CC BY
37
© Любимов A.B., 2001
УДК 615.324:638.1].017:616-001.8
БИОХИМИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ АНТИГИПОКСИЧЕСКОГО ЭФФЕКТА АПИПРЕПАРАТОВ НА УРОВНЕ МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ДЫХАТЕЛЬНОЙ ЦЕПИ
А.ВЛюбимов
Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П.Павлова
В статье показана характеристика процессов клеточного дыхания в ткани миокарда и головного мозга. Приведены результаты коррекции ишемического и гипоксического повреждения с помощью апипрепаратов.
Поиск эффективных и безопасных средств профилактики и лечения гипок-сических и ишемических состояний является актуальной и социально значимой проблемой современной медицины [10, 13].
Одним из путей решения этой проблемы является имеющее многовековую историю использование продуктов жизнедеятельности медоносных пчел [4, 5].
Интерес к применению апипрепаратов в комплексной терапии больных с заболеваниями, в патогенезе которых ведущее значение имеет гипоксия, за последние годы значительно усилился
П.2].
Рациональное включение апипрепаратов в терапию таких заболеваний позволяет быстрее добиться положительных результатов, способствует уменьшению побочных действий лекарств, а в некоторых случаях - сэкономить материальные затраты пациента на лечение [11].
Достоинства этого способа лечения связаны, прежде всего, с уникальным сочетанием высокой степени безопасности и эффективности продуктов
пчеловодства, позволяющей при необходимости проводить их назначение практически неограниченными по продолжительности курсами, их относительной дешевизной и доступностью [5], а также с совершенствованием технологических возможностей обработки и углубленным изучением терапевтических свойств меда, маточного молочка, цветочной пыльцы [3].
Традиционный подход к решению вопроса о наличии и выраженности ан-тигипоксической активности продуктов пчеловодства, сложившийся в последнее десятилетие в ведущих исследовательских центрах Российской Федерации, занимающихся апипрепаратами
- НИИ пчеловодства (г. Рыбное, директор Н.И.Кривцов) и кафедре фармакологии с курсом фармакотерапии ФПДО Рязанского государственного медицинского университета имени академика И.П.Павлова (зав. кафедрой -Заслуженный деятель науки РФ, д.м.н., профессор В.Г.Макарова) заключается в оценке косвенных показателей (в основном, по степени нарушений метаболизма и деградации биомембран). В последние годы эти показатели стало
возможным дополнить показателями газового состава крови (отражающими только степень завершенности патологического процесса, но не его механизмы).
К сожалению, отсутствие исследований по изучению направленности и выраженности эффектов апипрепара-тов на ключевые параметры, отражающие состояние тканевого дыхания, несомненно, делает неопределенными перспективы использования этих средств для коррекции гипоксических состояний. В свою очередь, отсутствие четких критериев оценки возможной антигипоксической активности биологически активных продуктов пчеловодства, уже используемых эмпирически в комплексной фармакотерапии гипоксических состояний, несомненно, снижает эффективность их применения.
Целью работы явилось выявление прямых ключевых показателей, отражающих особенности тканевого дыхания для последующей оценки гипокси-ческой гипоксии и ишемии миокарда и головного мозга, а также изучение направленности и выраженности изменений этих показателей при назначении биологически активных продуктов пчеловодства - маточного молочка и биологически активной добавки «Апито-нус», содержащей 98% меда и 2% маточного молочка.
В качестве препарата сравнения для подобного рода исследований в настоящее время наиболее целесообразно использование препарата «Олифен»
- единственного зарегистрированного в Российской Федерации антигипок-санта.
Для выбора ключевых показателей оценки антигипоксического эффекта необходимо четко представлять процесс тканевого дыхания, который представлен двумя системами энергетичес-
кого метаболизма, обеспечивающими возможность функционирования как в аэробных, так и в анаэробных условиях. Система аэробного окисления субстрата представлена митохондриальной дыхательной цепью (является основной системой энергообеспечения в организме человека), и система анаэробного окисления субстрата, локализованная в цитоплазме и состоящая из набора ферментов гликолиза (у человека значима только в эритроцитах, обеспечивает возможность беззатратного переноса кислорода в ткани). Человек относится к строгим аэробам и прекращение доступа воздуха уже через несколько минут может завершиться летально в результате прекращения работы митохондриальных дыхательных цепей, в первую очередь, в клетках головного мозга [6].
