CC BY
55
УДК 581.19:582.293.346.01 7.3
< "nT
При изучении науки примеры полезнее правил.
Исаак Ньютон
Резюме. Проведен сравнительный анализ показателей активности эндогенныхлектинов, содержания общего азота, лишайниковых кислот, аминокислотного состава белков в лишайнике Cladonia stellaris, собранном на юге Беларуси и в Центральной Якутии. Показано, что в зависимости от среды обитания у исследуемого вида формируются специфические механизмы биохимической адаптации. При этом в белорусских образцах наблюдается аккумуляция антистрессовых метаболитов, общего азота и водорастворимых белков, изменение соотношения ряда заменимых и незаменимых протеиногенных аминокислот на фоне снижения функциональной активности лектинов таллома, что может являться одной из причин уязвимости данного вида вблизи южной границы ареала распространения. Ключевые слова: биохимическая адаптация, белки, аминокислоты, лектины, общий азот, лишайниковые кислоты, Беларусь, Якутия.
V
Лишайник Cladonia stellaris (Opiz) Pouzar & Vezda из рода Cladonia Hill ex P. Browne (Cladoniaceae Zenker), обладая гибкой адаптивной стратегией, характеризуется мультирегиональным распространением и поразительной устойчивостью к экстремальным условиям существования в бореальных и субарктических экосистемах [1, 2]. При этом один из естественных лимитирующих факторов для данного вида - южные границы ареала. Молекулярные механизмы подобного феномена не ясны, поскольку адаптивные изменения метаболизма в лишайниках остаются все еще недостаточно исследованными, несмотря на то что, являясь в значительной степени специфичными, они имеют сходство с таковыми высших растений.
Вместе с тем большинство работ по различным аспектам метаболизма у представителей лихенобиоты, в том числе первичного и вторичного обмена, проводились с циано-бионтными лишайниками, которые содержат в качестве фотобионта синезеленые водоросли. Однако сравнительно мало подобных исследований в отношении хлоробионтных лишайников, фотобионтом которых являются зеленые водоросли [3]. Заметный интерес представляет изучение влияния среды обитания хлоробионтных лишайников на состояние азотного обмена, имеющего универсальное значение, и содер-
Биохимические
л v. 1/п,- / _
Ä ^wLsSf i ^ :
аспекты
адаптивнои
уит-и ч
шегии
1LPR
I
НАУЧНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ
Рис. 1. Места сбора лишайника С. stellaris на юге Беларуси и в Центральной Якутии
Рис. 2.
Электрофореграмма водорастворимых белков С. stellaris: 1 - из Беларуси, 2 - из Якутии, 3 - маркеры молекулярных масс
жание лишайниковых веществ, специфичных только для лихенизированных грибов. Недостаточно проработаны вопросы об участии в механизмах адаптивного метаболизма хлоробионтных лишайников таких биомолекул, как гликопро-теины семейства лектинов, стрессовые аминокислоты, лишайниковые вещества.
Лектины - это гликопротеины неиммунного происхождения, способные избирательно и обратимо связывать углеводные детерминанты на поверхности клеток благодаря наличию в структуре молекулы углеводсвя-зывающих сайтов. Лектины выполняют интегральные функции в растениях, принимая участие в регуляции процессов жизнеобеспечения, в том числе в формировании симбиотических отношений между системно различными организмами [4]. Показано, что данные белки вовлечены в реализацию лишайникового симбиоза на ранних стадиях специфического распознавания между мико- и фитобионтом, селективного взаимодействия между симбиотическими партнерами, в развитии функционально активного таллома. Существует мнение, что актив-
ность лектинов таллома отражает физиологический статус лишайника в целом [5, 6].
Среди полифункциональных модуляторов адаптивного метаболизма важную роль играют некоторые стрессовые аминокислоты, в частности свободный пролин и его производные (в том числе гидроксипролин), обладающие сигнально-регуляторными, протекторными и антиоксидантными свойствами [7, 8]. Лишайниковые вещества характеризуются протекторным и аллелопатическим действием и выполняют, по-видимому, целый ряд функций: участвуют в регуляции водного обмена, фотосинтеза, дыхания, конкурентных отношений [9].
Цель нашей работы - сравнительное исследование показателей активности лектинов; содержания белка, его компонентного и аминокислотного состава, свободного пролина и/ или его производных, общего азота и лишайниковых кислот в талломах С. stellaris, обнаруженного вблизи южной границы ареала на юге Беларуси и широко распространенного в Центральной Якутии.
Эпигейный кустистый лишайник С. stellaris относится к гипоарктомонтанным видам и содержит в качестве фотобионта зеленые водоросли рода Asterochloris Е. ТзеЬегшак-Шоезз [10]. Отбор образцов проводили весной и ранним летом 2015-2016 гг. на территории Калинковичского района Беларуси в сосняке (52°27' М 29°17' Е) и в окрестностях города Якутска Центральной Якутии также в сосняке (61°55' М 129°31' Е) (рис. 1).
Калинковичский район расположен в центре Гомельской области на юге Беларуси. Климат в регионе умеренно континентальный, с теплым летом и мягкой зимой. Средняя температура января составляет минус 5-6 °С, июля - плюс 18-19 °С. Годовое количество осадков колеблется в пределах 550650 мм. Здесь один из самых продолжительных в стране вегетационных периодов (191-209 дней), благоприятных для выращивания различных сельскохозяйственных культур, в том числе теплолюбивых [11].
Центральная Якутия охватывает территорию, в состав которой входят Центрально-Якутская низменность и часть Лено-Алданского плато. Климат здесь резко континентальный. Средняя температура января - около 43,2 °С ниже нуля; июля - +18,7 °С. Вследствие низких зимних и высоких летних температур годовые амплитуды достигают рекордных значений,
Ботаника
I
как нигде на земном шаре. Средние амплитуды в Якутске равны 62 °C, абсолютные - 100 °C и более. Суточные колебания температуры в летние месяцы составляют порядка 10 °C. Низкая относительная влажность воздуха и малое количество осадков (в среднем около 300 мм в год) делают Центральную Якутию близкой к засушливым степным и полустепным районам. Развитие местных ландшафтов определяет вечная мерзлота [12].
Видовую принадлежность лишайников устанавливали стандартными методами световой микроскопии. Талломы изучались под бинокулярной лупой Zeiss Stemi 2000-C. Кроме того, их микроскопические срезы исследовали с помощью микроскопа Micros MCX 100, вторичные лишайниковые вещества - методом тонкослойной хроматографии [13]. Для биохимического анализа использовали талломы, предварительно высушенные до воздушно-сухого состояния при комнатной температуре в течение 7 дней. Непосредственно перед экспериментами растительный материал измельчали на лабораторной мельнице.
Активность эндогенных лектинов в талломах лишайников (в ЕД/г сухой массы) определяли по [14]. Для оценки содержания общего азота в талломах (в мг/г сухой массы) использовали реактив Несслера [15]. Водорастворимые белки лишайника выделяли путем 24-часовой экстракции измельченных талломов в 0,9%-ном растворе NaCl в соотношении 1: 4 при постоянном перемешивании на магнитной мешалке при температуре 8 °С. Экстракт отжимали через капроновую ткань и центрифугировали при 10 000 об/мин в течение 15 мин. Концентрацию белка определяли по [16]. Содержание водорастворимых белков в талломах выражали в мкг/г сухой массы. Электрофоретиче-ский анализ полученных белков проводили по методу Лэммли [17]. Для оценки компонентного состава пептидного спектра использовали маркеры молекулярных масс 20-245 кДа (BLUelf Prestained Protein Ladder, GeneDireX Inc., Taiwan). Анализ электрофореграмм осуществляли посредством компьютерной программы Gel Analyzer. Аминокислотный состав белков лишайников (в %) исследовали на анализаторе Aracus (Германия). Пробоподготовку проводили в соответствии с методическими рекомендациями. Поскольку в ходе кислотного гидролиза белков аминокислота триптофан разрушается, ее наличие определяли посредством щелочного гидролиза [18]. Содержание свободного пролина
Показатель Беларусь Якутия
Общий азот, мг/г сухой массы 8,37 ± 0,09* 3,29 ± 0,04
Водорастворимые белки, мкг/г сухой массы 297,60 ± 6,70* 64,50 ± 3,90
Свободный пролин и/или его производные (гидроксипролин), в мкг/г сухой массы 177,50 ± 1,90* 80,20 ± 0,60
и/или его производных в лишайниках (в мкг/г сухой массы талломов) определяли с помощью нингидринового реагента 19]; перлатолиевой и усниновой кислот (%) - методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на приборе «Милихром А-01» («Эконова», Россия) [20].
В работе представлены средние значения показателей и их стандартные отклонения. Для расчетов использовали пакет программ статистического анализа АпаГ^БоЙ:, Б1а1Р1ш. Значимость отличий между средними значениями оценивали, используя критерий Манна - Уитни (И-тест) при р<0,05.
Данные по содержанию в талломе С. stellaris общего азота, водорастворимых белков, свободного пролина и/или его производных представлены в табл. 1: показатели в образцах лишайника из Беларуси значительно выше, чем в якутских.
Анализ электрофореграмм водорастворимых белков позволил выявить некоторые различия в высоко- и среднемолекулярной областях полипептидного спектра (рис. 2). Так, в спектре белков из таллома якутских образцов по сравнению с белорусскими наблюдались: элиминация полипептидов с молекулярной массой между 135 и 100 кДа, 75 и 63 кДа; обед-ненение спектра между 20 и 35 кДа, 35 и 48 кДа. Во всех анализируемых образцах отмечено присутствие пептидов с молекулярной массой около 48 кДа и менее 20 кДа.
По активности эндогенных лектинов в талломах исследуемых лишайников прослежива-
6000
и 5000
4000
о 3000
2000
1000
Беларусь
Якутия
Таблица 1. Влияние условий произрастания на показатели содержания общего азота, водорастворимых белков, свободного пролина и/или его производных в талломе С. stellaris
* - различия достоверны при p<0,05
Рис. 3.
Активность
эндогенных
лектинов
в талломах
лишайника
С^еНапз,
собранных
в Беларуси
и Якутии
* - различия достоверны при р < 0,05
67
0
НАУЧНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ
Таблица 2. Аминокислотный состав и биологическая ценность белков (БЦБ) лишайника С. stellaris из Беларуси и Якутии,%
* - незаменимые аминокислоты
Таблица 3.
Влияние условий произрастания на содержание лишайниковых веществ в талломах С. stellaris
* - различия значимы при р<0,05
Аминокислота, % Беларусь Якутия
Аспарагиновая кислота 10,72 10,52
Треонин* 6,81 6,31
Серин 5,01 5,35
Глутаминовая кислота 14,20 13,19
Глицин 7,26 7,27
Аланин 8,42 10,71
Валин* 4,56 5,45
Метионин* 0,80 0,86
Изолейцин* 3,72 4,30
Лейцин* 7,34 7,17
Тирозин 0,94 1,34
Фенилаланин* 4,02 3,35
Гистидин 8,28 8,99
Лизин* 6,08 6,40
Аргинин 6,41 4,78
Пролин 4,90 3,25
Триптофан* 0,46 0,76
Сумма аминокислот 99,93 100,00
Сумма незаменимых аминокислот 33,79 34,60
Сумма заменимых аминокислот 66,14 65,40
БЦБ, % 62,35 66,65
Локалитет лишайников Вид лишайника Содержание лишайниковых кислот, % от сухой массы
УК ПЛК
Беларусь, Калинковичский район Гомельской области, сосняк (52°27' Ы, 29°17' Е) С. 51е11ап5 0,7 ± 0,1 1,9 ± 0,2*
Россия, Центральная Якутия, окрестности г. Якутска, сосняк (61°55' Ы, 129°31' Е) С. 51е11ап5 0,9 ± 0,2 0,9 ± 0,3*
лось увеличение данного показателя у экземпляров из Якутии (рис. 3).
Анализ аминокислотного состава белков С. stellaris позволил выявить 17 аминокислот (табл. 2). Согласно полученным данным, в якутских образцах отмечена тенденция к увеличению содержания аминокислот валина, мети-онина, изолейцина, триптофана, аланина, тирозина, а также биологической ценности белка (БЦБ). Для C.stellaris из Беларуси наблюдалось некоторое увеличение содержания треонина, фенилаланина, глутаминовой кислоты, аргинина, пролина, но снижение БЦБ.
Установлено, что компонентный состав лишайниковых кислот анализируемых образцов не зависел от места отбора проб. Содержание перлатолиевой кислоты (ПЛК) в талломах С. stellaris из Беларуси было вдвое больше, чем у лишайников, собранных в Якутии. Однако по содержанию усниновой кислоты (УК) достоверных различий не наблюдалось (табл. 3).
Обсуждая полученные результаты, необходимо отметить следующее.
Наблюдаемые особенности метаболизма С. stellaris в контрастных условиях обитания согласуются с общим принципом адаптивной стратегии лишайников как пойкилогидри-ческих организмов, а именно - подчинения организма влиянию факторов среды, сопровождающегося изменениями интенсивности обмена веществ. Данный подход ассоциирован с вынужденным ограничением периодов физиологической активности и временным снижением интенсивности обменных процессов, формированием разнообразных механизмов устойчивости на анатомо-морфологи-ческом, физиологическом и метаболическом уровнях. В совокупности это позволяет сохранить как энергетические ресурсы, так и структурно-функциональную целостность важнейших биополимеров (нуклеиновых кислот, белков и др.) [21].
