Научная статья на тему 'Биохимические маркеры повреждения почечных тканей при экспериментальном оксалатном нефролитиазе'

Биохимические маркеры повреждения почечных тканей при экспериментальном оксалатном нефролитиазе Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

CC BY
123
21
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
оксалатный нефролитиаз / γ-глутамилтрансфераза / малоновый диальдегид / циклооксигеназа-1. / oxalate nephrolithiasis / γ-glutamyltransferase / malonic dialdehyde / cyclooxygenase-1.

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Якушев Николай Николаевич, Мадонов Павел Геннадьевич, Атабаева Ольга Шукурулловна

Целью исследования явилось изучение динамики активности γ-глутамилтрансферазы и концентрации циклооксигеназы-1 в моче и динамики концентрации малонового диальдегида в почечной ткани крыс при экспериментальном оксалатном нефролитиазе. Эксперименты проведены на 15 самцах крыс сток Вистар возрастом 2-3 месяца и весом 180-220 г. Оксалатный нефролитиаз моделировался на протяжении 6 недель в соответствии с общепринятой этиленгликолевой моделью. До начала эксперимента, а также по прошествии 3 и 6 недель производился сбор мочи, в которой определялась активность γ-глутамилтрансферазы (ГГТ) и концентрация циклооксигеназы-1 (ЦОГ-1). По завершении 6 недель в гомогенате почечной ткани определяли концентрацию тиобарбитуратреактивных продуктов (ТБРП). Результаты экспериментов показали, что активность ГГТ в моче после 6 недель моделирования нефролитиаза увеличилась в 6,6 раза, концентрация ТБРП в гомогенате почек относительно уровня здоровых крыс увеличилась в 1,3 раза, а также наблюдалась тенденция к росту концентрации в моче ЦОГ-1 в 1,7 раза. При экспериментальном оксалатном нефролитиазе наблюдается рост активности биохимических маркеров литогенеза – ГГТ и ТБРП. Это свидетельствует о развитии повреждающего фактора в почках, в основе которого лежит активация перекисного окисления липидов.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Якушев Николай Николаевич, Мадонов Павел Геннадьевич, Атабаева Ольга Шукурулловна

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

The aim of the research was to study the dynamics of γ-glutamyltransferase activity and cyclooxygenase-1 concentration in urine and the dynamics of malonic dialdehyde concentration in rat kidney tissue under experimental oxalate nephrolithiasis. Experiments were performed on 15 male Wistar rats aged 2-3 months and weighing 180-220 g. Oxalate nephrolithiasis was modeled for 6 weeks in accordance with the generally accepted ethylene glycol model. Prior to the start of the experiment, and after 3 and 6 weeks, urine collection was performed, in which γ-glutamyl transferase (GGT) activity and cyclooxygenase-1 (COX-1) concentration were determined. At the end of 6 weeks in the homogenate of renal tissue, the concentration of thiobarbituractivative products (TPBP) was determined. The results of the experiments showed that the activity of GGT in the urine after 6 weeks of nephrolithiasis simulation increased 6.6-fold, the concentration of TBP in the kidney homogenate relative to the level of healthy rats increased 1.3-fold, and there was a tendency to increase the concentration in the urine of COX-1 in 1.7 times. Experimental oxalate nephrolithiasis shows an increase in activity of biochemical markers of lithogenesis GGT and TPBP. This indicates the development of a damaging factor in the kidneys, which is based on the activation of lipid peroxidation.

Текст научной работы на тему «Биохимические маркеры повреждения почечных тканей при экспериментальном оксалатном нефролитиазе»

УДК 616.613-003.7:616.151-07

БИОХИМИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ ПОВРЕЖДЕНИЯ ПОЧЕЧНЫХ ТКАНЕЙ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ОКСАЛАТНОМ НЕФРОЛИТИАЗЕ

1 Алтайский государственный медицинский университет, г. Барнаул

2 Новосибирский государственный медицинский университет, г. Новосибирск

Якушев Н.Н.1, Мадонов П.Г.2, Атабаева О.Ш. 1

Целью исследования явилось изучение динамики активности у-глутамилтрансферазы и концентрации циклооксигеназы-1 в моче и динамики концентрации малонового диальдегида в почечной ткани крыс при экспериментальном оксалатном нефролитиазе.

