CC BY
12УДК 577.112.824:615.9
Биохимическая модель на мышах для оценки нейропатичного потенциала фосфорорганических соединений
Рудакова Е. В., Серебрякова О. Г., Болтнева Н. П., Галенко Т. Г., Махаева Г. Ф.
Институт физиологически активных веществ Российской Академии наук, г. Черноголовка
И
зучено ингибирование нейротоксичной эстера-зы (НТЭ) и ацетилхолинэстеразы (АХЭ) в 9S фракции гомогената головного мозга мышей известным нейропатичным фосфорорганическим соединением О,О-дипропилдихлорвинилфосфатом и двумя модельными диал-килфосфатами. Исследовано торможение НТЭ и АХЭ в головном мозге мышей через 1 час после внутрибрюшинного введения возрастающих доз этих же соединений. Установлено, что различия в чувствительности к отставленному ней-ротоксическому действию фосфорорганических соединений (ФОС) у мышей по сравнению с курами не связаны с различиями в чувствительности фермента-мишени - НТЭ. Продемонстрирована возможность использования мышей для биохимической оценки нейропатичного потенциала ФОС.
Ключевые слова: фосфорорганические соединения, отставленная нейротоксичность, ацетилхолинэстераза, нейро-токсичная эстераза, мыши
Введение. Фосфорорганические соединения (ФОС) широко используются в промышленности, сельском хозяйстве, ветеринарии и медицине. Ряд ФОС помимо острого токсического действия, обусловленного ингибированием ацетилхолинэсте-разы (АХЭ) нервных синапсов, может индуцировать синдром «отставленной нейротоксичности, вызываемой фосфороргани-ческими соединениями» (ОНТФОС) - отставленные по времени дистальные нейропатии, характеризующиеся дегенерацией длинных аксонов периферической и центральной нервной системы [1]. Клиническая картина ОНТФОС - атаксия, парезы, параличи конечностей - развивается после определенного скрытого периода, через 2-3 недели после отравления [1, 2]. Мишенью действия аксонотоксичных или нейропатичных ФОС является фермент нервной ткани - нейротоксичная эстераза (НТЭ), относящаяся к сериновым гидролазам [1-3]. Согласно последним данным НТЭ является фосфолипазой/ лизофосфолипазой нервной ткани (ЕС 3.1.1.5) и участвует в регуляции фосфолипидного гомеостаза [3, 4]. Предполагают, что фосфорилирование серина активного центра НТЭ, приводящее к ингибированию ее каталитической активности, и последующее необычайно быстрое де-алкилирование ковалентно связанной с серином фосфорильной группы - «старение» фосфорилированного фермента - выполняют роль триггера, запускающего каскад последующих биохимических процессов, приводящих в итоге к дегенеративным изменениям аксонов [2, 3]. Однако окончательно физиологическая функция этого фермента, как и механизм ОНТФОС, не установлены.
В настоящее время взрослые куры являются основной моделью для изучения ОНТФОС и оценки нейропатичного потенциала соединений [2, 3]. Показано, что существует четкая корреляция между способностью ФОС вызывать эффект отставленной нейротоксичности и ингибированием НТЭ в головном и спинном мозге и периферических нервах кур, которое наблюдается уже через 1-2 дня после воздействия. Высокий (70-80%) уровень ингибирования НТЭ фосфорорганическими соединениями, способными к «старению», достоверно предсказывает появление примерно через две недели клинических симптомов ОНТФОС [1, 2, 5]. Это позволяет использовать определение степени снижения активности НТЭ в головном мозге кур через 24 часа после введения исследуемых соединений для биохимической оценки их способности вызывать ОНТФОС. Однако по сравнению со стандартными лабораторными животными, такими как крысы и
мыши, куры являются более сложным видом в плане содержания в лабораторных условиях, и их большие размеры требуют значительно большего расхода тестируемых веществ для дозирования in vivo. Из-за сложности вызывания клинической картины ОНТФОС - атаксии крысы и мыши обычно рассматривались как нечувствительные или мало чувствительные к ОНТФОС [2].
