CC BY
82
Известия ТИНРО
2007 Том 150
ТЕХНОЛОГИЯ ОБРАБОТКИ ГИДРОБИОНТОВ
УДК 664.951.014+577.122.3:597(26) Л.И. Дроздова, Т.Н. