CC BY
31
Биология и экспериментальная медицина
УДК 612.7+577.121+577.16+577.16.085
биохимическая оценка эффективности применения витаминов-антиоксидантов с и е при гиподинамии
А. В. Еликов, П. И. Цапок
Кировская государственная медицинская академия, г. Киров
На 78 взрослых беспородных крысах-самцах изучены энзиматическая активность и метаболиты белкового, пуринового обменов, состояние процессов липопероксидации и антиоксидантной защиты в плазме крови у животных при ограничении двигательной активности, а также эффект применения аскорбиновой кислоты и а-токоферола. Выявлены характерные особенности сдвигов метаболизма при ограничении мышечной активности. Показана роль изученных витаминов-антиоксидантов в коррекции метаболических нарушений при иммобилизационном дистресс-синдроме.
Ключевые слова: гиподинамия, метаболизм, стресс, липопероксидация, антиоксидантный баланс, витамины-антиоксиданты.
Введение
Состояние гиподинамии является фактором, сопутствующим многим заболеваниям и патологическим состояниям, нередко осложняющим их течение. Существенное значение это имеет при назначении длительного постельного режима, особенно при травматизме и заболеваниях сердечно-сосудистой системы. Установлено, что развитие иммобили-зационного дистресс-синдрома затрагивает не только скелетную мышцу, но и функционирование всех органов и систем организма [4, 5, 8]. Показано, что в развитии неблагоприятных сдвигов метаболизма при гиподинамии ведущую роль играет активация процессов липопероксидации (ЛП) и снижение ресурсов антиоксидантной защиты (АОЗ) организма [2].
Цель нашей работы — изучить показатели белкового, пуринового обменов,
состояние процессов ЛП и АОЗ в плазме крови у животных при ограничении двигательной активности, а также оценить эффект применения аскорбиновой кислоты и а-токоферола.
Материалы и методы исследования
Исследования проведены на 78 взрослых беспородных крысах-самцах массой тела 240—260 г. Состояние гиподинамии вызывалось помещением животных в индивидуальные клетки площадью 40 см2 (при существующей норме содержания 150 см2). Витамин С (аскорбиновая кислота) и витамин Е (а-токоферол) ежедневно вводили зондом в дозе 2 и 1 мг соответственно. Результаты сравнивали с контролем. Распределение животных по группам было следующим:
103
БИОЛОГИЯ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МЕДИЦИНА
1-я группа — контроль (интактные); 2-я — после 3-х недель гиподинамии; 3-я — после 3-х недель гиподинамии с применением аскорбиновой кислоты; 4-я группа — после 3-х недель гиподинамии с применением а-токоферола. Животных выводили из эксперимента путем декапитации в состоянии кратковременного эфирного наркоза соответственно на 7-й, 14-й, 21-й и 28-й день ограничения двигательной активности. цельную кровь центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 минут. Биохимические исследования проводили в плазме крови и эритроцитах. Количественное определение содержания общего белка (ОБ) проводили унифицированным методом по биуретовой реакции, используя стандартный набор реактивов. уровень креатинина изучали унифицированным методом, используя стандартные наборы реактивов «Ольвекс диагностикум» (Россия). уровень мочевины определяли с использованием диагностического набора реактивов «Агат» (Россия). Содержание среднемолекуляр-ных пептидов (СП) определяли по методу Н. И. Габриэлян с соавторами [1]. В работе использован модифицированный метод определения содержания СП, белка, глюкозы и креатинина в одной пробе [9]. Активность аспартатаминотрансферазы (АСТ) (К.Ф.2.6.1.1) и аланинаминотрансферазы (АлТ) (К.Ф.2.6.1.2) определяли стандартным набором реактивов «Lachema» (чехия); содержание мочевой кислоты (МК) — стандартным набором реактивов «Агат» (Россия); активность кислой фосфатазы (КФ) (К.Ф.3.1.3.2) — стандартным набором реактивов «Vital diagnostic» (Россия).
