CC BY
24
УДК 616.613-003.7:616.151-07
БИОХИМИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ ПОВРЕЖДЕНИЯ ПОЧЕЧНЫХ ТКАНЕЙ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ОКСАЛАТНОМ НЕФРОЛИТИАЗЕ
1 Алтайский государственный медицинский университет, г. Барнаул
2 Новосибирский государственный медицинский университет, г. Новосибирск
Якушев Н.Н.1, Мадонов П.Г.2, Атабаева О.Ш. 1
Целью исследования явилось изучение динамики активности у-глутамилтрансферазы и концентрации циклооксигеназы-1 в моче и динамики концентрации малонового диальдегида в почечной ткани крыс при экспериментальном оксалатном нефролитиазе.
Эксперименты проведены на 15 самцах крыс сток Вистар возрастом 2-3 месяца и весом 180-220 г. Ок-салатный нефролитиаз моделировался на протяжении 6 недель в соответствии с общепринятой эти-ленгликолевой моделью. До начала эксперимента, а также по прошествии 3 и 6 недель производился сбор мочи, в которой определялась активность у-глутамилтрансферазы (ГГТ) и концентрация циклоокси-геназы-1 (ЦОГ-1). По завершении 6 недель в гомогенате почечной ткани определяли концентрацию ти-обарбитуратреактивных продуктов (ТБРП). Результаты экспериментов показали, что активность ГГТ в моче после 6 недель моделирования нефролитиаза увеличилась в 6,6 раза, концентрация ТБРП в гомогенате почек относительно уровня здоровых крыс увеличилась в 1,3 раза, а также наблюдалась тенденция к росту концентрации в моче ЦОГ-1 в 1,7 раза.
При экспериментальном оксалатном нефролитиазе наблюдается рост активности биохимических маркеров литогенеза - ГГТ и ТБРП. Это свидетельствует о развитии повреждающего фактора в почках, в основе которого лежит активация перекисного окисления липидов.
Ключевые слова: оксалатный нефролитиаз, у-глутамилтрансфераза, малоновый диальдегид, циклоок-сигеназа-1.
The aim of the research was to study the dynamics of y-glutamyltransferase activity and cyclooxygenase-1 concentration in urine and the dynamics of malonic dialdehyde concentration in rat kidney tissue under experimental oxalate nephrolithiasis.
Experiments were performed on 15 male Wistar rats aged 2-3 months and weighing 180-220 g. Oxalate nephrolithiasis was modeled for 6 weeks in accordance with the generally accepted ethylene glycol model. Prior to the start of the experiment, and after 3 and 6 weeks, urine collection was performed, in which y-glutamyl transferase (GGT) activity and cyclooxygenase-1 (COX-1) concentration were determined. At the end of 6 weeks in the homogenate of renal tissue, the concentration of thiobarbituractivative products (TPBP) was determined. The results of the experiments showed that the activity of GGT in the urine after 6 weeks of nephrolithiasis simulation increased 6.6-fold, the concentration of TBP in the kidney homogenate relative to the level of healthy rats increased 1.3-fold, and there was a tendency to increase the concentration in the urine of COX-1 in 1.7 times. Experimental oxalate nephrolithiasis shows an increase in activity of biochemical markers of lithogenesis - GGT and TPBP. This indicates the development of a damaging factor in the kidneys, which is based on the activation of lipid peroxidation.
Key words: oxalate nephrolithiasis, y-glutamyltransferase, malonic dialdehyde, cyclooxygenase-1.
Мочекаменная болезнь по-прежнему остается одним из наиболее распространенных и тяжелых заболеваний мочевыделительной системы. Эпидемиология нефролитиаза охватывает каждого 10-го жителя развитых стран [1]. Современные представления о патогенезе нефро-литиаза указывают на инициирующую роль в процессе камнеобразования так называемого «повреждающего фактора» - деструктивных изменений в структуре и функции эпителия канальцев почки, в результате которых происходит преципитация кристаллического материала из мочи на определенном участке и формируется первичный очаг литогенеза [2]. В этой
связи принято считать, что определенные сигнальные молекулы, указывающие на развитие повреждающего фактора, могут являться биохимическими маркерами литогенеза. Это может иметь важное значение не только при изучении патогенеза нефролитиаза, но и при оценке эффективности разрабатываемых способов медикаментозного лечения мочекаменной болезни.