Тем не менее было показано, что у крыс и мышей линии CD-1 после однократного введения стандартного нейроток-сиканта триортокрезилфосфата при отсутствии клинических симптомов наблюдаются характерные для ОНТФОС патомор-фологические изменения ряда длинных аксонов и дозозави-симое ингибирование НТЭ головного и спинного мозга [6, 7]. При этом пороговая для инициирования ОНТФОС степень ингибирования НТЭ у крыс составляла, как и у кур, 70-80%. В экспериментах in vitro ранее нами была показана близкая чувствительность НТЭ из мозга крыс и кур к ингибированию
0-фосфорилированными оксимами и рядом дихлорвиниловых эфиров фосфорной и фосфоновой кислот [8, 9]. В экспериментах на целом животном на примере нейропатичного соединения О,О-дипропилдихлорвинилфосфата (ПрДхВФ) нами была продемонстрирована принципиальная возможность использования крыс для биохимической оценки способности ФОС вызывать отставленную нейротоксичность [9].
Целью настоящей работы является разработка экспериментальной биохимической модели ОНТФОС на мышах, позволяющей проводить оценку нейропатичного потенциала фосфорор-ганических соединений. Для этого нами проведено в опытах in vitro и на целом животном сравнительное исследование ингиби-рования АХЭ и НТЭ мозга мышей стандартным отставленным нейротоксикантом ПрДхВФ, который нами ранее детально исследован в опытах на курах и крысах [9, 10], и двумя экспериментальными ФОС из серии О-фосфорилированных гексафто-ризопропанолов (RO)2P(O)OCH(CF3)2 (ПФП) [11] -диэтил-ПФП (R=Et) и дибутил-ПФП (R=Bu).
Материалы и методы исследования. Фосфорилированные
1-гексафторизопропанолы синтезированы по методу, описанному в работе [11] и любезно предоставлены зав. лаб. Синтеза ФАВ ИФАВ РАН к.х.н. Соколовым В.Б. и в.н.с. к.х.н. Аксинен-ко А.Ю.
В качестве стандартных источников ферментов использовали стабильные лиофилизованные препараты НТЭ (ЛиоНТЭ) и АХЭ мозга кур, полученные, как описано в работах [12, 13]. Ли-
Токсикологический вестник №б (117)
оНТЭ - это мембранная (Р2 +Р3) фракция головного мозга кур, предварительно обработанная параоксоном (40 мкМ, 40 мин), которая представляет собой параоксон-резистентную эстераз-ную активность мозга. Для приготовления рабочих растворов ферментов лиофилизованные препараты НТЭ и АХЭ ресуспен-дировали в гомогенизаторе Поттера в рабочих буферах: 50 мМ трис-HCl, 0,2 мМ ЭДТА, рН 8,0 для НТЭ и 0,1 М фосфатный буфер рН 7,5 для АХЭ. Определение активностей проводили через 0,5-1 ч, концентрация белка 0,1-0,14 мг/мл (Лоури).
Определение активности АХЭ и НТЭ мозга мышей проводили с использованием 9S фракции гомогената головного мозга. Мозг гомогенизировали в рабочем буфере (50 мМ трис-HCl, 0,2 мМ ЭДТА, pH 8,0) в соотношении 1г / 5мл, гомогенат центрифугировали при 4оС в течение 15 мин при 9000'g и в полученном супернатанте 9S определяли активность НТЭ и АХЭ.
Активность АХЭ определяли методом Эллмана [14], с использованием в качестве субстрата ацетилтиохолин-иодида (»Sigma», США). Активность НТЭ определяли дифференциальным методом Джонсона [5] с небольшими модификациями, как детально описано в работе [10], субстрат - фенилвалерат. Активность НТЭ мозга кур измеряли как разность в скорости гидролиза фенилвалерата между параоксон-резистентной (ЛиоНТЭ) и (параоксон+мипафокс) - резистентной (мипафокс 250 мкМ, 20 мин) эстеразной активностью. Активность НТЭ в 9S фракции гомогената головного мозга определяли как разность в скорости гидролиза фенилвалерата между образцами, инкубированными в течение 20 минут с параоксоном (50 мкМ) - параоксон-рези-стентная эстеразная активность и в присутствии параоксона (50 мкМ) и мипафокса (250 мкМ) - (параоксон+мипафокс) - резистентная эстеразная активность, как описано в работе [15].