для изучения процессов лП использовали определение содержания малонового ди-альдегида (МдА) как вторичного продукта лП по реакции с тиобарбитуровой кислотой, спектрофотометрически при длине волны 535 нм на спектрофотометре «Shimadzu-
1240». Определение первичных продуктов лП измеряли интенсивностью хемилюми-несценции (хл), инициированной переоксидом водорода, в присутствии избытка ионов двухвалентного железа, за 30 (S30) и 60 (S60) секунд, а также максимальную вспышку хл (Im) за исследуемое время на хемилюмино-метре «Emilite-1105». Оценку общей антиок-сидантной активности (АОА) осуществляли хемилюминесцентным методом, определяя соотношение: уровень максимальной вспыш-ки/светосумма за 30 секунд (Im/S30). Определение диеновых конъюгатов (ЦК) проводили в гептановой фазе, после предварительной экстракции смесью гептан-изопропанол при длине волны 233 нм. Антирадикальная активность (АРА) определялась по степени обесцвечивания раствора 2,2-ди-фенил-1-пикрилгидразила при добавлении субстрата [3]. Содержание церулоплазмина (цП) изучали модифицированным методом с парафенилендиамином; уровень аскорбиновой кислоты (АК) — колориметрическим методом с динитрофенилгидразино-вым реактивом. Содержание а-токоферола (а-ТФ) определяли в эритроцитах с а-пири-дилдиацитилом. Полученный цифровой материал обработан методом вариационной статистики на IBM. Достоверность разницы определяли по t-критерию Стьюдента.
Результаты и их обсуждение
Нами изучены показатели, характеризующие состояние катаболических процессов в организме и относящиеся в основном к белковому и пуриновому обменам. установлено прогрессирующее нарастание проявлений иммобилизационного дистресс-синдрома, которые достигали максимума на 3-й неделе эксперимента. Биохимические показатели, характеризующие метаболические процессы на 3-й неделе эксперимента, и эф-
Пермский медицинский журнал
2010 том XXVII № 2
Таблица 1
Биохимические показатели плазмы крови крыс при иммобилизации в зависимости от применения аскорбата и а-токоферола (X±Sx; п=6)
Исследуемый показатель Группа
1-я 2-я 3-я 4-я
ОБ, г/л 73,8±3,3 77,0+4,5 75,6+3,2 74,9+2,9
СП, у. е. (Ех1000) 267+11 454+18* 393+22* 308+19*
Креатинин, мкмоль/л 52,0±2,9 27,7+1,6* 30,2+1,6* 40,1+2,2*
Мочевина, ммоль/л 3,72+0,38 8,65+0,73* 7,17+0,52* 6,22+0,48*
АСТ, мккат/л 0,27+0,03 0,74+0,02* 0,41+0,03* 0,33+0,04
АЛТ, мккат/л 0,17+0,03 0,47+0,01* 0,24+0,02* 0,22+0,03
МК, мкмоль/л 23,3+3,8 81,9+3,9* 52,4+3,2* 36,5+2,7*
КФ (общая), нмоль/с • л 378,1+31,2 742,9+43,6* 646,0+41,2* 535,2+37,3*
Примечание. * — различия по сравнению с контролем статистически достоверны.
фект применения АК и а-ТФ представлены в таблице 1.
результаты исследования белкового обмена. Нами установлено, по сравнению с контролем, увеличение содержания в плазме крови ОБ, СП и мочевины, при этом в наибольшей степени у животных 2-й группы (на 4,3 — 132,5%). Применение АК и а-ТФ оказывало существенное влияние на интенсивность катаболических процессов, и динамика количественных сдвигов данных биохимических показателей носила менее выраженный характер (на 2,4 — 92,7% и 1,5 — 67,2%) соответственно у 3-й и 4-й групп. Другим важным показателем белкового обмена является креатинин — конечный продукт превращения специфического макроэрга мышечной ткани — креатинфосфата. Наблюдаемое снижение содержания креати-нина в плазме крови при гиподинамии мы связываем с атрофическими процессами в скелетных мышцах. В результате снижается потребление мышцей креатина и, как следствие, снижение образования конечного продукта — креатинина. По нашему мнению, применение антиоксидантов в известной мере тормозит эти процессы, поэтому содержание креатинина в плазме крови жи-
вотных 3-й и 4-й групп выше по сравнению со 2-й. Увеличение энзиматической активности АСТ и АЛТ в плазме крови при гиподинамии мы связываем с двумя факторами:
1. Усиление катаболических процессов и, как следствие, интенсивности белкового обмена.
2. Деструкция мембран мышечных клеток вследствие усиления процессов ЛП с последующей ферментемией.
Изучение динамики сдвигов данных показателей показало зависимость от применения АК и а-ТФ и коррелирует с изменением других показателей белкового обмена.