Эксперименты проведены на 15 самцах крыс сток Вистар возрастом 2-3 месяца и весом 180-220 г. Ок-салатный нефролитиаз моделировался на протяжении 6 недель в соответствии с общепринятой эти-ленгликолевой моделью. До начала эксперимента, а также по прошествии 3 и 6 недель производился сбор мочи, в которой определялась активность у-глутамилтрансферазы (ГГТ) и концентрация циклоокси-геназы-1 (ЦОГ-1). По завершении 6 недель в гомогенате почечной ткани определяли концентрацию ти-обарбитуратреактивных продуктов (ТБРП). Результаты экспериментов показали, что активность ГГТ в моче после 6 недель моделирования нефролитиаза увеличилась в 6,6 раза, концентрация ТБРП в гомогенате почек относительно уровня здоровых крыс увеличилась в 1,3 раза, а также наблюдалась тенденция к росту концентрации в моче ЦОГ-1 в 1,7 раза.

При экспериментальном оксалатном нефролитиазе наблюдается рост активности биохимических маркеров литогенеза - ГГТ и ТБРП. Это свидетельствует о развитии повреждающего фактора в почках, в основе которого лежит активация перекисного окисления липидов.

Ключевые слова: оксалатный нефролитиаз, у-глутамилтрансфераза, малоновый диальдегид, циклоок-сигеназа-1.

The aim of the research was to study the dynamics of y-glutamyltransferase activity and cyclooxygenase-1 concentration in urine and the dynamics of malonic dialdehyde concentration in rat kidney tissue under experimental oxalate nephrolithiasis.

Experiments were performed on 15 male Wistar rats aged 2-3 months and weighing 180-220 g. Oxalate nephrolithiasis was modeled for 6 weeks in accordance with the generally accepted ethylene glycol model. Prior to the start of the experiment, and after 3 and 6 weeks, urine collection was performed, in which y-glutamyl transferase (GGT) activity and cyclooxygenase-1 (COX-1) concentration were determined. At the end of 6 weeks in the homogenate of renal tissue, the concentration of thiobarbituractivative products (TPBP) was determined. The results of the experiments showed that the activity of GGT in the urine after 6 weeks of nephrolithiasis simulation increased 6.6-fold, the concentration of TBP in the kidney homogenate relative to the level of healthy rats increased 1.3-fold, and there was a tendency to increase the concentration in the urine of COX-1 in 1.7 times. Experimental oxalate nephrolithiasis shows an increase in activity of biochemical markers of lithogenesis - GGT and TPBP. This indicates the development of a damaging factor in the kidneys, which is based on the activation of lipid peroxidation.

Key words: oxalate nephrolithiasis, y-glutamyltransferase, malonic dialdehyde, cyclooxygenase-1.

Мочекаменная болезнь по-прежнему остается одним из наиболее распространенных и тяжелых заболеваний мочевыделительной системы. Эпидемиология нефролитиаза охватывает каждого 10-го жителя развитых стран [1]. Современные представления о патогенезе нефро-литиаза указывают на инициирующую роль в процессе камнеобразования так называемого «повреждающего фактора» - деструктивных изменений в структуре и функции эпителия канальцев почки, в результате которых происходит преципитация кристаллического материала из мочи на определенном участке и формируется первичный очаг литогенеза [2]. В этой

связи принято считать, что определенные сигнальные молекулы, указывающие на развитие повреждающего фактора, могут являться биохимическими маркерами литогенеза. Это может иметь важное значение не только при изучении патогенеза нефролитиаза, но и при оценке эффективности разрабатываемых способов медикаментозного лечения мочекаменной болезни.

