CC BY
25УДК 577.114.3:612.396.13 https://doi.org/10.29296/25877313-2020-09-08
© О.Г. Гилева, 2020
БИОХИМИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ ПОВРЕЖДЕНИЯ ПЕЧЕНИ ПРИ ФРУКТОЗОИНДУЦИРОВАННОЙ ДИЕТЕ У КРЫС
О.Г. Гилева
аспирант, кафедра клинической биохимии и лабораторной диагностики, Ижевская государственная медицинская академия (г. Ижевск) E-mail: kld.igma@mail.ru
Актуальность. Повышенное содержание фруктозы приводит к нарушению обменных процессов в организме, что может быть связано с биохимическими особенностями метаболизма фруктозы. Результатом этого нарушения является увеличение риска развития ожирения, сахарного диабета, сердечно-сосудистых заболеваний, а также заболеваний печени, индуцированных формированием окислительного стресса на фоне изменений в липидном и углеводном обмене. О деструктивных процессах в печени может свидетельствовать увеличение содержания основных маркеров цитолиза гепатоцитов: аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (АСТ), щелочной фосфатазы (ЩФ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ).
Цель работы. Создание экспериментальной модели развития воспалительного процесса (стеатоза) в печени крыс под влиянием фруктозоиндуцированной диеты.
Материал и методы. Исследование проводилось на 50 крысах-самцах с массой тела 250-300 г. (опытная и контрольная группы по 25 особей в каждой). Крысы контрольной группы получали сбалансированный рацион вивария, животные опытной группы - диету, содержащую 60% фруктозы от суточной калорийности. Оценивали сформированность метаболических отклонений в отдаленные сроки: содержание глюкозы, холестерина (ХС), липопротеинов низкой плотности (ЛПНП), триглицеридов (ТГ), инсулина, активность АЛТ, АСТ, ЩФ, ЛДГ. Биохимические исследования проводили на автоматическом анализаторе AU-480 («Beckman Coulter», США) с использованием реактивов этого же производителя. Содержание инсулина определяли на иммуно-ферментном анализаторе StatFax-2100 («Awareness Technology», США) с помощью набора реактивов ООО «Вектор-бест», РФ. Рассчитывали индексы инсулинорезистентности.
Результаты. Наблюдалась тенденция к росту концентрации глюкозы в сыворотке крови крыс с достоверным увеличением на 21-й и 60-й дни эксперимента в 1,18 и 1,21 раза соответственно и ХС на 35-й день эксперимента в 1,59 раза относительно контроля. Концентрация инсулина достоверно возрастала в течение всего эксперимента, превосходя контрольные значения в 1,5, 1,7 и 1,9 раза на 21-, 35- и 60-й дни эксперимента. Индексы инсулинорезистентности также отличались от контрольных значений, что может свидетельствовать о формировании инсулинорезистентности. Содержание ЛПНП статистически значимо увеличивалось в течение всего эксперимента. Отмечался рост активности маркеров цитолиза гепатоцитов с достоверным увеличением по сравнению с контролем. Снижение коэффициента де Ритиса подтверждает активацию цитолитических процессов в печени. Выводы. Фруктозоиндуцированная диета увеличивает содержание специфических ферментов печени крыс (АЛТ, АСТ, ЩФ, ЛДГ) на фоне нарушений в липидном и углеводном обмене с повышением концентраций ХС, ТГ, ЛПНП, а также глюкозы и инсулина, с формированием инсулинорезистентности. Причиной инициации цитолитических процессов в гепатоцитах может быть свободно-радикальное окисление белок-липидных комплексов и активация воспалительных реакций в результате повышенного потребления фруктозы.
Ключевые слова: фруктоза, углеводный обмен, липидный обмен, активность ферментов, маркеры цитолиза, гепатоциты.
Для цитирования: Гилева О.Г. Биохимические маркеры повреждения печени при фруктозоиндуцированной диете у крыс. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2020;23(9):53-58. https://doi.org/10.29296/25877313-2020-09-08
В последнее время в питании человека наблюдаются существенные изменения, в частности, значительно увеличилось содержание простых углеводов в рационах питания, особенно фруктозы, ввиду ее экономически выгодного производства и общераспространенного мнения об относительной безопасности при употреблении [2].