Изменение активности эндогенных лек-тинов в составе исследованных образцов С. stellaris в зависимости от локалитета свидетельствует о вовлечении данной категории белков в процесс адаптации, что согласуется с мнением о том, что фитолектины участвуют в реализации механизмов стрессоустойчивости, как это имеет место у высших растений [4]. Предположительно, снижение активности лек-тинов в образцах С. stellaris из Беларуси свидетельствует о недостаточной функциональной активности талломов гипоарктомонтанного вида вблизи южной границы ареала.
Это может быть связано с менее благоприятным для лишайникового симбиоза повышенным содержанием общего азота и белка в белорусских образцах С. stellaris по сравнению с якутскими. Так, известно, что мико-бионт весьма чувствителен к избытку азота, который может стимулировать рост и деление фотобионта. Это, возможно, нарушает внутренний баланс симбиотических взаимоотношений и, не исключено, индуцирует синтез микобионтом перлатолиевой кислоты, обладающей фитотоксическим действием, в том числе в отношении самого фотобионта [22-24].
Увеличение показателя ПЛК в белорусских образцах С. stellaris может быть следствием более высокого уровня оводненности тканей таллома местных лишайников. Нельзя исключить и влияния на синтез лишайниковых веществ неблагоприятных факторов [9]. Однако мы полагаем, что для С. stellaris из Беларуси актуализируется
Ботаника
необходимость повышения не только стрессо-устойчивости, но и конкурентоспособности в отношении сосудистых растений. Возможно, более высокое содержание в этих образцах медуллярной ПЛК, обладающей свойством проявлять себя в аллелопатических связях за счет лучшей растворимости в воде, в отличие от кор-тексных, например усниновой кислоты, свидетельствует о ее участии в регуляции межвидовых конкурентных отношений, поскольку известно, что лишайниковые вещества играют важную роль в аллелопатическом взаимодействии лишайников с высшими растениями [25].
Формирование в белорусских С. stellaris специфических механизмов биохимической адаптации подтверждает и аккумуляция в талломах полифункциональных низкомолекулярных метаболитов, обладающих защитным действием, в частности свободного пролина и/или его производных (гидроксипролина), а также увеличение содержания в составе белков аминокислоты пролина.
Таким образом, полученные данные позволяют предполагать, что среда обитания С. stellaris на юге Беларуси по сравнению с Центральной Якутией менее благоприятна для лишайникового симбиоза, в том числе в контексте конкурентных отношений, что может являться одной из причин уязвимости данного вида вблизи южной границы ареала. СИ
Статья поступила в редакцию 08.09.2017 г.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Белорусского республиканского фонда фундаментальных исследований
№Б15СО-053
A comparative analysis of endogenous lectin activity, total nitrogen, lichenic acids, aminoacid content of proteins in Cladonia stellaris lichen collected in the south of Belarus and in Central Yakutia was carried out. It is shown that, depending on the environment, there are formed the specific mechanisms of biochemical adaptation in the test species. At the same time, accumulation of antistress metabolites, total nitrogen and water-soluble proteins, a change in the ratio of a number of interchangeable and irreplaceable proteinogenic aminoacids against the background of a decrease in the functional activity of thallus lectins are observed in Belarusian samples may be one of the reasons for the vulnerability of this species near the southern boundary of the distribution range.
http://innosfera.by/2017/12/Cladonia_stellaris
Ольга Канделинская,
ведущий научный сотрудник Института экспериментальной ботаники им. В.Ф. Купревича НАН Беларуси, кандидат биологических наук, доцент;
okandy@yandex.ru
Елена Грищенко,
научный сотрудник Института экспериментальной ботаники им. В.Ф. Купревича НАН Беларуси; helegreen@yandex.ru
Кристина Рипинская,
аспирант Института экспериментальной ботаники
им. В.Ф. Купревича НАН Беларуси; kristina.ripinskaya@gmail.com
Илья Прокопьев,
старший научный сотрудник Института биологических проблем криолитозоны Сибирского отделения РАН; кандидат биологических наук;
ilya.a.prokopiev@gmail.com
Галина Филиппова,
старший научный сотрудник Института биологических проблем криолитозоны Сибирского отделения РАН, кандидат биологических наук; nureeva@yandex.ru Павел Белый
старший научный сотрудник Центрального ботанического сада НАН Беларуси, кандидат биологических наук; pavel.bely@tut.by
ЛИТЕРАТУРА
- Гомель, 2013.