Для исследования ингибиторной способности соединений in vitro в отношении АХЭ и НТЭ, которую характеризовали величинами IC50 при фиксированном времени инкубации, образцы 9S гомогената мозга мышей и стандартных ферментов инкубировали в течение 20 минут с исследуемыми соединениями в концентрациях от 10"11 до 10-3 М, затем определяли остаточную активность фермента. Каждый эксперимент проводили в трипликате. Измерения проводили на микропланшетном спектрофотометре BioRad Benchmark Plus. Значения IC50 вычисляли с использованием программы Origin 6.1.
В экспериментах на целом животном использовали самцов белых аутбредных мышей массой 18-25 г. При исследовании доз-зависимости ингибирования НТЭ и АХЭ вводили 5-10 возрастающих доз каждого из исследуемых веществ. Для каждой дозы использовали не менее 6 животных. Вещества растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) и вводили в/бр в объеме около 0,1 мл. ПрДхВФ вводили на фоне предварительного (за 20 мин) введения атропин-сульфата (40 мг/кг). Контрольным животным вводили только ДМСО. Через 1 час мышей умерщвляли декапи-тацией с применением CO2 - анестезии и быстро на холоду выделяли головной мозг. 9S фракцию головного мозга получали по методу, описанному выше. Анализ зависимостей доза - ответ проводили с использованием программы Origin 6.1.
Определение острой токсичности соединений было выполнено на самцах белых аутбредных мышей массой 18-25 г при в/бр введении. Срок наблюдения - 24 часа. Величину ЛД50 вычисляли методом пробит-анализа с использованием программы BioStat 2006 Professional. Все манипуляции с животными осуществлялись в соответствии с требованиями институтской комиссии по контролю над содержанием и использованием лабораторных животных и «Правилами лабораторной практики» (Приказ Минздравсоцразвития России от 23 августа 2010 г. № 708н).
Результаты и обсуждение. Известно, что для ФОС, способных «стареть», относительная способность соединения ингиби-ровать НТЭ по сравнению с АХЭ коррелирует с отношением между ЛД50 и минимальной нейропатичной дозой [3, 5]. Величина относительной ингибиторной способности ФОС в отношении двух основных ферментов-мишеней (relative inhibitor potency) RIP = 1С50(АХЭ)/1С50(НТЭ) используется в качестве удобного параметра, характеризующего нейропатичный потенциал со-
единения [3, 5]. RIP > 1 указывает на то, что соединение может вызывать ОНТФОС в дозе, меньшей ЛД50, тогда как величины RIP < 1 свидетельствуют о том, что доза, необходимая для инициирования ОНТФОС, будет больше ЛД50.
В экспериментах in vitro нами были определены величины ингибиторной активности стандартного нейропатичного соединения ПрДхВФ и двух фосфорилированных гексафторизопро-панолов - диэтил-ПФП и дибутил-ПФП в отношении АХЭ и НТЭ мозга мышей и стандартного объекта - кур. Величины IC50, полученные при 20 минутной инкубации, приведены в таблице 1. Как видно из таблицы, изучаемые соединения проявляют близкую ингибиторную активность в отношении как АХЭ, так и НТЭ из обоих источников. Наблюдается хорошая корреляция между величинами IC50, полученными на препаратах из мозга кур и мышей: для АХЭг=0,999; N=3; p=0,0159; для НТЭ 1=0,999; N=3; p=0,0185. Рис. 1 демонстрирует хорошую корреляцию между величинами RIP, полученными на ферментах из мозга кур и мышей: r=0,999; N=3; p=0,00391. Согласно величинам RIP, полученным на ферментах из обоих источников, диэтил-ПФП наименее опасен как отставленный нейротоксикант, в то время как ПрДхВФ и дибутил-ПФП - потенциально опасные нейропа-тичные соединения, способные вызывать ОНТФОС в дозах, значительно меньших ЛД50. Нейропатичный потенциал возрастает в ряду диэтил-ПФП < ПрДхВФ < дибутил-ПФП. Полученные результаты демонстрируют пригодность использования НТЭ и АХЭ 9S фракции гомогената мозга мышей для биохимической оценки нейропатичного потенциала в экспериментах in vitro.