По данным литературы, пероральное или внутривенное введение в организм больших коли-
честв фруктозы способствует развитию ожирения, гипертриглицеридемии, гипергликемии, инсули-норезистентности, которые являются составляющими метаболического синдрома и могут привести к возрастанию риска сердечно-сосудистых заболеваний, а также к развитию стеатоза и воспалительной инфильтрации печени [3]. Заболевания печени вызывают нарушения ее функциональной и ферментативной активности. При воспалитель-
ных поражениях печени из ее ткани высвобождается изрядное количество ферментов внутриклеточной локализации. Диагностическое значение приобрели исследования аминотрансфераз (АЛТ и АСТ), щелочной фосфатазы (ЩФ), лактатдегидро-геназы (ЛДГ) [1].
В связи с этим особый интерес представляют экспериментальные исследования по моделированию развития воспалительных процессов в печени на фоне диеты с повышенным содержанием фруктозы.
Цель работы - смоделировать развитие воспалительного процесса (стеатоза) в печени крыс под влиянием фруктозоиндуцированной диеты.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Для эксперимента были выбраны 50 крыс-самцов с массой тела 250-300 г. Работу выполняли в соответствии с правилами GLP, Приказом Министерства здравоохранения Российской Федерации от 01.04.2016 №199н «Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики», а также требованиями локального этического комитета ИГМА.
Животных разделили на две группы - опытную и контрольную, по 25 особей в каждой группе. В течение 35 дней крыс контрольной группы содержали на сбалансированной диете вивария, животных опытной группы - на рационе, содержащем 60% фруктозы от суточной калорийности [4]. С 36-го по 60-й день крысы находились на стандартном рационе вивария. На 60-й день оценивали сформированность метаболических отклонений в отдаленные сроки. На 21-, 35- и 60-й дни опыта крыс взвешивали.
Выведение животных из эксперимента осуществляли натощак путем декапитации под кратковременным эфирным наркозом на 21-, 35- и 60-й дни опыта. Кровь собирали в пробирки и путем центрифугирования (3000 об\мин, 15мин) получали сыворотку, в которой определяли концентрацию глюкозы, холестерина (ХС), липопротеина низкой плотности (ЛПНП), триглицерида (ТГ), инсулина, а также активность АЛТ, АСТ, ЩФ, ЛДГ. Биохимические исследования проводили на автоматическом анализаторе AU-480 («Beckman Coulter», США) с использованием реактивов того же производителя. Концентрацию инсулина определяли на иммуноферментном анализаторе StatFax-2100 («Awareness Technology», США) с
помощью набора реактивов ООО «Вектор-бест», РФ. Индексы инсулинорезистентности рассчитывали по формулам: HOMA = (глюкоза натощак х инсулин натощак)/22,5; CARO = глюкоза натощак/инсулин натощак; коэффициент де Ритиса -по соотношению АСТ к АЛТ [1].
Достоверность отличий опытной группы от контрольных значений определяли по непараметрическому U-критерию Манна-Уитни, а также по критерию t Стьюдента - для результатов, имеющих нормальное распределение. Различия считали статистически значимыми при р < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В процессе эксперимента наблюдалось незначительное (p > 0,05) увеличение массы тела животных опытной группы по сравнению с контрольной, что является возможным для фруктозо-обогащенной диеты (табл. 1).
Таблица 1. Масса тела крыс опытной группы относительно контрольной на момент выведения из эксперимента
День эксперимента n Относительная масса тела, %
21-й 8 106,8
35-й 8 114,4
60-й 9 118,9
Данные литературы об изменении массы тела грызунов, содержащихся на рационе, богатом фруктозой, противоречивы [4]. Ряд ученых отмечали незначительное увеличение массы тела, другие исследователи не наблюдали изменения массы тела крыс ни после четырехнедельного кормления, ни в более отдаленные сроки [3].