Вышеописанные обстоятельства, в совокупности с учетом более высокого КПД аэробного окисления (38 молекул АТФ на молекулу глюкозы, против 2 молекул АТФ при анаэробном гликолизе), определяют ключевую роль митохондриальной дыхательной цепи, её нарушений и их коррекции в профилактике и лечении гипоксических СОСТОЯНИЙ.
Принято считать, что митохондриальная дыхательная цепь состоит из четырех групп ферментов и белков, локализованных на внутренней мембране органелл [8]. Подобные группы ферментов принято называть комплексами, которые нумеруют римскими цифрами от I до IV. Перенос восстановленных эквивалентов между комплексами обеспечивают убихинон (между I, II и Ш) и низкомолекулярный белок цитохром С (между III и IV). Энергетическими субстратами являются: в
I комплексе - НАДН, а во II комплексе - сукцинат (продукт цикла трикар-
боновых кислот). Конечным продуктом дыхательной цепи является АТФ. При снижении парциального давления кислорода происходит переключение аэробного окисления на гликолиз с повышением содержания молочной кислоты в тканях, снижением уровня АТФ и повышением уровней АДФ и АМФ. Подобная схема дает четкое представление о необходимости количественной оценки указанных веществ для анализа процессов, происходящих в условиях гипоксии, выявления уровня гипок-сического повреждения и возможности направленной фармакотерапии.
Материалы и методы
Исследовали уровни лактата, АТФ, АДФ, АМФ, НАДН и убихино-на в гомогенатах головного мозга и миокарда при моделировании острой гипоксической гипоксии и тотальной ишемии [7,12]. Гомогенаты тканей (аппаратура “Diax-900”) экстрагировали в 50% изопропаноле с последующим градиентным разгоном в ацетонитриле и 1% ортофосфорной кислоте (ВЭХЖ “Stayer”, колонка “Luna 5u” С-18, со стандартами 1CN, на 190-600 нм, с фильтрационным шагом в 10 нм, при 200еС). Анализ данных проводился в среде “Мультихром” (версия 2,0 «Аквилон»),
Результаты и их обсуждение
При гипоксии/аноксии наблюдали кратковременное повышение потребления НАДН и увеличение продукции АТФ (на 17-22%). Затем происходит быстрое падение темпов синтеза АТФ, содержание которого вскоре начинает снижаться (ниже исходного уровня), и нарастание уровней АДФ и АМФ. Завершение патологического процесса характеризовалось резким (на 94-149%) нарастанием уровня молочной кислоты. Предварительное назначение (по
схемам, рекомендованным производителями) маточного молочка, Апитону-са и олифена равновыраженно (в большей степени у Апитонуса) сдерживало процесс накопления лактата (достоверно увеличивалось время наступления «скачка» лактата).
Основные процессы, протекающие в митохондриальной дыхательной цепи, не изучены полностью и в настоящее время. Существуют 3 различных теории синтеза АТФ в условиях аэробного окисления субстрата - химическая, конформационная и хемиосмоти-ческая.
Хемиосмотическая теория, предложенная в 1961 г. английским биохимиком П итером Митчеллом [ 14] достаточно долгое время не имела экспериментальных подтверждений, но прошли годы, и исследователи разных стран единодушно её признали. Значительный вклад в утверждение новой концепции внес основатель отечественной школы биоэнергетики В.В.Скулачев
[9].
Согласно данной теории окисление субстрата ферментом - акцептором электронов - происходит на одной из сторон мембраны митохондрий. В результате этой реакции электрон присоединяется к ферменту дыхательного комплекса, а образовавшийся в результате окисления субстрата протон высвобождается из мембраны и уходит в воду. Затем электрон переносится ферментом на другую сторону мембраны и там он восстанавливает кислород или другой фермент, проявляющий акцепторные свойства к электрону. При восстановлении кислорода или фермента происходит связывание протонов по другую сторону мембраны. В процессе дыхания происходит направленный перенос протонов из одного отсека в другой, а разделительная мембрана препятствует восстановлению
равновесия между отсеками. Концентрирование протонов по одну сторону мембраны в процессе дыхания представляет собой осмотическую работу по переносу ионов в пространстве против градиента их концентрации. В процессе окисления субстрата и восстановления кислорода совершается также химическая работа. Осмотическая энергия, накопленная в виде разности концентраций протонов между двумя отсеками, разделенными мембраной, расходуется на химическую работу, то есть на синтез АТФ. Система митохондриального окисления субстрата выполняет не только осмотическую и химическую, но и электрическую работу. Выбрасывая из одного резервуара однозарядные ионы и перенося их через мембрану в другой резервуар, такая система осуществляет зарядку биологической мембраны как электрического конденсатора, когда по разные стороны мембраны концентрируются ионы с противоположными зарядами.