В целях разработки биохимической модели ОНТФОС на мышах in vivo изучено изменение активности НТЭ и АХЭ в головном мозге мышей при внутрибрюшинном введении возрастающих доз стандартного нейропатичного соединения ПрДхВФ. На рис. 2а показана зависимость степени ингибирования активности АХЭ и НТЭ головного мозга мышей от дозы ПрДхВФ. Как видно из рисунка, ингибирование обоих ферментов имеет четко выраженный доз-зависимый характер. Критическое для инициирования ОНТ-ФОС 70%-ное торможение активности НТЭ у мышей, наблюдается при дозе 10 мг/кг, тогда как у кур это происходило при 0,6 мг/ кг [12]. Таким образом, в опытах in vivo куры и мыши проявляют различную чувствительность к действию нейропатичного соединения ПрДхВФ, причем мыши значительно менее чувствительны. В результате анализа полученных кривых доза-ответ определены средние эффективные дозы (ED50) для ингибирования АХЭ и НТЭ в головном мозге мышей, ED50(АХЭ) и ED50(ffl3), которые составляют соответственно 4,3 ± 0,6 и 2,2 ± 0,4 мг/кг. Для ферментов мозга кур ранее нами были получены величины ED50(АХЭ) = 0,79 ± 0,07 мг/кг и ED50(ffl3) = 0,44 ± 0,01 мг/кг [9, 10]. Полученные значения ED50 показывают меньшую чувствительность in vivo обоих ферментов-мишеней у мышей по сравнению с курами. Однако, что существенно, отношение ED50(АХЭ)/ED50(НТЭ), величина которого характеризует опасность соединения как отставленного нейротоксиканта в сравнении с его острой токсичностью [15, 16], для обоих видов практически одинаково: 2 для мышей и 1,8 для кур. Аналогичный эффект был получен нами ранее при введении возрастающих доз ПрДхВФ крысам и курам. [9]. Полученные данные показывают возможность использования мышей как модели для биохимической оценки нейропатичного потенциала ФОС in vivo при в/бр введении.
Для доказательства правомерности предлагаемой биохимической модели ОНТФОС проведено исследование изменения активности АХЭ и НТЭ в головном мозге мышей через 1 час после в/бр введения возрастающих доз диэтил-ПФП и дибутил-ПФП, обладающих согласно результатам in vitro разным ней-ропатичным потенциалом (табл.). На рис. 2 б,в представлена зависимость степени ингибирования активности АХЭ и НТЭ в головном мозге мышей от дозы диэтил-ПФП и дибутил-ПФП. Как видно из рис. 2 б, диэтильное производное слабо ингиби-рует НТЭ и АХЭ. При дозе, соответствующей ЛД50 (200 мг/кг), активность НТЭ снижена лишь на 10%. Т.е. дозы, при которых данное соединение может инициировать ОНТФОС, будут существенно выше ЛД50, что согласуется с результатами предсказания in vitro (табл.).
Ингибирование НТЭ и АХЭ в мозге мышей дибутильным
Таблица
In vitro ингибиторная активность (IC50) и ингибиторная селективность (RIP) фосфорорганических соединений в отношении АХЭ и НТЭ мозга кур и мышей
Соединение гс50, М мыши IC5„, М куры RIP = 1С50АХЭ/ 1С50НТЭ
АХЭ НТЭ АХЭ НТЭ мыши куры
ПрДхВФ (9,40±0,64)x10-8 (1,50±0,18)x10-8 (4,30±0,30)x10-8 (2,77±0,17)x10-8 6,27 1,55
диэтил-ПФП (2,62±0,29)x10"6 (6,08±0,53)x10"6 (5,05±0,04)x10-7 (4,59±0,36)x10"6 0,43 0,11
дибутил-ПФП (8,14±0,56)x10-7 (2,75±0,38)x10-8 (1,95±0,09)x10-7 (2,72±0,31)x10-8 29,6 7,2
Приведенные величины являются средними из трех экспериментов, (mean ± SEM)
производным (рис. 2в) носит дозозависимый характер. В отличие от диэтил-ПФП, критичное для инициирования ОНТФОС 70-80%-ное снижение активности НТЭ при введении дибутил-ПФП достигается в дозе 200 мг/кг, что существенно ниже ЛД50, которая для данного соединения превышает 2000 мг/кг. Полученные результаты свидетельствуют о том, что дибутил-ПФП, имеющий очень низкую острую токсичность, представляет опасность как отставленный нейротоксикант, способный вызывать ОНТФОС в дозах, не вызывающих признаков острого холинер-гического отравления. В результате анализа кривых доза-ответ для дибутил-ПФП были определены величины ED50(АХЭ) = 516 ± 83 мг/кг и ED5(1(ffl3) = 127 ± 8 мг/кг. Отношение; ED50(АХЭ)/ ED50(ffl3) = 4,1, что полностью согласуется с данными in vitro (табл.).
