CC BY
15Токсикологический вестник № 2 (11 з)
ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ
токсикология
В связи с многочисленными просьбами авторов и читателей редакция журнала «Токсикологический вестник» информирует о том, что со второго номера на страницах журнала открывается самостоятельный раздел «Экологическая токсикология». Учитывая широкий профиль научных и практических интересов в области экологической токсикологии, редакция оставляет за собой право принятия решения о целесообразности включения присылаемых экотоксикологических работ в этот раздел.
УДК 591.11.05
Биохимические показатели крови сеголеток карпа при развитии оксидативного стресса под влиянием ионов марганца
Мусаев Б.С., Рабаданова А.И., Мурадова Г.Р., Маржиева А.З.
Дагестанский государственный университет, г. Махачкала
Изучено влияние хронической интоксикации ионами марганца на биохимические показатели крови сеголеток карпа (содержание общего белка, альбуминов, мочевины, общих липидов и холестерина, малонового диальдегида, активность каталазы, аланин-и аспартатаминотрансфераз и общая антиоксидантная активность сыворотки крови). Обнаруженные отклонения изученных показателей от нормы позволяют использовать их в качестве чувствительных маркеров.
Ключевые слова: биохимические показатели, марганец, кровь, карп.
Введение. В связи с ростом масштабов добычи и переработки сырья, содержащего тяжелые металлы, и их применением в различных сферах человеческой деятельности прогрессивно возрастает загрязнение окружающей среды тяжелыми металлами [2,13].
Среди различных солей тяжелых металлов имеются высокотоксичные, условноток-сичные и эссенциальные. Однако при избыточном поступлении в организм солей даже эссенциальных микроэлементов они оказывают токсическое действие. Например, марганец как микроэлемент препятствует свободно-радикальному окислению, обеспечивает стабильность структуры клеточных мембран, нормальное функционирование мышечной ткани, повышает интенсивность утилизации жиров, снижает уровень липидов в организме, необходимый для нормального роста и развития организма. Вместе с тем, при хроническом отравлении соединения марганца выступают как цитоплазматические яды, способные вызывать тяжелые нарушения в нервной системе, почках и органах кровообращения [5].
Отравление рыб марганцем характеризуется их беспокойством, просветлением окраски туловища, уменьшением чувствительности к раздражителям, атаксией. Кожа и жабры рыб, погибших от отравления солями марганца, приобретают буро-коричневую окраску. При гистологических исследованиях обнаруживаются дистрофия, некроз и слущивание эпителия жаберных лепестков и кожи [11].
Первичные критические нарушения в функционировании живых организмов под действием загрязняющих веществ возникают на биохимическом уровне, за ними следуют изменения химического состава клеток, нарушение процессов дыхания, роста и размножения организмов, возможны мутации и канцерогенез; у рыб нарушается движение и ориентация в воде.
Влияние солей марганца на метаболические процессы, происходящие в организме рыб, при их хроническом действии изучено недостаточно. В связи с этим представляется актуальным изучение биохимических показателей крови как маркеров развития оксида-тивного стресса в организме сеголеток карпа при интоксикации водной среды ионами Mn2+, поскольку известно, что одним из механизмов токсичности соединений тяжелых металлов является развитие окислительного стресса.
Материал и методы исследования. Работа выполнена на базе лаборатории физиологии человека и животных и ихтиологии Дагестанского государственного университета. В эксперименте использованы сеголетки карпа Cyprinus carpio (Linnaeus, 1758) массой 100150 г, выращенные в прудах рыбоводного комбината республики Дагестан, которые перед переброской в пруды для зимовки, отлавливались и переносились в аквариумы объемом 300 литров с содержанием сульфата марганца 0.1 мг/дм3 (ПДК - 0.01 мг/дм3) [4].
Контролем служили рыбы, содержавшиеся в чистой воде. В аквариумах создавались условия постоянного температурного (19-23°С) и газового режима. Кормили рыб живым трубочником Tubifex tubifex.
В сыворотке крови исследовали общую антиоксидантную активность (ОАА) [7], активность каталазы [8], кислотную резистентность эритроцитов [7], динамику содержания малонового диальдегида (МДА) [1], общих липидов, холестерина, мочевины, общего белка и альбуминов [16], активности АЛТ и АСТ [7] в разные сроки экспозиции рыб в водной среде с ионами марганца (5, 15, 30 и 40 дни эксперимента).
Полученные результаты подвержены вариационно-статистической обработке методом малой выборки [9].
Результаты и обсуждение. Результаты исследований представлены на рисунках 1-3. Установлено, что в сыворотке крови сеголеток карпа, находившихся под воздействием сульфата марганца, происходит активация процессов перекисного окисления липидов, о чем судили по повышению концентрации малонового диальдегида, а также угнетению ферментативного звена антиоксидантной защиты.