С учетом хемиосмотической теории процесс гипоксического повреждения можно рассматривать, как одну из разновидностей стрессорных состояний и в соответствии с законом Селье следует ожидать три фазы ответа организма на этот стресс (что, в конечном счете, и проявилось в нашем исследовании). На первой фазе - фазе возбуждения, происходит усиление активности НАДН-зависимого пути окисления субстрата и увеличение продукции АТФ. Длительность фазы возбуждения определяется продолжительностью и интенсивностью его проявления (в нашем исследовании более выражена, но кратковременна в головном мозге). Фаза возбуждения сменяется фазой адаптации, с увеличением доли восстановленных форм дыхательных ферментов и ингибированием I комплекса.
Увеличивается доля восстановленных форм убихинона, в клетке накапливаются НАД-зависимые субстраты цикла Кребса. В этот период, несмотря на нарушение работы I комплекса за счет скомпенсированной работы II комплекса, внутриклеточная концентрация АТФ остается почти неизменной. По мере развития гипоксии и снижения запасов кислорода в тканях развивается заключительная фаза реакции организма на стресс - фаза истощения, с последовательным подавлением функций комплекса III и снижением уровня макроэргов, а затем с резким накоплением лактата вследствие активации гликолиза [6].
Выводы
1. Результаты исследования позволяют выделить определенную стадийность развития гипоксического повреждения на используемых моделях, с точным значением уровня и степени поломки дыхательных процессов, так и определить наличие и выраженность антигипоксического эффекта исследуемых препаратов.
2. В последующих исследованиях необходимо провести углубленное изучение изменений работы дыхательной цепи (с количественной оценкой комплексов I-IV и переносчиков), в том числе - с измерением митохондриального трансмембранного потенциала.
ЛИТЕРАТУРА
1. Галиновский С.П. Антиоксидант-ная терапия продуктами пчеловодства // Апитерапия сегодня. - Рыбное, 2000. -С. 161-163.
2. Грибков A.A. Апитерапия при ревматоидном артрите И Апитерапия сегодня. - Рыбное, 2000. - С. 122-124.
3. Кривцов Н.И. Состояние и перспективы развития индустрии биологичес-
ки активных продуктов пчеловодства для апитерапии // Апитерапия сегодня. - Рыбное, 2000. - С. 3-6.
4. ЛудянскийЭ.А.Апитерапия.-Вологда, 1994. - 461 с.
5. Макарова В.Г., Узбекова Д.Г., Се-менченко М.В. и др. Продукты пчеловодства: биологические и фармакологические свойства, клиническое применение. - Рязань, 2000. - 127 с.
6. Медведев Ю.В., Толстой А.Д. Гипоксия и свободные радикалы в развитии патологических состояний организма -М.: ООО «Терра-Календер и Промоушн», 2000.- 232 с.
7. Романов Б.К. Влияние дигоксина и верапамила на электролитный баланс и активность лизосомальных ферментов миокарда при гипоксической гипоксии: Дис. ... канд. мед. наук. - Рязань, 1994. - 160 с.
8. РубинА.Б., ШинкаревВ.П. Транспорт электронов в биологических системах.-М., 1984.-С. 6-21.
9. Скулачев В.П. Энергетика биологических мембран. - М.: Наука, 1989. -564с.
10. Утешев Б.С. Атеросклероз. Лекарства, которые вы принимаете. - М., 1999. -224 с.
11. Фомина В.А., Окороков В.Г., Глаз-кова Е. А. и др. Апитерапия в кардиологии / / Апитерапия сегодня. - Рыбное, 2000. -С.149-151.
12. Фомина В.А. Клинико-экспериментальное исследование гиполипидемической и противоишемической активности маточного молочка и апикомпозиций с его включением: Дис. ... канд. мед. наук. - Рязань, 2000,- 152 с.
13. Шпетков А.В. Кардиология: ключи к диагнозу. - М., 2000. - 174 с.
14. Mitchell P. Coupling of phosphorylation to electron and hydrogen transfer by a chemiosmotic type of mechanism // Nature. - 1961. - Vol.191. - P. 144-148.
BIOCHEMICAL RESEARCHES OF ANTIHY POXICAL EFFECT OF APYTHERAPY AT A MITOCHONDRIAL RESPIRATORY CIRCUIT LEVEL
A.V.Lyubimov
In the article the performance of processes of cell-like breath in a miocard and head brain is shown. The outcomes of a correction ischemic and hypoxical damage with the help of apytherapy are indicated.