результаты исследования пуриново-го обмена. У крыс, в отличие от человека, МК не является конечным продуктом обмена пуриновых оснований. Содержание этого метаболита у крыс на порядок ниже, чем у человека, однако сдвиги изучаемого показателя при ограничении мышечной деятельности могут характеризовать выраженность проявления иммобилизационного дистресс-синдрома. По нашему мнению, увеличение содержания МК связано с атрофическими процессами в мышечной ткани, деградацией мышечных клеток и распадом нуклеотидов. В то же время применение АК и а-ТФ оказы-
вало существенное влияние на содержание данного метаболита. Увеличение данного показателя у животных 3-й и 4-й групп (на 124,9% и 56,7%) соответственно ниже, чем у животных 2-й группы (на 251,5%) по сравнению с контролем.
Результаты исследования активности КФ. КФ представляет собой лизосомаль-ный фермент. По сравнению с человеком активность КФ предстательной железы у крыс невелика [11], тем не менее, по нашим данным, общая активность фермента в плазме крови у этих животных превышает активность в плазме крови у человека в норме. Увеличение активности КФ в плазме крови при ограничении двигательной активности мы связываем с усилением процессов ЛП. Как известно, продукты лП, особенно вторичный продукт — МДА, являются лабилизаторами мембран лизосом, что приводит к выходу содержащихся в них ферментов, способствует процессу атрофии мышечной ткани и усилению катаболических процессов. С этим согласуются выявленные изменения белкового и пуринового обменов. Таким образом,
определение активности КФ крови может служить маркером интенсивности данных процессов.
результаты исследования процессов лп и Аоз. Данные приведенных наблюдений представлены в таблице 2. Установлено, что ограничение двигательной активности приводит к возникновению оксидантного стресса, который, в свою очередь, во многом определяет патогенез иммобилизационного дистресс-синдрома и способствует резкому преобладанию процессов катаболизма. Истощение ресурсов АОЗ, что проявляется достоверным снижением в плазме крови АОА, АРА, а также содержания неферментативных ан-тиоксидантов АК и а-ТФ у животных 2-й группы приводит к резкому усилению процессов лП и накоплению начальных, промежуточных и конечных продуктов пере-кисного окисления липидов. В то же время увеличение в плазме крови активности ЦП мы связываем с развитием стрессовой реакции, а активность цП может служить маркером выраженности хронического стресса [10]. Так, у животных 2-й группы отмеча-
Таблица 2
Показатели липопероксидации и антиоксидантной защиты плазмы крови крыс при иммобилизации в зависимости от применения аскорбата и а-токоферола (X±Sx; п=6)
Исследуемый показатель Группа
1-я 2-я 3-я 4-я
МДА, нмоль/мл 2,76±0,16 12,70± 1, 10 * 2,97±0,19 * 4,08±0,28 *
ДК, у. е./г липидов 0,108±0,008 0,172±0,014 * 0,141±0,012* 0,122±0,011
ХЛ (1т), кФотон 106,7±3,8 129,5±5,2 * 119,4±4,7* 111,6±3,9
ХЛ (830), кФотон 1211,4±42,1 1932,8±86,1 * 1456,1±9,7 * 1312,9±58,7
ХЛ (860), кФотон 1991,8±63,9 3263,5±114,5 * 2398,0±81,1 * 2048,1±76,4
АОА (1т/830) 0,088±0,005 0,067±0,003 * 0,079±0,006 0,085±0,006
АРА, % ингибирования 66,5±1,4 55,3±1,0* 66,2±1,0 65,2±1,2
ЦП, мг/л 148,2±9,4 188,5±11,2* 169,4±9,9 * 163,8±9,6
АК, мг/л 18,7±0,7 11,2±0,6 * 20,4±0,8 14,9±0,7 *
а-ТФ (эритроциты), мг/л 4,6±0,3 2,1±0,2 * 3,4±0,2 * 5,2±0,3
Примечание. * — различия по сравнению с контролем статистически достоверны.
Пермский медицинский журнал
2010 том XXVII № 2
лось увеличение интенсивности ХЛ, ДК и МДА в 1,6—4,6 раза по сравнению с контролем.
Вместе с тем, применение природных ви-таминов-антиоксидантов С и Е в известной мере тормозило эти процессы, что связано с механизмом их действия [6, 7] и видно из полученных данных у животных 3-й и 4-й групп.
Выводы
1. Снижение ресурсов антиоксидантной защиты и усиление интенсивности процессов липопероксидации является одним из ведущих молекулярных механизмов, которые способствуют поломке компенсаторно-приспособительных механизмов организма. Это, в свою очередь, приводит к деградации клеточных мембран, ферментемии и резкому преобладанию процессов катаболизма.