Результаты ряда исследований свидетельствуют, что каскад реакций, провоцирующих развитие повреждающего фактора, начинается с деструкции клеточных мембран нефроцитов под влиянием движущих сил кристаллизации

[3]. Поэтому нас заинтересовало изучение динамики активности и/или содержания в почках при экспериментальном нефролитиазе у-глу-тамилтрансферазы, малонового диальдегида и циклооксигеназы 1 типа. Как известно, у-глу-тамилтрансфераза - мембраносвязанный фермент, в большом количестве присутствующий в почках [4]. Малоновый диальдегид - основной продукт перекисного окисления мембранных фосфолипидов [5]. Циклооксигеназа-1 - фермент, участвующий в катаболизме мембранных фосфолипидов на этапе превращения арахидо-новой кислоты в простагландины [6]. Эти сигнальные молекулы в значительном количестве содержатся в почках, в связи с чем потенциально могут являться биохимическими маркерами развития оксалатного нефролитиаза.

Таким образом, цель исследования - изучить динамику активности у-глутамилтранс-феразы и концентрации циклооксигеназы-1 в моче и динамику концентрации малонового диальдегида в почечной ткани крыс при экспериментальном оксалатном нефролитиазе.

Материалы и методы

Эксперименты проведены на 15 самцах крыс сток Вистар возрастом 2-3 месяца и весом 180220 г. Исследования проводились согласно требованиям «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных». Животные на протяжении всего исследования находились в индивидуальных метаболических клетках, приспособленных для сбора мочи. Оксалатный неф-ролитиаз моделировался в соответствии с общепринятой этиленгликолевой моделью, согласно которой крысам на протяжении 6 недель предоставлялся в качестве питья в свободном доступе 1%-ный раствор этиленгликоля (ЭГ) [7].

До начала эксперимента, а также по прошествии 3 и 6 недель производился сбор мочи, в которой определялась активность у-глута-милтрансферазы (ГГТ) и концентрация ци-клооксигеназы-1 (ЦОГ-1). Активность ГГТ (U/ мг креатинина в сутки) определяли оптимизированным кинетическим методом на полуавтоматическом анализаторе Vitalon 400. Под действием у-глутамилтрансферазы в реакции переноса L-у-глутамил-З-карбокси-п-нитро-анилида на глицилглицин образуется окрашенный 5-амино-2-нитробензоат. Скорость увеличения оптической плотности пробы при длине волны 405 нм пропорциональна активности ГГТ в анализируемом образце. Для количественного определения циклооксигеназы-1 в моче методом иммуноферментного анализа использовали набор для определения проста-гландин-эндопероксид-синтетазы 1 (PTGS 1) фирмы Cloud-Clone Corp.

По завершении 6 недель моделирования нефролитиаза животных подвергали эвтана-

зии под эфирным наркозом, извлекали обе почки, одна из которых служила для определения концентрации тиобарбитуратреактивных продуктов, основным представителем которых является малоновый диальдегид, а также для проведения морфологических исследований для подтверждения процессов камнеобразо-вания. Концентрацию тиобарбитуратреактивных продуктов (ТБРП) в гомогенате почечной ткани определяли колориметрическим методом, измеряя интенсивность окраски раствора в ходе химической реакции ТБРП с тиобарби-туровой кислотой. Для проведения морфологических исследований почки фиксировались в 10%-ном растворе формалина, обрабатывались по стандартной методике, и изготавливался поперечный срез толщиной 6 мкм через почечный сосочек. Полученные срезы окрашивались гематоксилином и эозином. Кальциевые депозиты идентифицировались гистохимическим методом Косса, и при помощи компьютерной программы на снимках подсчитывалось количество кальциевых депозитов в поле зрения и определялся их размер. Морфометрические исследования проводили с использованием программных пакетов ImageJ 1.43 и AxioVision 3.1.

Статистическая обработка результатов проводилась с использованием компьютерной программы 12.0». Результаты пред-

ставлены медианой (М) и интерквартильным размахом (25%, 75%) для ГГТ, ЦОГ-1 и ТБРП, а также средним значением и стандартной ошибкой среднего (М±т) для морфометриче-ских показателей. Статистические сравнения зависимых выборок проводились с использованием непараметрического критерия Вил-коксона. Результаты признавались достоверными при значении показателя достоверности р<0,05.