Цуриков А.Г. Лишайники юго-востока Беларуси.-
Рыкова Ю.В. Распространение и запасы лишайников на северо-востоке Якутии: растительность и почвы субарктических тундр.-Новосибирск, 1980. Mill bank J.W. Nitrogen metabolism in lichens / J.W. Millbank, K.A. Kershaw // New Phytologist. 1969. Vol. 68. P. 721-729.
Шакирова Ф.М. Современные представления о предполагаемых функциях лектинов растений / Ф.М. Шакирова [и др.] // Журнал общей биологии. 2007. Т. 68, №2. С. 100-125. Galun M. Lectins as determinants of symbiotic specificity in lichens / M. Galun, N. Kardish // " '44-148.
symbiosis / R.S. Singh, A.R. Walia //
Cryptog. Bot. 1995. Vol. 5
6. Singh R.S. Characteristics Symbiosis. 2014. Vol. 62. P
7. Szabados L. Proline: a mu
ichen lectins and their role i 3-134.
unctional amino acid / L. Szabados, A. Savouro // Trends in Plant Science. 2009. Vol. 15. P. 89-97.
8. Дударева Л.В. Низкоинтенсивное лазерное излучение изменяет аминокислотный состав каллусных тканей пшеницы / Л.В. Дударева, В.Н. Шмаков, А.М. Собенин и др. // Доклады Академии наук. 2012. Т. 446. C. 690-692.
9. Равинская А.П. Лишайниковые кислоты и их биологическая роль // Новости систематики низших растений. 1984. Т. 21. С. 160-179.
10. Окснер А.Н. Определитель лишайников СССР Вып. 2. Морфология, систематика и географическое распространение / отв. ред. И.И. Абрамов.- Ленинград, 1974.
11. Природа Беларуси: энциклопедия. В 3 т. Т. 2 / редкол.: В.Ю. Александров и др. [гл. ред. Т.В. Белова].- Минск, 2010.
12. Гаврилова М.К. Климат Центральной Якутии.- Якутск, 1973.
13. Orange A. Microchemical methods for the identification of lichens / A. Orange, P.W. James, F.J. White.- London, 2001.
14. Petit P. Purified phytolectin from the lichen Peltigera canina var canina which binds the phycobiont cell walls and its use as cytochemical marker in situ // New Phytologist. 1983. Vol. 94. P. 103-110.
15. Van Ginkel J.H. Determination of total nitrogen in plant material with Nessler's reagent by continuous-flow analysis / J.H. Van Ginkel, J. Sinnaeve // Analyst. 1980. Vol. 125. P. 1137-1216.
16. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. Vol. 72. P. 248-254.
17. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. Vol. 227. P. 680-685.
18. Horn M.J. A rapid colorimetric method for the determination of tryptophan in proteins and foods / M.J. Horn, D.B. Jones // J. Biol. Ghem. 1945. Vol. 157. P. 153-160.
19. Bates L.S. Rapid determination of free proline for water-stress studies / L.S. Bates, R.P. Waldren, I.D. Teare // Plant Soil. 1973. Vol. 39. P. 205-207.
20. Прокопьев И.А. Содержание вторичных метаболитов в лишайниках сосновых лесов Центральной Якутии / И.А. Прокопьев, Л.Н. Порядина, Г. В. Филиппова, А.А. Шеин // Химия растительного сырья. 2016. Т. 3. С. 73-78.
21. Kappen L. Opportunistic Growth and Desiccation Tolerance: The Ecological Success of Poikilohydrous Autotrophs. In: Functional Plant Ecology / L. Kappen, F. Valladares [eds. F. Pugnaire, F. Valladares].- New York, 2007.
22. Kralikova I. Response of lichens Cladonia arbuscula subsp. mitis and Cladonia furcata to nitrogen excess / I. Kralikova, M. Goga, I. Bil'ova et al. // Biologia. 2016. Vol. 71. P. 632-639.
23. Peres M.T. Phytotoxicity of Perlatolic Acid and Derivatives / M.T. Peres, A.C.S. Candido, O. Faccenda et al. // Brazilian archives ofbiology and technology. Agriculture, Agribusiness and Biotechnology. 2016. Vol. 59. P. 1-9.
24. Backor M. Allelopathic effects of lichen secondary metabolites on photobiont Trebouxia erici / M. Backor, V. Ivanova, H. Laatsch et al. // Allelopathy Journal. 2013. Vol. 31. P. 189-198.
25. Lawrey J.D. Biological Role of Lichen Substances // The Bryologist. 1986. Vol. 89. P. 111-122.
69