Результаты ряда исследований свидетельствуют, что каскад реакций, провоцирующих развитие повреждающего фактора, начинается с деструкции клеточных мембран нефроцитов под влиянием движущих сил кристаллизации
[3]. Поэтому нас заинтересовало изучение динамики активности и/или содержания в почках при экспериментальном нефролитиазе у-глу-тамилтрансферазы, малонового диальдегида и циклооксигеназы 1 типа. Как известно, у-глу-тамилтрансфераза - мембраносвязанный фермент, в большом количестве присутствующий в почках [4]. Малоновый диальдегид - основной продукт перекисного окисления мембранных фосфолипидов [5]. Циклооксигеназа-1 - фермент, участвующий в катаболизме мембранных фосфолипидов на этапе превращения арахидо-новой кислоты в простагландины [6]. Эти сигнальные молекулы в значительном количестве содержатся в почках, в связи с чем потенциально могут являться биохимическими маркерами развития оксалатного нефролитиаза.
Таким образом, цель исследования - изучить динамику активности у-глутамилтранс-феразы и концентрации циклооксигеназы-1 в моче и динамику концентрации малонового диальдегида в почечной ткани крыс при экспериментальном оксалатном нефролитиазе.
Материалы и методы
Эксперименты проведены на 15 самцах крыс сток Вистар возрастом 2-3 месяца и весом 180220 г. Исследования проводились согласно требованиям «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных». Животные на протяжении всего исследования находились в индивидуальных метаболических клетках, приспособленных для сбора мочи. Оксалатный неф-ролитиаз моделировался в соответствии с общепринятой этиленгликолевой моделью, согласно которой крысам на протяжении 6 недель предоставлялся в качестве питья в свободном доступе 1%-ный раствор этиленгликоля (ЭГ) [7].
До начала эксперимента, а также по прошествии 3 и 6 недель производился сбор мочи, в которой определялась активность у-глута-милтрансферазы (ГГТ) и концентрация ци-клооксигеназы-1 (ЦОГ-1). Активность ГГТ (U/ мг креатинина в сутки) определяли оптимизированным кинетическим методом на полуавтоматическом анализаторе Vitalon 400. Под действием у-глутамилтрансферазы в реакции переноса L-у-глутамил-З-карбокси-п-нитро-анилида на глицилглицин образуется окрашенный 5-амино-2-нитробензоат. Скорость увеличения оптической плотности пробы при длине волны 405 нм пропорциональна активности ГГТ в анализируемом образце. Для количественного определения циклооксигеназы-1 в моче методом иммуноферментного анализа использовали набор для определения проста-гландин-эндопероксид-синтетазы 1 (PTGS 1) фирмы Cloud-Clone Corp.
По завершении 6 недель моделирования нефролитиаза животных подвергали эвтана-
зии под эфирным наркозом, извлекали обе почки, одна из которых служила для определения концентрации тиобарбитуратреактивных продуктов, основным представителем которых является малоновый диальдегид, а также для проведения морфологических исследований для подтверждения процессов камнеобразо-вания. Концентрацию тиобарбитуратреактивных продуктов (ТБРП) в гомогенате почечной ткани определяли колориметрическим методом, измеряя интенсивность окраски раствора в ходе химической реакции ТБРП с тиобарби-туровой кислотой. Для проведения морфологических исследований почки фиксировались в 10%-ном растворе формалина, обрабатывались по стандартной методике, и изготавливался поперечный срез толщиной 6 мкм через почечный сосочек. Полученные срезы окрашивались гематоксилином и эозином. Кальциевые депозиты идентифицировались гистохимическим методом Косса, и при помощи компьютерной программы на снимках подсчитывалось количество кальциевых депозитов в поле зрения и определялся их размер. Морфометрические исследования проводили с использованием программных пакетов ImageJ 1.43 и AxioVision 3.1.