Результаты и обсуждение

В результате проведенных экспериментов установлено, что активность ГГТ в моче к исходу 3-й недели опыта увеличилась относительно исходного уровня в 5,0 раза. В дальнейшем рост значения описываемого показателя продолжился, вследствие чего по завершении 6 недель оно уже превышало исходные цифры в 6,6 раза. На этом фоне концентрация ЦОГ-1 в моче к исходу 6-й недели периода наблюдений увеличилась относительно исходного уровня в 1,7 раза. Это изменение не было статистически достоверным и проявлялось лишь в виде тенденции (табл. 1).

Как следует из рисунка 1, концентрация ТБРП в гомогенате почечной ткани крыс с шестинедельным экспериментальным нефроли-тиазом составила 7,6 (7,23 ; 7,65) мкмоль, что было в 1,3 раза больше, чем у здоровых крыс -6,1 (5,37 ; 6,91) мкмоль (р=0,00428).

Таблица 1

Показатели активности ГГТ и концентрации ЦОГ-1 в моче при шестинедельном экспериментальном оксалатном нефролитиазе

Неделя Активность ГГТ (и / мг креатинина в сутки) Концентрация ЦОГ-1 (нг/мл)

Исходный уровень 0,25 (0,05 ; 0,85) п=14 3,9 (2,18 ; 5,69) п=15

3-я неделя 1,24 (0,36 ; 2,10) п=14 р=0,0231 Не определялась

6-я неделя 1,64 (0,87 ; 4,63) п=11 р=0,0166 6,6 (6,0 ; 7,4) п=10 р=0,114

Примечание: п - количество проб мочи для анализа; р - показатель достоверности изменений относительно исходного уровня.

10

|= о.

* р=0,00428

контр

8

6

4

2

0

Рисунок 1 - Концентрация ТБРП при экспериментальном оксалатном нефролитиазе относительно группы интактных крыс.

Примечание: инт - показатель здоровых крыс; контр - показатель крыс с нефролитиазом.

При гистохимическом окрашивании на кальций по методу Косса в канальцах почек крыс отмечали расположенные поодиночке или группами кристаллы депозитов камней коричневато-черного цвета различной формы и размера (рисунок 2). Число депозитов в просветах канальцев варьировало от 3 до 7 и в среднем составляло 4,6±0,2 в поле зрения при увеличении *400, при модальном значении 4. При проведении компьютерной морфометрии площадь депозитов камней составила от 31,5 мкм2 до 567,9 мкм2 и в среднем составляет 171,9±27,6 мкм2.

Обсуждая полученные результаты, отметим, что в условиях смоделированного оксалатного нефролитиаза наиболее выраженному росту подверглась активность ГГТ. Как известно, ГГТ - это мембранный фермент, локализующийся

на наружной стороне мембраны многих клеток организма [4]. Поэтому, с одной стороны, увеличение его активности в моче при нефроли-тиазе может свидетельствовать о разрушении клеточных мембран нефроцитов и высвобождении фермента в просвет канальцев. С другой стороны, известно, что активность ГГТ - маркер оксидативного стресса в тканях организма [8]. Установлено, что важнейшей функцией ГГТ в организме является поддержание физиологической концентрации глутатиона в цитоплазме клеток, который является главным тиоловым антиоксидантом в организме [8]. Поэтому не исключено, что столь выраженный рост активности ГГТ мог являться компенсаторной реакцией на развивающийся оксидативный стресс в почечной ткани при оксалатном нефролитиазе.

Подтверждением этому можно считать зафиксированный в наших экспериментах рост концентрации ТБРП в гомогенате почечной ткани. Как известно, основным представителем ТБРП

является малоновый диальдегид - главный продукт перекисного окисления мембранных фос-фолипидов [5].

Рисунок 2 - Депозиты в канальцах почек крыс с экспериментальным оксалатным нефролитиазом. Окраска по Коссу. Увеличение *400.

Примечание: в поле зрения кальциевые депозиты коричневого цвета.