2. Витамины-антиоксиданты, в частности аскорбиновая кислота и а-токоферол, действуя на одно из звеньев патогенеза им-мобилизационного дистресс-синдрома, существенно снижают эти проявления, что позволяет рекомендовать их в комплексной терапии состояний, связанных с ограничением двигательной активности.
3. Синхронное определение в плазме крови содержания общего белка, среднемо-лекулярных пептидов, мочевины, креатини-на, мочевой кислоты, активности АСТ, АЛТ, кислой фосфатазы, а также показателей интенсивности процессов ЛП и состояния системы АОЗ характеризует их надежными критериями для оценки степени метаболических сдвигов в условиях гиподинамии.
Библиографический список
1. Габриэлян Н. И. Опыт использования показателя средних молекул в крови для диагностики нефрологических заболеваний у детей/Н. И. Габриэлян, В. И. Липатова// Лаб. дело.— 1984.— № 3. — С. 138—140.
2. Еликов А. В. Комплексная биохимическая оценка при ограничении двигательной активности различной продолжительности/А. В. Еликов, П. И. ЦапоК///Материалы межрегион. науч.-практ. конф. «Новая идеология в единстве фундаментальной науки и клинической медицины» (1—2 июня 2005 г., г. Самара).— Самара: Содружество Плюс, 2005.— С. 103—107.
3. Еликов А. В. Метод определения антирадикальной активности эритроцитов/ А. В. Еликов, П. И. Цапок//Инф. листок № 24-025-05 Кировского ЦНТИ.— Киров, 2005.— 3 с.
4. Коваленко Е. А. Гипокинезия/Е. А Коваленко, И. Н. Гуровский.— М.: Медицина, 1980.— 320 с.
5. Козловская И. Б. Механизмы нарушений характеристик точностных движений при длительной гипокинезии/И. Б. Козловская, А. В. Киренская,//Рос. физиол. журн. им. И. М. Сеченова.— 2003.— Т. 89.—№ 3.— С. 247—258.
6. Конторщикова К. Н. Перекисное окисление липидов в норме и патологии/ К. Н. Конторщикова.— Н. Новгород, 2000.— 24 с.
7. Терёхина Н. А. Свободнорадикальное окисление и антиоксидантная система/ Н. А. Терёхина, Ю. А. Петрович.— Пермь, 2005.— 58 с.
8. Тизул А. Я. Болезни человека, обусловленные дефицитом двигательной активности и здоровья/А. Я. Тизул.— М.: Советский спорт, 2001.— 246 с.
9. Цапок П. И. Метод определения содержания средних молекул, белка, глюкозы и креатинина в биологических жидкостях/ П. И. Цапок, Т. В. Симкина, Е. П. Цапок// Инф. листок № 143-96 Кировского ЦНТИ.— Киров, 1995.— 4 с.
10. Цейликман В. Э. Влияние повторных редко чередующихся стрессовых воздействий на устойчивость к гипоксии и на
выраженность анксиогенного стресса у крыс/Я Э. Цейликман, И. А. Волчегор-ский, О. Б. Цейликман и др.//Рос. физиол. журн. им. И. М. Сеченова. — 2005. — Т. 91.— № 4.— С. 394—399. 11. Wilkinson J. H. The Principles and Practice of Diagnostic Enzymology/J. H. Wilkinson.— Edward Arnoid, 1976.— 624 p.
A. V. Elikov, P. I. Tsapok
BIOCHEMICAL EFFICIENCY ASSESSMENT of using VITAMINS-ANTIOXIDANTS C AND E IN HYPODYNAMIA
Seventy eight adult outbred male rats were used to study enzymatic activity, protein and purine metabolites, state of lipoperoxidation and antioxidant defense in blood plasma, as well as effect of using ascorbic acid and a-tocopherol in animals with limited motor activity. The state of hypodynamics was caused by placement
of animals into individual cages with the area of 40 cm2 (the existing norm of keeping — 150 cm2). Vitamins-antioxidants C and E were administered with the probe in the dose of 2 and 1 mg respectively. Typical peculiarities of metabolic shifts in limited muscular activity were revealed. The role of vitamins-antioxidants C and E in correction of metabolic disorders in the presence of immobilization distress-syndrome was shown.
Keywords: hypodynamics, metabolism, stress, lipoperoxidation, antioxidant balance, vitamins-antioxidants C and E.
Контактная информация: Цапок Петр Иванович, доктор мед. наук, профессор, зав. кафедрой биохимии Кировской государственной медицинской академии, 610046, г. Киров, Октябрьский пр., 109—113, тел. 8 (8332) 65-32-62
Материал поступил в редакцию 15.12.2009