По результатам исследования (рис. 1) можно отметить, что потребление пищи с повышенным содержанием фруктозы приводит к увеличению содержания глюкозы в сыворотке крови крыс с 6,52±0,36 (в контроле) до 7,74±0,74, 7,97±1,90 и 7,87±0,66 ммоль/л на 21-, 35- и 60-й дни эксперимента соответственно. Рост концентрации глюкозы, вероятно, связан с образованием глюкозы из фруктозы за счет активации глюконеогенеза, а также с развитием инсулинорезистентности на фоне избыточного потребления фруктозы, с учетом достоверно значимого повышения концентрации инсулина в эксперименте (табл. 2).
Рис. 1. Изменение содержания глюкозы, ХС, ЛПНП, ТГ в сыворотке крови крыс, получавших фруктозоиндуцированную диету Таблица 2. Исследуемые показатели в сыворотке крови крыс (Ме ^1; Q3])
Показатель 21-й день эксперимента 35-й день эксперимента 60-й день эксперимента
Контроль (n=8) Опыт (n=8) Контроль (n=8) Опыт (n=8) Контроль (n=9) Опыт (n=9)
Инсулин, мкЕд/мл 1,68 [1,31;2,10] 2,6 [2,35;2,72]* 1,63 [1,59;1,70] 2,74 [2,30;2,81]* 1,66 [1,6;1,71] 3,22 [2,70;3,43]*
НОМА, усл.ед. 0,59 [0,42;0,66] 0,84 [0,79;0,95]* 0,51 [0,39;0,58] 0,88 [0,82;0,96]* 0,54 [0,40;0,61] 1,07 [0,83;1,48] *
CARO, усл.ед 3,68 [3,01;3,70] 3,19 [2,95;3,38] 3,62 [3,0;3,69] 3,09 [2,94;3,47] 3,59 [2,97;3,63] 2,62 [2,16;3,02]*
Примечание
■ достоверно значимые отличия (p < 0,05) по сравнению с контролем.
*
Уникальность метаболизма фруктозы заключается во включении ее в гликолиз, минуя стадию, катализируемую регуляторным ферментом фосфо-фруктокиназой. В результате наблюдается бесконтрольный синтез ацетил-коэнзим А (Ацил-СоА), который в первую очередь используется в цикле Кребса (цикл трикарбоновых кислот) для синтеза энергетических эквивалентов в виде аденозинтри-фосфата (АТФ). После накопления достаточного количества АТФ избыток Ацил-СоА участвует в синтезе холестерина, жирных кислот, кетоновых тел. Синтезированные de novo жирные кислоты могут подвергнуться этерификации с глицерофосфат-ным «скелетом», полученном при метаболизме углеводов, результатом чего будут сложные липиды, в том числе ТГ [2]. В эксперименте отмечалась тенденция роста ТГ, холестерина с 0,83±0,07 ммоль/л
(в контроле) с достоверным увеличением до 1,36±0,43 ммоль/л на 35-й день опыта. Избыточное образование ТГ в гепатоцитах вследствие массивного поступления свободных жирных кислот в печень приводит к развитию стеатоза, а также секреции повышенного количества ТГ в составе липо-протеинов очень низкой, а затем и низкой плотности, способствующих накоплению продуктов их перекисного окисления и в итоге к повреждению гепатоцитов и к их некрозу [5]. По результатам эксперимента концентрация ЛПНП статистически значимо увеличивалась на 21-й день опыта, незначительно снижалась на 35-й день и вновь возрастала на 60-й день после отмены диеты: с 0,19±0,06 ммоль/л (контроль) до 0,44±0,16 ммоль/л на 21-й, 0,4±0,12 ммоль/л на 35-й и 0,58±0,26 ммоль/л на 60-й день эксперимента.
Установлено, что наличие глюкозы в среде окисления природных ЛПНП приводит к интенсификации их свободнорадикального окисления вследствие продукции супероксидных анион-радикалов в процессе аутоокисления глюкозы [6]. Ранее проведенные исследования [7] подтверждают, что в экспериментальных условиях фруктоз-ной нагрузки одновременно с развитием биохимических нарушений в углеводном и липидном обмене возникает нарастание уровня продуктов пе-рекисного окисления липидов. Известно также, что гликозилирование фруктозы происходит в семь раз быстрее глюкозы. Например, на единицу массы фруктозы, по сравнению с глюкозой, образуется в 100 раз больше активных форм кислорода [8]. Это способствует синтезу цитокинов, характерных для воспалительной реакции.