Статистическая обработка результатов проводилась с использованием компьютерной программы 12.0». Результаты пред-
ставлены медианой (М) и интерквартильным размахом (25%, 75%) для ГГТ, ЦОГ-1 и ТБРП, а также средним значением и стандартной ошибкой среднего (М±т) для морфометриче-ских показателей. Статистические сравнения зависимых выборок проводились с использованием непараметрического критерия Вил-коксона. Результаты признавались достоверными при значении показателя достоверности р<0,05.
Результаты и обсуждение
В результате проведенных экспериментов установлено, что активность ГГТ в моче к исходу 3-й недели опыта увеличилась относительно исходного уровня в 5,0 раза. В дальнейшем рост значения описываемого показателя продолжился, вследствие чего по завершении 6 недель оно уже превышало исходные цифры в 6,6 раза. На этом фоне концентрация ЦОГ-1 в моче к исходу 6-й недели периода наблюдений увеличилась относительно исходного уровня в 1,7 раза. Это изменение не было статистически достоверным и проявлялось лишь в виде тенденции (табл. 1).
Как следует из рисунка 1, концентрация ТБРП в гомогенате почечной ткани крыс с шестинедельным экспериментальным нефроли-тиазом составила 7,6 (7,23 ; 7,65) мкмоль, что было в 1,3 раза больше, чем у здоровых крыс -6,1 (5,37 ; 6,91) мкмоль (р=0,00428).
Таблица 1
Показатели активности ГГТ и концентрации ЦОГ-1 в моче при шестинедельном экспериментальном оксалатном нефролитиазе
Неделя Активность ГГТ (и / мг креатинина в сутки) Концентрация ЦОГ-1 (нг/мл)
Исходный уровень 0,25 (0,05 ; 0,85) п=14 3,9 (2,18 ; 5,69) п=15
3-я неделя 1,24 (0,36 ; 2,10) п=14 р=0,0231 Не определялась
6-я неделя 1,64 (0,87 ; 4,63) п=11 р=0,0166 6,6 (6,0 ; 7,4) п=10 р=0,114
Примечание: п - количество проб мочи для анализа; р - показатель достоверности изменений относительно исходного уровня.
10
|= о.
* р=0,00428
контр
8
6
4
2
0
Рисунок 1 - Концентрация ТБРП при экспериментальном оксалатном нефролитиазе относительно группы интактных крыс.
Примечание: инт - показатель здоровых крыс; контр - показатель крыс с нефролитиазом.
При гистохимическом окрашивании на кальций по методу Косса в канальцах почек крыс отмечали расположенные поодиночке или группами кристаллы депозитов камней коричневато-черного цвета различной формы и размера (рисунок 2). Число депозитов в просветах канальцев варьировало от 3 до 7 и в среднем составляло 4,6±0,2 в поле зрения при увеличении *400, при модальном значении 4. При проведении компьютерной морфометрии площадь депозитов камней составила от 31,5 мкм2 до 567,9 мкм2 и в среднем составляет 171,9±27,6 мкм2.
Обсуждая полученные результаты, отметим, что в условиях смоделированного оксалатного нефролитиаза наиболее выраженному росту подверглась активность ГГТ. Как известно, ГГТ - это мембранный фермент, локализующийся
на наружной стороне мембраны многих клеток организма [4]. Поэтому, с одной стороны, увеличение его активности в моче при нефроли-тиазе может свидетельствовать о разрушении клеточных мембран нефроцитов и высвобождении фермента в просвет канальцев. С другой стороны, известно, что активность ГГТ - маркер оксидативного стресса в тканях организма [8]. Установлено, что важнейшей функцией ГГТ в организме является поддержание физиологической концентрации глутатиона в цитоплазме клеток, который является главным тиоловым антиоксидантом в организме [8]. Поэтому не исключено, что столь выраженный рост активности ГГТ мог являться компенсаторной реакцией на развивающийся оксидативный стресс в почечной ткани при оксалатном нефролитиазе.
Подтверждением этому можно считать зафиксированный в наших экспериментах рост концентрации ТБРП в гомогенате почечной ткани. Как известно, основным представителем ТБРП
является малоновый диальдегид - главный продукт перекисного окисления мембранных фос-фолипидов [5].
Рисунок 2 - Депозиты в канальцах почек крыс с экспериментальным оксалатным нефролитиазом. Окраска по Коссу. Увеличение *400.
Примечание: в поле зрения кальциевые депозиты коричневого цвета.
