирование СВО создает условия для более интенсивной дезорганизации СТ пародонта при их местном поражении химическим агентом. Это сопровождается выявленной нами активацией процесса деполимеризации коллагена, протео-гликанов и гликопротеинов, что существенно усиливается в условиях окислительно-нитроза-тивного стресса, связанного с активацией NF-kB [8]. Следствием этого может быть агрессивное течение пародонтита с инволюцией пародонта, беспрепятственной генерализацией воспалительного процесса и резорбцией альвеолярного отростка челюстей [15, 16].
Таким образом, нанесение на десну местного повреждающего агента (щёлочи) в количестве, которое в обычных условиях не оказывает существенного гистолитического действия, на фоне липополисахарид-индуцированного системного воспалительного ответа значительно усиливает в тканях пародонта реакции коллагенолиза, деполимеризации протеогликанов и сиалоглико-протеинов в мягких и костной тканях пародонта.
/ R. Ambili, P. Janam // J. Indian Soc. Periodontal. -2017. - Vol. 21, № 5. - P. 350-356. - doi: 10.4103/jisp. jisp_301_16.
10. Yelinska, A. M. Sources of production of reactive oxygen and nitrogen species in tissues of periodontium and salivary glands of rats under modeled systemic inflammation / A. M. Yelinska, O. O. Shvaykovska, V. O. Kostenko // Проблеми екологи та медицини. - 2017. - Т. 21, N° 3-4. - P. 51-54.
11. Тетянец, С. С. Метод определения свободного
Островский, О. В. Биохимия полости рта : учебное пособие / О. В. Островский, В. А. Храмов, Т. А. Попова ; под ред. О. В. Островского. - Волгоград : ВолГМУ, 2010. - 184 с.
Host response mechanisms in periodontal diseases / N. Silva [et al.] // J. Appl. Oral Sci. - 2015. - Vol. 23, № 3. - P. 329-355. - doi: 10.1590/1678-775720140259. Inflammatory and immune pathways in the pathogenesis of periodontal disease: review / A. Cekic [et al.] // Periodontology 2000. - 2014. - Vol. 64, № 1. - P. 57-80. - doi: 10.1111/prd.12002.
Проданчук, А. I. Захворювання пародонта i соматична патолопя / А. I. Проданчук, I. Д. Ююн, М. О. Кройтор // Буковинський медичний вюник. - 2012. - T. 16, № 2. - С. 164-168.
Gurav, A. N. The association of periodontitis and metabolic syndrome / A. N. Gurav // Den. Res. J. (Isfahan). - 2014. -Vol. 11, № 1. - P. 1-10.
Ляшенко, Л. I. Роль транскрипцшного ядерного фактора kB у мехашзмах порушень вшьнорадикальних процеав i дезоргашзаци сполучно! тканини пародонта за умов експериментального мегаболiчного синдрому / Л. I. Ляшенко, С. В. Денисенко, В. О. Костенко // Актуалью проблеми сучасноi медицини. BicHUK Украгнськог медичног стоматологiчноi академи. -2014. - Т. 14, № 1. - С. 97-100.
Ambili, R. A critique on nuclear factor-kappa B and signal transducer and activator of transcription 3: The key transcription factors in periodontal pathogenesis
оксипролина в сыворотке крови / С. С. Тетянец // Лабораторное дело. - 1985. - № 1. - С. 61-62.
12. Метод определения гликозаминогликанов в биологических жидкостях / П. Н. Шараев [и др.] // Лабораторное дело. - 1987. - № 5. - С. 330-332.
13. Беркало, Л. В. Методи клгшчних та експеримен-тальних дослщжень в медицин / Л. В. Беркало, О. В. Бобович, Н. О. Боброва ; за ред. I. П. Кайдашева. - Полтава : Полiмет, 2003. - 320 с.
14. Yelinska, A. M. Lipid peroxidation and antioxidant protection in periodontal tissues under the action of local pathogenic factor on gums in rats exposed to modeled systemic inflammatory response / A. M. Yelinska, V. O. Kostenko // Проблеми еколог!! та медицини. -2017. - Т. 21, № 5-6. - С. 62-64.
15. Тарасенко, Л. М. Стресс и пародонт / Л. М. Тарасенко, Т. А. Петрушанко. - Полтава, 1999. - 189 с.
16. Слгнська, А. М. Мехашзми дезоргашзаци сполучно! тканини пародонта щургв за умов системного запалення / А. М. Слшська, В. О. Костенко // Актуальна проблеми сучасног медицини. Вкник Украгнськог медичног стоматологiчноi академп. - 2018. - Т. 18, № 1. - С. 175-177.
References
1. Larionov EV, Glybina TA. Rol sulfatirovannykh gliko-zaminoglikanov (sGAG) v fiziologii i patofiziologii tka-nei parodonta [The role of sulfated glycosaminoglycans (sGAG) in the physiology and pathophysiology of peri-
odontal tissues]. Stomatologiia segodnia. 2007;(2):52-53. (Russian).
2. Pisoschi C, Stanciulescu C, Banita M. Growth factors and connective tissue homeostasis in periodontal disease. In: Buduneli N, editor. Pathogenesis and treatment of periodontitis. London: InTech; 2012. p. 55-80. doi: 10.5772/33669.
3. Ostrovskii OV, Khramov VA, Popova TA; Ostrovskii OV, editor. Biokhimiia polosti rta [Biochemistry of the oral cavity]. Volgograd: VolGMU; 2010. 184 p. (Russian).
4. Silva N, Abusleme L, Bravo D, Dutzan N, Garcia-Sesnich J, Vernal R, Her^ndez M, Gamonal J. Host response mechanisms in periodontal diseases. J. Appl. Oral Sci. 2015;23(3):329-355. doi: 10.1590/1678-775720140259.