Накопление продуктов перекисного окисления липидов, супероксидных анион-радикалов, глико-зилированных белков и углеводов приводит к формированию окислительного стресса и может быть причиной цитолиза гепатоцитов, основными маркерами которого являются ферменты печени -АЛТ, АСТ, ЩФ, ЛДГ. В течение эксперимента наблюдался рост активности ферментов: АЛТ - в 1,34; 1,7 и 1,9 раза; АСТ - в 1,18; 1,28 и 1,3 раза; ЩФ - в 1,38; 1,43 и 1,78 раза; ЛДГ - в 1,76; 2,19 и 2,49 раза относительно контроля на 21-, 35- и 60-й дни эксперимента соответственно (табл. 2). Повышение активности этих ферментов является достоверным маркером повреждения печени. Но учиты-
вая, что АСТ, в отличие от АЛТ, помимо печени содержится практически во всех органах, наибольшее клиническое значение имеет коэффициент де Ритиса. В проведенном эксперименте наблюдалась тенденция к снижению коэффициента де Ритиса к 35-му дню диеты и после ее отмены на 60-й день эксперимента, что может быть результатом выраженных деструктивных процессов в гепатоцитах.
На поражение печени указывает положительная динамика активности ЛДГ, имеющая выраженный рост в начальные сроки исследования и сохраняющаяся высокой к окончанию эксперимента после отмены диеты. Достоверно значимое повышение активности ЩФ в эксперименте в сочетании с изменениями показателей печеночных маркеров тоже свидетельствует о возможном поражении гепатоцитов (табл. 2).
Учитывая не только цитоплазматическую, но и митохондриальную (АСТ) локализацию ферментов, можно предположить, что негативные последствия метаболических превращений фруктозы вызывают глубокие изменения в гепатоцитах, что может привести к прогрессированию печеночной недостаточности.
Отмена фруктозной диеты не привела к нормализации исследуемых показателей цитолиза ге-патоцитов, наоборот, наблюдался их рост на 60-й день эксперимента, на основании чего можно предположить о стойких патологических изменениях в клетках печени на фоне избытка фруктозы в рационе питания.
Таблица 2. Биохимические маркеры цитолиза гепатоцитов в сыворотке крови крыс
Показатель 21-й день эксперимента 35-й день эксперимента 60-й день эксперимента
Контроль (и=8) Опыт (и=8) Контроль (и=8) Опыт (и=8) Контроль (и=9) Опыт (и=9)
АЛТ, Ед/л 28 [21,7; 36] 42,3 [41,2; 43,4] 32,7 [27,0; 47,3] 53,5* [48,5; 55,1] 34,1 [29,1; 48,5] 62,7* [49,4; 66]
АСТ, Ед/л 131,5 [117,8; 136,9] 160,3* [142,1; 160,5] 136,9 [116,1; 140,7] 174,2* [141,7; 188,3] 138,4 [117,0; 142,5] 177,3* [173,7; 183,3]
ЩФ, Ед/л 81 [74; 91] 130* [115; 132] 96 [88; 96] 135* [130; 135] 105 [96; 112] 168* [130; 186]
ЛДГ, Ед/л 1012 [1009; 1129] 2236* [1896; 2680] 1359 [1269; 1711] 2769* [1706; 3222] 1421 [1315; 1862] 3155* [2248; 3556]
Коэф-т де Ритиса, у.е. 4,7 3,76 4,18 3,25 4,05 2,83
Примечание: медиана [25%; 75%]; * - p < 0,05 при сравнении с контрольной группой.
ВЫВОДЫ
1. В процессе изучения влияния фруктозоинду-цированной диеты на развитие воспалительного процесса в печени крыс наблюдалось повышение активности специфических ферментов печени - биохимических маркеров цитолиза гепатоцитов - в результате возможного сте-атоза и воспалительной инфильтрации печени как следствие деструктивно-дистрофических изменений в гепатоцитах на фоне нарушений в углеводном и липидном обмене.
2. Результаты исследования могут послужить основой для дальнейших изучений в области этиологии и патогенеза печеночной патологии при высокофруктозном питании. А также помогут скорректировать мнение об относительной безопасности фруктозы, особенно в случаях ее избыточного или бесконтрольного употребления.