В дополнение следует отметить зафиксированную в наших экспериментах тенденцию к росту концентрацию ЦОГ-1 в моче. Данный фермент участвует в реакции метаболизма арахидоновой кислоты до простагландина H2 - промежуточного продукта в синтезе целого ряда простагладинов [6]. Роль циклооксигеназ-ного пути метаболизма мембранных фосфоли-пидов в патогенезе почечных патологий довольно сложна и многообразна. Существует мнение, что ЦОГ-1 участвует в цитопротекции, наиболее ярким примером которой является регулирование продукции защитной слизи в желудке [6]. Возможно, подобную функцию ЦОГ-1 может иметь и в почках. Однако, несомненно, этот вопрос подлежит дальнейшему углубленному изучению.
Суммируя вышеизложенное, отметим, что в условиях шестинедельного моделирования экспериментального оксалатного нефролити-аза были зафиксированы характерные изменения динамики биохимических маркеров развития патологии. Главным образом об этом свидетельствовал почти 7-кратный рост активности ГГТ в ходе эксперимента и достоверное увеличение концентрации ТБРП в гомогенате почечной ткани на 30%. Подтверждением развития нефролитиаза стали результаты морфологических исследований, которые показали формирование значительного количества кальциевых депозитов в канальцах почек подопытных крыс. 22
Заключение
При экспериментальном оксалатном неф-ролитиазе наблюдается рост активности биохимических маркеров литогенеза - ГГТ и ТБРП. Это свидетельствует о развитии повреждающего фактора в почках, в основе которого лежит активация перекисного окисления липидов.
Список литературы:
1. Scales C.D. Jr., Tasian G.E., Schwaderer
A.L. et al. Urinary Stone Disease: Advancing Knowledge, Patient Care, and Population Health. Clin J Am Soc Nephrol. 2016. 11(7): 1305-1312.
2. Жариков А.Ю., Зверев Я.Ф., Брюханов
B.М., Лампатов В.В. Механизм формирования кристаллов при оксалатном нефролитиазе. Нефрология. 2009; 13(4):37-50.
3. Khan S.R. Histological aspects of the «fixed-particle» model of stone formation: animal studies. Urolithiasis. 2017;45(1):75-87.
4. Castellano I., Merlino A. y-Glutamyltranspeptidases: sequence, structure, biochemical properties, and biotechnological applications. Cell Mol Life Sci. 2012;69:3381-94.
5. Ayala A., Muñoz M.F., Argüelles S. Lipid peroxidation: production, metabolism, and signaling mechanisms of malondialdehyde and 4-hydroxy-2-nonenal. Oxid Med Cell Longev. 2014;2014:360438.
6. Li Y., Xia W., Zhao F., Wen Z., Zhang A., Huang S., Jia Z., Zhang Y. Prostaglandins in the
pathogenesis of kidney diseases. Oncotarget. 2018;9(41):26586-26602.
7. Жариков А.Ю., Брюханов В.М., Зверев Я.Ф., Лампатов В.В. Современные методы моделирования оксалатного нефролитиаза. Нефрология. 2008; 12(4): 28-35.
8. Ndrepepa G., Kastrati A. Gamma-glutamyl transferase and cardiovascular disease. Ann Transl Med. 2016; 4(24): 481.
Контактные данные
Автор, ответственный за переписку: Якушев Николай Николаевич, доцент кафедры фармакологии Алтайского государственного медицинского университета, г. Барнаул. 656031, г. Барнаул, ул. Папанинцев, 126. Тел.: (3852) 566891. E-mail: yakushevnn@mail.ru
Информация об авторах
Мадонов Павел Геннадьевич, д.м.н., профессор, заведующий кафедрой фармакологии, клинической фармакологии и доказательной медицины Новосибирского государственного медицинского университета, г. Новосибирск. 630075, г. Новосибирск, ул. Залесского, 4. Тел.: (3832) 360902. E-mail: kaffarm@yandex.ru
Атабаева Ольга Шукурулловна, к.м.н., доцент кафедры фармакологии Алтайского государственного медицинского университета, г. Барнаул.
656031, г. Барнаул, ул. Папанинцев, 126. Тел.: (3852) 566891. E-mail: science@agmu.ru