Так, если в норме у сеголеток карпа содержание МДА составило 15,03 нМоль/л, то на
5 и 15 дни экспозиции в водной среде с ионами Мп2+ рассматриваемый показатель повысился на 9,2 и 40,0% соответственно, а на 30 и 40 дни - на 46,7% (рис. 1).
Повышение содержания МДА в сыворотке крови сеголеток карпа сопровождается незначительным снижением каталазной активности на всех сроках экспозиции с ионами марганца. Общая антиоксидантная активность повышается на начальных стадиях эксперимента (на 5 и 15 дни на 37,5 и 40,6% соответственно), что коррелирует с ингибирова-нием каталазной активности. Дальнейшее пребывание сеголеток карпа в водной среде с ионами марганца до 30 и 40 дней приводит к понижению ОАА соответственно на 8,1 и 25,0% (рис. 1).
Известно, что накопление продуктов перекисного окисления липидов служит пусковым механизмом модификации клеточных мембран: образующиеся гидроперекиси нарушают регулярную упаковку мембранных липидов и могут вызвать неконтролируемое увеличение проницаемости клеточных мембран, приводящее к некрозу и апоптозу клеток [3].
О состоянии эритроцитарных мембран, как интегрального показателя мембран организма, судили по резистентности эритроцитов к действию гемолитика [10].
На рисунке 2 отражены эритрограммы кислотной резистентности в норме и при действии сульфата марганца.
Эритрограмма контрольных рыб одновершинна и ее максимум приходится на 1.5 мин. В этой точке гемолизирует 30,7% эритроцитов. Продолжительность гемолиза составляет 6,5 мин. Размах основания пика - 2,5 мин. В крови у контрольных рыб наиболее многочисленной является среднестойкая популяция эритроцитов (58,8%). На долю низко- и высокостойких эритроцитов приходится 0,2 и 37,8% соответственно.
При пребывании рыб в среде с ионами марганца в течение 5 суток сдвига эритро-граммы не наблюдается, однако, отмечается повышение доли эритроцитов, подвергшихся гемолизу на пике эритрограммы до 57,1%. Продолжительность кислотного гемолиза сокращена до 3,5 мин, размах основания пика составляет 2 мин. В этот период отмечается преобладание среднестойких (60,2%) эритроцитов. Доля высокостойких эритроцитов снижается до 1,8%, а низкостойких - повышается до 37,4%.
Кислотная эритрограмма сеголеток карпа, подвергшихся воздействию сульфата марганца в течение 15 суток, существенно отличается от ранее рассмотренных эритрограмм. Отличие выражается в левом сдвиге эритрограммы до 1 мин, увеличении продолжительности до 8,5 мин, снижении по сравнению с 5 днем доли эритроцитов, подвергшихся гемолизу на пике эритрограммы (44,9%) и увеличении числа высокостойких эритроцитов (49,6%) как относительно контроля, так и 5 дня эксперимента.
Эритрограммы, полученные на 30 и 40 дни, имеют схожий вид: сокращена ее продолжительность до 2,5 - 3,0 мин, пик приходится на 1 мин, число гемолизированных эритроцитов на пике составляет 92,4 - 90,0%, отмечается также преобладание низкостойких эритроцитов (рис. 2).
Полученные результаты о резистентности эритроцитов свидетельствуют, о значительных качественных изменениях состава эритроцитарной популяции сеголеток карпа, подвергшихся хроническому воздействию сульфатом марганца. Преобладание в популяции эритроцитов с низкой кислотной резистентностью указывает на ее значительное старение, которое может быть связано с деструктивными процессами, развивающимися в эритроци-тарных мембранах в условиях хронической интоксикации организма сульфатом марганца.
Спровоцированное окислительным стрессом повреждение мембран эритроцитов может привести к ухудшению их реологических свойств, снижению деформируемости и повышению адгезивности, развитию анемии и гипоксии, усугубляющих первичную патологию. Хорошо известно, что при различных окислительных воздействиях на эритроциты наблюдается окисление и денатурация гемоглобина, сопровождающиеся высвобождением гемма/гемина, который хорошо встраивается в мембрану, дестабилизируя ее и вызывая гемолиз [15].
27
МАРТ - АПРЕЛЬ 2012
В условиях деструкции эритроцитарных мембран следовало бы ожидать появление более высокого фона активности каталазы в сыворотке крови, поскольку фермент присутствует, главным образом, в эритроцитах крови. Снижение активности каталазы в сыворотке по отношению к норме, свидетельствует о подавлении его активности в ответ на хроническую интоксикацию организма сульфатом марганца. Марганец конкурирует с железом, который, как известно, входит в активный центр каталазы. Не исключено также ингибирующее влияние на активность фермента продуктов перекисного окисления липидов.