ЛИТЕРАТУРА
1. Долгов В.В. Клиническая лабораторная диагностика: Национальное руководство. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2017; 808.
2. Павлова З.Ш., Голодников И.И., Камалов А.А. Биохимические механизмы развития неалкогольной жировой бо-
лезни печени под воздействием фруктозы. Технологии живых систем. 2018; 15: 18-27.
3. Решетняк М.В., Хирманов В.Н., Зыбина Н.Н. Модель метаболического синдрома, вызванного кормлением фруктозой: патогенетические взаимосвязи обменных нарушений. Медицинский академический журнал. 2011; 11: 23-27.
4. Лещенко Д.В., Костюк Н.В. Диетически индуцированные животные модели метаболического синдрома. Верхневолжский медицинский журнал. 2015; 14: 34-39.
5. Kleiner D.E., Makhlouf H.R. Histilogy of Nonalcoholic Fatty Liver Disease and Nonalcoholic Steatohepatitis in Adult and Children. Clin Liver Dis. 2016; 20(2): 293-312.
6. Lankin V.Z., Konovalova G.G., Tikhaze A.K., Shumaev K.B., Kumskova E.M., Viigimaa M. The Initiation of the Free Radical Peroxidation of Low Density Lipoproteins by Glucose and Its Metabolity Methylglyoxal: a Common Molecular Mechanismof Vascular Wall Injure in Atherosclerosis and Diabetes. Mol. Cell. Bichem. 2014; 395: 241-252.
7. Медведев И.Н. Динамика нарушений внутрисосудистой активности тромбоцитов у крыс в ходе формирования метаболического синдрома с помощью фруктозной модели. Вопросы питания. 2016; 85: 42-46.
8. Lim J.S. et al. The role of fructose in the pathogenesis of nonalcoholic fatty liver disease and the metabolic syndrome. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 2010; 5: 251-264.
9. Syaoyan Chu, Kirgizova O.Yu. Metabolic syndrome: some results and prospects for solving the problem. Byulleten' VSNC SO RAMN. 2016; 1: 187-194.
Поступила после доработки 25 июня 2020 г.
BIOCHEMICAL MARKERS OF LIVER DAMAGE WITH A FRUCTOSE-INDUCED DIET IN RATS
© O.G. Gileva, 2020 O.G. Gileva
Post-graduate Student,
Department of Clinical Biochemistry and Laboratory Diagnostics, Izhevsk State Medical Academy (Izhevsk) E-mail: kld.igma@mail.ru
Relevance. The increased content of fructose as a common source of carbohydrates in foods leads to metabolic disorders in the body, which may be due to biochemical characteristics of fructose metabolism. The result is an increased risk of obesity, diabetes mellitus, cardiovascular diseases, as well as liver diseases induced by the formation of oxidative stress amid changes in lipid and carbohydrate metabolism. The destructive processes in the liver may be indicated by an increase in the content of the main markers of hepatocyte cytolysis: alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), alkaline phosphatase (ALP), lactate dehydrogenase (LDH). Objective. To create an experimental model of the development of inflammatory processes in the liver under the influence of a fructose-induced diet.
Material and methods. The study was conducted on 50 male rats with a body weight of 250-300 g. Animals were divided into experimental and control groups of 25 animals each. Rats of the control group received a balanced diet of vivarium, animals of the experimental group received a diet containing 60% fructose of daily calories. On the 60th day, the formation of metabolic deviations in the long-term was evaluated. In the obtained serum, the content of glucose, cholesterol (cholesterol), low-density lipoproteins (LDL), triglycerides (TG), insulin, the activity of ALT, AST, alkaline phosphatase, LDH were studied. Biochemical studies were carried out on an automatic analyzer AU-480 (Beckman Coulter, USA) using reagents of the same manufacturer. The insulin content was determined on an enzyme-linked immunosorbent analyzer StatFax-2100 (Awareness Technology, USA) using a set of reagents LLC Vector-best, Russia. Indices of insulin resistance were calculated.