Следовательно, эксперименты на целом животном подтверждают результаты предсказания in vitro, полученные на 9S препарате гомогената мозга мышей: диэтилфосфат не представляет опасности как отставленный нейротоксикант, тогда как дибу-тилфосфат является нейропатичным соединением. Более того, эксперименты in vivo демонстрируют тот же ряд нейропатичной опасности исследованных соединений, который был получен в опытах in vitro: диэтил-ПФП < ПрДхВФ < дибутил-ПФП.
Заключение. Таким образом, в данной работе нами впервые продемонстрирована возможность использования мышей для биохимической оценки нейропатичного потенциала ФОС как в экспериментах in vitro по ингибированию НТЭ и АХЭ в 9S фракции гомогената мозга мышей, так и in vivo путем определения торможения НТЭ в головном мозге мышей через 1 час после внутрибрюшинного введения возрастающих доз исследуемого соединения. Видовые различия в чувствительности к отставленному нейротоксическому действию ФОС у мышей по сравнению с курами не связаны с различиями в чувствительности фермента-мишени - НТЭ.
Можно полагать, что предложенная в данной работе биохимическая модель ОНТФОС на мышах будет связующим звеном между результатами последних лет по изучению физиологической функции НТЭ и ее роли в патогенезе ряда нейродегенера-тивных заболеваний и окончательным выяснением механизма ОНТФОС.
Работа выполнена при финансовой поддержке Программы РАН ОХНМ 9 «Медицинская химия» Российского фонда фундаментальных исследований (грант №11-03-00581а и гранта НАТО SfP 984082).
Токсикологический вестник №б (117)
2.0-, 1,6 12
1 ое к_
е> О
* 04
К 0.0
2
-0.4
■о. в
—I—
■0.4
0.0 0.4 0.S log RIP (мозг кур)
1.2
1.6
Рис. 1. Корреляция меязду величинами log RIP фосфороргаиических ингибиторов, полученными на препаратах из мозга кур и мышей: 1 - диэтил-ПФП, 2 - ПрДхВФ, 3 - дибутил-ПФП; 1=0,999; N=3;p=0,00391.
100 л
ГС
£ во
2
н во
40
0
О.
1 30т
s
£
0-
0.5
100
-АХЭ -НТЭ
12 4 Ю
Доза ПрДхВФ, мг/кг
—А—АХЭ -•-НТЭ
20 30
а
Доза диэтил-ПФП, мг/кг
200 б
1 10 100 Доза дибутил-ПФП, мг/кг
в
Рис. 2. Ингибирование НТЭ и АХЭ в головном мозге мышей через 1 час после в/бр введения возрастающих доз ПрДхВФ (а), диэтил-ПФП (б) и дибутил-ПФП (в) (мг/кг). Данные представлены в виде % ингибирования соответствующей эстеразы у контрольных животных. Активности эстераз мозга мышей у контрольных животных, нмоль/(мин*мг белка), (MEAN ± SEM): АХЭ = 692,0 ± 3,54 (N=20), НТЭ =13,44 ± 0,52 (N=10).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Richardson R.J. Organophosphate poisoning, delayed neurotoxicity. In: Encyclopedia of Toxicology. // Oxford: 2nd ed. Elsevier, 2005. - V 3. - P. 302-306.
2. Makhaeva G.F., Malygin VV. Organophosphate induced delayed neurotoxicity // Medical Aspects of Chemical and Biological Terrorism. Chemical Terrorism and Traumatism. Sofia: Publishing House of the Union of Scientists in Bulgaria. - 2005.- P. 271-302.
3. Wijeyesakere S.J., Richardson R.J. Neuropathy target esterase. In: Hayes' Handbook of Pesticide Toxicology. 3nd ed. Elsevier, 2010. - P. 1435-1455.
4. Glynn P. Axonal degeneration and neuropathy target esterase. // Arh. Hig. Rada. Toksikol. - 2007.
- V. 58. - № 3. - P. 355-358.