5. Cekici A, Kantarci A, Hasturk H, Van Dyke TE. Inflammatory and immune pathways in the pathogenesis of periodontal disease. Periodontology 2000. 2014;64(1):57-80. doi: 10.1111/prd.12002.
6. Prodanchuk AI, Kiiun ID, Kroitor MO. Zakhvoriuvannia parodonta i somatichna patologiia [Periodontopathy and somatic pathology]. Bukovinskii medichnii visnik [Bukovinian Medical Herald Journal ]. 2012;16(2):164-168. (Ukrainian).
7. Gurav AN. The association of periodontitis and metabolic syndrome. Den. Res. J. (Isfahan). 2014 Jan;11(1):1-10.
8. Liashenko LI, Denisenko SV, Kostenko VO. Rol tran-skrypcijnogo jadernogo faktora kB u mehanizmah porush-en vilnoradykalnyh procesiv i dezorganizacii spoluchnoi tkanyny parodonta za umov eksperymentalnogo metabol-ichnogo syndromu [Role of transcription nuclear factor kB in mechanisms of free radical processes impairment and connective tissue disorganization in periodontium under modeled metabolic syndrome]. Aktualni proble-my suchasnoi medycyny. Visnyk Ukrainskoi medychnoi stomatologichnoi akademii [Actual Problems of the Modern Medicine]. 2014;14(1):97-100. (Ukrainian).
9. Ambili R, Janam P. A critique on nuclear factor-kappa B and signal transducer and activator of transcription 3: The key transcription factors in periodontal pathogenesis.
J. Indian Soc. Periodontal. 2017;21(5):350-356. doi: 10.4103/jispjisp_301_16.
10. Yelinska AM, Shvaykovska OO, Kostenko VO. Sources of production of reactive oxygen and nitrogen species in tissues of periodontium and salivary glands of rats under modeled systemic inflammation. Problemy ekologii ta medycyny [The Medical and Ecological Problems]. 2017;21(3-4):51-54.
11. Tetyanets SS. Metod opredelenija svobodnogo oksiprolina v syvorotke krovi [Method for the determination of free hydroxyproline in serum]. Laboratornoe delo. 1985;1:61-2. (Russian).
12. Sharaev PN, Pishkov VN, Solovyeva NI, Shirokova TJu, Solovyeva TV, Zvorygina NG, Solopaev AA, Alekseeva NK. Metod opredelenija glikozaminoglikanov v biolog-icheskih zhidkostjah [Method for the determination of glycosaminoglycans in biological fluids]. Laboratornoe delo. 1987;5:330-332. (Russian).
13. Berkalo LV, Bobovych OV, Bobrova NO; Kajdashev IP, editor. Metody klinichnyh ta eksperymentalnyh doslidzhen v medycyni [Methods of clinical and experimental research in medicine]. Poltava: Polimet; 2003. 320 p. (Ukrainian).
14. Yelinska AM, Kostenko VO. Lipid peroxidation and anti-oxidant protection in periodontal tissues under the action of local pathogenic factor on gums in rats exposed to modeled systemic inflammatory response. Problemy ekologii ta medycyny [The Medical and Ecological Problems]. 2017;21(5-6):62-64.
15. Tarasenko LM, Petrushanko TA. Stress i parodont [Stress and periodontium]. Poltava; 1999. 189 p. (Russian).
16. Yelinska AM, Kostenko VO. Mehanizmy dezorganizacii spoluchnoi tkanyny parodonta shhuriv za umov system-nogo zapalennja [Mechanisms of connective tissue disruption in periodontium rats during systemic inflammation]. Aktualni problemy suchasnoi medycyny. Visnyk Ukrainskoi medychnoi stomatologichnoi akademii [Actual Problems of the Modern Medicine]. 2018;18(1):175-177. (Ukrainian).
biochemical indicators of connective tissue in rat periodontium in local gum damage under lipopolisacharide-induced systemic
inflammatory response
Yelinskaya A. N, GrishkoYu. M, Kostenko V. A. Higher State Educational Institution of Ukraine "Ukrainian Medical Stomatological Academy",
Poltava, Ukraine
Objectives: To assess the biochemical indicators of the connective tissue of rat periodontium (collagen, proteoglycans, glycoproteins) in local gum damage associated with lipopolysaccharide-induced systemic inflammatory response (SIR).
Material and methods: The experiment involving 40 white Wistar rats was designed to evaluate the concentration of products of collagenolysis (free hydroxyproline), and the depolymerization of proteoglycans (glycosaminoglycans, GAG) and sialoglycoproteins (N-acetylneuraminic acid, NANA) in soft tissues of the periodontium (gum, periodontal ligament) and bone tissue of the alveolar process.
Results. It has been found out that the application of 5% sodium hydroxide solution onto the gums during SIR induced by intraperitoneal injection of Salmonella typhi lipopolysaccharide (pyrogenal) in a dose of 0.4 jug/kg of weight three times during the 1st week and once a week for the next 7 weeks significantly increases the concentration offree hydroxyproline, GAG and NANA in the soft and bone periodontal tissues, exceeding that of a separate effect produced by alkali and bacterial lipopolysaccharide.
Conclusions. The application of a local damaging agent (sodium hydroxide solution) to the gums in amount that in normal conditions does not produce any significant histological effect, can significantly enhance collagenolysis, depolymerization of proteoglycans and sialoglycoproteins in the soft and bone periodontal tissues in the presence of lipopolysaccharide-induced systemic inflammatory response.
Keywords: systemic inflammatory response, acute gingivitis, connective tissue biopolymers, collagen, proteoglycans, glycoproteins, parodontium.
Поступила: 31.05.2018 Отрецензирована: 19.09.2018