Наблюдаемые изменения могут сопровождаться целым рядом негативных процессов, связанных с дезинтеграцией клеточных структур, ведущей в конечном итоге к патологическим изменениям в функциональных системах организма сеголеток карпа [6].
Определенный вклад в развитие окислительного стресса вносит падение уровня общего белка и альбуминов, что связано с участием альбуминов в транспорте и регуляции уровня продуктов перекисного окисления липидов, предупреждая воздействие избыточных эндогенных перекисей на клеточные и субклеточные структуры [7].
По нашим данным на 5, 15 и 40 дни опыта общее количество общего белка снижается на 33,3; 12,5 и 16,7% соответственно по сравнению с нормой, а на 30 день отмечается незначительное его повышение. Содержание альбуминов в сыворотке крови снижается на 15,0 и 10,0% соответственно (на 5 и 15 дни по сравнению с контролем) и практически соответствует контролю на последующих стадиях эксперимента (рис. 3).
Важным энергетическим субстратом, играющим большую роль в процессах адаптации к действию ксенобиотиков и других вредных факторов среды, являются липиды рыб, которые способны нейтрализовать токсический эффект и восстанавливать поврежденные клетки внутренних органов.
На протяжении всего опыта в крови сеголеток карпа отмечено повышенное содержание общих липидов по сравнению с контролем: на 5, 15, 30 и 40 дни на 57,8; 83,8; 42,4 и 23,5% соответственно (рис. 3).
На начальных этапах опыта (5 и 15 день) наблюдается снижение количества общего холестерина (на 32,9 и 39,2% соответственно), к концу опыта его уровень приближается к контролю. Можно предположить, что марганец приводит к блокировке молекулярных механизмов биосинтеза холестерина (рис. 3).
Существует представление, что холестерин может проявлять антиоксидантные свойства, а также, имея в своей структуре двойную связь, включается в процесс в качестве субстратного окисления. Холестерин легко образует комплекс с солями марганца, в них на 2 молекулы холестерина приходится 1 молекула соли [12].
Снижение уровня холестерина в сыворотке крови связано, вероятно, с усиленной мобилизацией липидов в условиях развивающейся марганцевой интоксикации. Это состояние можно квалифицировать как катаболический стресс.
Наблюдаемые нами фазные изменения в содержании холестерина и общих липидов, очевидно, отражают предадаптационные изменения в соотношении липидных компонентов клеточных мембран, связанных со значительными энергетическими тратами в условиях токсического стресса.
О развитии деструктивных процессов при интоксикации рыб сульфатом марганца свидетельствует также снижение активности аминотрансфераз в сыворотке крови. Активность АЛТ и АСТ снижается на протяжении всего эксперимента. Так, на 5 день опыта их активность снижена на 48,4 и 59,6% и на 40 день - на 54,2 и 65,7% соответственно по сравнению с контролем (рис. 3).
Ионы Мп2+ в концентрации 0.1 мг/дм3, вероятно, оказывают ингибирующее влияние на активность ферментов, которое может быть связано с конкуренцией металла за место связывания в активном или аллостерическом центре, взаимодействуя с различными группами белковой молекулы. Ингибирующее влияние ионов Мп2+ на активность фермента может быть также связано с изменением растворимости субстратов при высоких концентрациях солей.
Снижение активности АСТ, преимущественно митохондриального фермента, наряду с АЛТ, сосредоточенного главным образом в цитозоле, может свидетельствовать о глубоких изменениях в структуре клеток внутренних органов при марганцевой интоксикации.
Важным показателем интенсивности катаболических процессов с вовлечением белков является мочевина. Обнаруженное при марганцевой интоксикации снижение содержания мочевины на 5, 15, 30 и 40 дни на 17,4; 21,7; 47,8 и 48,0% соответственно указывает на развитие белковой дистрофии у сеголеток карпа. Сама мочевина малотоксична, но токсичны накапливающиеся с ней продукты, поэтому ее можно рассматривать в качестве маркера интоксикации.
Снижение уровня мочевины отражает активное использование аминогрупп в условиях дефицита белка. Понижение содержания мочевины крови имеет место при печеночной недостаточности, что связано с нарушением синтеза мочевины в печени [14].
Таким образом, анализ полученных результатов совместно с литературными данными позволяет заключить, что ионы Мп2+ в концентрации 0,1 мг/дм3 являются стрессовым фактором, изменяющим многие биохимические показатели крови сеголеток карпа и активирующим свободнорадикальное окисление.