В дополнение следует отметить зафиксированную в наших экспериментах тенденцию к росту концентрацию ЦОГ-1 в моче. Данный фермент участвует в реакции метаболизма арахидоновой кислоты до простагландина H2 - промежуточного продукта в синтезе целого ряда простагладинов [6]. Роль циклооксигеназ-ного пути метаболизма мембранных фосфоли-пидов в патогенезе почечных патологий довольно сложна и многообразна. Существует мнение, что ЦОГ-1 участвует в цитопротекции, наиболее ярким примером которой является регулирование продукции защитной слизи в желудке [6]. Возможно, подобную функцию ЦОГ-1 может иметь и в почках. Однако, несомненно, этот вопрос подлежит дальнейшему углубленному изучению.

Суммируя вышеизложенное, отметим, что в условиях шестинедельного моделирования экспериментального оксалатного нефролити-аза были зафиксированы характерные изменения динамики биохимических маркеров развития патологии. Главным образом об этом свидетельствовал почти 7-кратный рост активности ГГТ в ходе эксперимента и достоверное увеличение концентрации ТБРП в гомогенате почечной ткани на 30%. Подтверждением развития нефролитиаза стали результаты морфологических исследований, которые показали формирование значительного количества кальциевых депозитов в канальцах почек подопытных крыс. 22

Заключение

При экспериментальном оксалатном неф-ролитиазе наблюдается рост активности биохимических маркеров литогенеза - ГГТ и ТБРП. Это свидетельствует о развитии повреждающего фактора в почках, в основе которого лежит активация перекисного окисления липидов.

Список литературы:

1. Scales C.D. Jr., Tasian G.E., Schwaderer

A.L. et al. Urinary Stone Disease: Advancing Knowledge, Patient Care, and Population Health. Clin J Am Soc Nephrol. 2016. 11(7): 1305-1312.

2. Жариков А.Ю., Зверев Я.Ф., Брюханов

B.М., Лампатов В.В. Механизм формирования кристаллов при оксалатном нефролитиазе. Нефрология. 2009; 13(4):37-50.

3. Khan S.R. Histological aspects of the «fixed-particle» model of stone formation: animal studies. Urolithiasis. 2017;45(1):75-87.

4. Castellano I., Merlino A. y-Glutamyltranspeptidases: sequence, structure, biochemical properties, and biotechnological applications. Cell Mol Life Sci. 2012;69:3381-94.

5. Ayala A., Muñoz M.F., Argüelles S. Lipid peroxidation: production, metabolism, and signaling mechanisms of malondialdehyde and 4-hydroxy-2-nonenal. Oxid Med Cell Longev. 2014;2014:360438.

6. Li Y., Xia W., Zhao F., Wen Z., Zhang A., Huang S., Jia Z., Zhang Y. Prostaglandins in the

pathogenesis of kidney diseases. Oncotarget. 2018;9(41):26586-26602.

7. Жариков А.Ю., Брюханов В.М., Зверев Я.Ф., Лампатов В.В. Современные методы моделирования оксалатного нефролитиаза. Нефрология. 2008; 12(4): 28-35.

8. Ndrepepa G., Kastrati A. Gamma-glutamyl transferase and cardiovascular disease. Ann Transl Med. 2016; 4(24): 481.

Контактные данные

Автор, ответственный за переписку: Якушев Николай Николаевич, доцент кафедры фармакологии Алтайского государственного медицинского университета, г. Барнаул. 656031, г. Барнаул, ул. Папанинцев, 126. Тел.: (3852) 566891. E-mail: yakushevnn@mail.ru

Информация об авторах

Мадонов Павел Геннадьевич, д.м.н., профессор, заведующий кафедрой фармакологии, клинической фармакологии и доказательной медицины Новосибирского государственного медицинского университета, г. Новосибирск. 630075, г. Новосибирск, ул. Залесского, 4. Тел.: (3832) 360902. E-mail: kaffarm@yandex.ru

Атабаева Ольга Шукурулловна, к.м.н., доцент кафедры фармакологии Алтайского государственного медицинского университета, г. Барнаул.

656031, г. Барнаул, ул. Папанинцев, 126. Тел.: (3852) 566891. E-mail: science@agmu.ru

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.