5. Johnson M.K. The target for initiation of delayed neurotoxicity by organophosphorus esters: Biochemical studies and toxicological applications // Rev. Biochem. Toxicol. - 1982. - V 4. - P. 141-212.
6. Padilla S., Veronesi B. The relationship between neurological damage and neurotoxic esterase inhibition in rats acutely exposed to tri-ortho-cresyl phosphate. // Toxicol. Appl. Pharmacol. - 1985.
- V. 78. - P. 78-87.
7. Veronesi B., Padilla S., Blackmon K., Pope C. Murine susceptibility to organophosphorus-induced delayed neuropathy (OPIDN). // Toxicol. Appl. Pharmacol. - 1991. - V 107. - P. 311-324.
8. Махаева Г.Ф., Филоненко И.В., Малыгин В.В., Мартынов И.В. Близкая чувствительность нейротоксичной эстеразы мозга крыс и кур к действию О-алкил-О-алкилхлорформиминофен илфосфонатов // ДАН. - 1993. - Т. 312. - № 5. - С. 650-653.
9. Махаева Г.Ф., Филоненко И.В., Малыгин В.В. Сравнительное исследование взаимодействия дихлорвиниловых эфиров кислот фосфора с нейротоксичной эстеразой мозга кур и крыс // Журн. Эвол. Биохим. Физиол. - 1995. - Т. 31. - № 4. - С. 396-403.
10. Makhaeva G.F., Sigolaeva L.V., Zhuravleva L.V et al. Biosensor detection of neuropathy target
esterase in whole blood as a biomarker of exposure to neuropathic organophosphorus compounds // J. Toxicol. Env. Health, Pt A. - 2003. - V. 66. - P. 599-610.
11. Махаева Г.Ф., Серебрякова О.Г., Болтнева Н.П. и др. Эстеразный профиль и анализ связи структура-ингибиторная селективность гомологичных фосфорилированных 1-гидроперфто-ризопропанолов. // ДАН. - 2008. - Т. 423. - № 6. - С. 826-831.
12. Makhaeva G.F., Filonenko I.V, Yankovskaya V.L. et al. Comparative studies of O,O-dialkyl-O-chloromethylchloroformimino phosphates: interaction with neuropathy target esterase and acetylcholinesterase // Neurotoxicol. - 1998. - V 19. - № 4/5. - P. 623-628.
13. Makhaeva G.F., Malygin V.V. A stable preparation of hen brain neuropathy target esterase for rapid biochemical assessment of neurotoxic potential of organophosphates // Chem. Biol. Interact. 1999. - V. 119-120.- P. 551-557.
14. Ellman G.L., Courtney K.D., Andres V. Jr., Featherstone R.M. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity // Biochem. Pharmacol. - 1961. - V. 7. - P. 88-95.
15. Malygin V.V, Sokolov VB., Richardson R.J., Makhaeva G.F Quantitative structure-activity relationships predict the delayed neurotoxicity potential of a series of O-alkyl-O-methylchloroformimino phenylphosphonates // J. Toxicol. Env. Health, Pt A. 2003. - V. 66. - P. 611-625.
16. Richardson R.J. Interaction of organophosphorus compounds with neurotoxic esterase. In: Organophosphates: Chemistry, Fate, and Effects. // San Diego: Academic Press, 1992. - P. 199-323.
Rudakova Ye.V, Serebryakova O.G., Boltneva N.P., Galenko T.G., Makhaeva G.F.
A biochemical model in mice for assessment of neuropathic potential of organophosphorus compounds
Institute of Physiologically Active Compounds, Russian Academy of Sciences, Chernogolovka
Inhibition of neurotoxic target esterase (NTE) and acetylcholinesterase (AChE) in the 9S fraction of mice brain homogenate was studied by a well known neuropathic organophosphorus (OP) compound O,O-dipropyldichlorovinyl phosphate and two model dialkylphosphates. Inhibition of AChE and NTE activitties in mice brain was also studied 1 h after the intraperitoneal administration of increasing doses of the same compounds. It is shown that differences in susceptibility to the OP-induced delayed neuropathic effects in mice as compared with chickens are not associated with differences in the sensitivity of the target enzyme NTE. The possibility of using mice for biochemical assessment of the OP compounds neuropathic potential was demonstrated.
Материал поступил в редакцию 12.12.2011 r.