Выводы. При хронической интоксикации водной среды сульфатом марганца в течение 40 суток отмечается активация процессов ПОЛ в сыворотке крови и общей антиокси-дантной активности, при этом снижается активность каталазы. Активация процессов ПОЛ сопровождается снижением устойчивости эритроцитов к кислотному гемолизу. Оно проявилось в сдвиге эритрограммы за счет преобладания в эритроцитарной популяции низкостойких эритроцитов. Выявлены изменения состава белков сыворотки крови: отмечается повышение содержания общего белка на 5 день эксперимента и его снижение в последующие этапы; уровень альбуминов прогрессивно снижается на каждом этапе экспериментального исследования. На начальных этапах эксперимента под воздействием сульфата марганца в сыворотке крови сеголеток карпа содержание холестерина снижается, падает также активность АЛТ и АСТ, понижается уровень мочевины и повышается количество общих липидов на всем протяжении опыта.
□ 5-й день
15-й день □ 30-й день ■ 40-й день
Рис. 1. Изменение показателей окислительно-антиоксидантной системы крови сеголеток карпа при действии сульфата марганца в зависимости от длительности интоксикации (в % по отношению к контролю): 1 - малоновый диальдегид; 2 - активность каталазы; 3 - общая антиоксидантная активность.
28
Токсикологический вестник № 2 (11 з)
Рис. 2. Изменение устойчивости эритроцитов крови сеголеток карпа к действию сульфата марганца в зависимости от длительности интоксикации водной среды.
29
МАРТ - АПРЕЛЬ 2012
30
Токсикологический вестник № 2 (11 з)
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Андреева Л.И., Кожемякин А.А., Кишкун А.А. Модификация метода определе-ния перекисей ли-пидов в тесте с тиобарбитуровой кислотой // Лаб. дело, 1988. № 11. - С. 41-43.
2. Будников Г.К. Тяжелые металлы в экологическом мониторинге водных систем // Соросовский об-разоват. журн. Биология, 1998. Т. 7. № 5. - С. 23 - 29.
3. Владимиров Ю.А. Свободнорадикальное окисление липидов и физиологические свойства липид-ного слоя биологических мембран // Биофизика, 1987. Т. 32. № 5. - С. 830 - 844.
4. Волошина Г.В. Экологическая оценка состояния поверхностных вод реки Пону-ра // Эколог. вест. Север. Кавказа, 2006. Т. 2. № 1. - С. 118 - 122.
5. Давыдова С.Л. О токсичности ионов металлов // Химия, 1991. № 3. - С. 121 - 123.
6. Казимирко В.К., Мальцев В.И., Бутылин В.Ю., Горобец Н.И. Свободноради-кальное окисление и антиоксидантная терапия. - К.: Морион, 2004. - 160 с.
7. Камышников В.С. Справочник по клинико-биохимическим исследованиям и ла-борагорной диагностике / В.С. Камышников. 2-е изд. - М.: МЕДпресс-информ., 2004. - 910 с.
8. Королюк М.А., Иванова Л.Н., Майорова Л.Г., Токарев В.Е. Метод определения активности катала-зы // Лаб. дело, 1988. № 1. - С. 16 - 19.
9. Лакин Т.Б. Биометрия. - М.: Высшая школа, 1990. - 352 с.
10. Леонова В.Г. Анализ эритроцитарных популяций в онтогенезе человека. - Но-восибирск: Наука, 1987. - С. 241.
11. Мелякина Э.И. Эколого-физиологические особенности видовых адаптаций карповых рыб к низкому уровню микроэлементов в водных экосистемах: Дис... канд. биол. наук. - Астрахань, 1984.
- 224 с.
12. Момыналиев К.Т., Говорун В.М., Панасенко О.М., Сергиенко В.И. Участие хо-лестерина в гипох-лорит - индуцированном окислении холестерин - фосфатидилхолиновых липосом // Бюлл. эксперим. биол. и мед. биофизика и биохимия, 1996. № 5. - С. 516 - 519.
13. Пурмаль А.П. Антропогенная токсикация планеты // Соросовский образоваг. журн. Химия, 1998. № 9. - С. 39 - 51.
14. Рудницкий Л.В. О чем говорят анализы? / Л.В. Рудницкий. С.-П.: Питер-Пресс, 2007. - 156 с.
15. Щербаченко И.М. Модифицированные окислением эритроциты как экспериментальная модель для оценки активности антиоксидантов: Автореф. дис... канд. биол. наук. - Москва, 2008. - 21 с.
16. Lowry D.H., Rosebrough H.J., Fair A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folinphenol reagent // J. Biol. Chem., 1951. V 193. - P. 265 - 275.
Musayev B.S., Rabadanova A.I., Muradova G.R., Marhiyeva A.Z.
Biochemical blood indicators in carps young-of the year under oxidative stresses caused by manganese ions
Dagestan State University, Makhachkala
The influence of chronic intoxication by manganese ions on carps young-of-the year blood was studied including general proteins and albumins, urea, general lipids and cholesterine, malonic dialdehyde, activity of catalase, ALT and AST, general antioxidant activity of blood serum. Found out deviations from standard values in indicators studied could be used as sensory markers.
Материал поступил в редакцию 4.10.2010 г.
31