Results. During the study, there was a tendency to an increase in glucose concentration with a significant increase on the 21st and 60th day of the experiment by 1.18 and 1.21 times, respectively, and cholesterol on the 35th day of the experiment by 1.59 times relative to the control in rat blood serum. The insulin concentration significantly increased throughout the experiment, exceeding the control values by 1.5, 1.7, and 1.9 times on the 21st, 35th, and 60th days of the experiment. The insulin resistance indices also differed
from the control values, which may indicate the formation of insulin resistance. The LDL content was statistically significantly increased throughout the experiment.
During the experiment, there was an increase in the activity of hepatocyte cytolysis markers with a significant increase compared with the control. A decrease in the de Ritis coefficient confirms the activation of cytolytic processes in the liver. Conclusion. Thus, a fructose-induced diet increases the content of specific rat liver enzymes (ALT, AST, ALP, LDH) against the background of disturbances in lipid and carbohydrate metabolism with increased concentrations of cholesterol, triglycerides, LDL, as well as glucose and insulin, the formation of insulin resistance. The reason for the initiation of cytolytic processes in hepatocytes may be free-radical oxidation of protein-lipid complexes and activation of inflammatory reactions as a result of increased consumption of fructose.
Key words: fructose, carbohydrate metabolism, lipid metabolism, enzyme activity, cytolysis markers, hepatocytes.
For citation: Gileva O.G. Biochemical markers of liver damage with a fructose-induced diet in rats. Problems of biological, medical and pharmaceutical chemistry. 2020;23(9):53-58. https://doi.org/10.29296/25877313-2020-09-08
REFERENCES
1. Dolgov V.V. Klinicheskaja laboratornaja diagnostika: Nacional'noe rukovodstvo. M.: GJeOTAR-Media, 2017; 808.
2. Pavlova Z.Sh., Golodnikov I.I., Kamalov A.A. Biohimicheskie mehanizmy razvitija nealkogol'noj zhirovoj bolezni pecheni pod vozdejstviem fruktozy. Tehnologii zhivyh sistem. 2018; 15: 18-27.
3. Reshetnjak M.V., Hirmanov V.N., Zybina N.N. Model' metabolicheskogo sindroma, vyzvannogo kormleniem fruktozoj: patogeneticheskie vzaimosvjazi obmennyh narushenij. Medicinskij akademicheskij zhurnal. 2011; 11: 23-27.
4. Leshhenko D.V., Kostjuk N.V. Dieticheski inducirovannye zhivotnye modeli metabolicheskogo sindroma. Verhnevolzhskij medicinskij zhurnal. 2015; 14: 34-39.
5. Kleiner D.E., Makhlouf H.R. Histilogy of Nonalcoholic Fatty Liver Disease and Nonalcoholic Steatohepatitis in Adult and Children. Clin Liver Dis. 2016; 20(2): 293-312.
6. Lankin V.Z., Konovalova G.G., Tikhaze A.K., Shumaev K.B., Kumskova E.M., Viigimaa M. The Initiation of the Free Radical Peroxidation of Low Density Lipoproteins by Glucose and Its Metabolity Methylglyoxal: a Common Molecular Mechanismof Vascular Wall Injure in Atherosclerosis and Diabetes. Mol. Cell. Bichem. 2014; 395: 241-252.
7. Medvedev I.N. Dinamika narushenij vnutrisosudistoj aktivnosti trombocitov u krys v hode formirovanija metabolicheskogo sindroma s pomoshh'ju fruktoznoj modeli. Voprosy pitanija. 2016; 85: 42-46.
8. Lim J.S. et al. The role of fructose in the pathogenesis of non-alcoholic fatty liver disease and the metabolic syndrome. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 2010; 5: 251-264.
9. Syaoyan Chu, Kirgizova O.Yu. Metabolic syndrome: some results and prospects for solving the problem. Byulleten' VSNC SO RAMN. 2016; 1: 187-194.
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений»
приглашает к сотрудничеству фармпроизводителей и сельхозпредприятия для совместного продвижения наших научных разработок. Мы предлагаем лекарственные фитопрепараты к производству и агротехнологии лекарственных и ароматических культур для выращивания в различных регионах России
Тел. контакта: 8(495)388-55-09; 8(495)388-61-09; 8(495)712-10-45 Fax: 8(495)712-09-18 e-mail: vilarnii.ru www.vilarnii.ru
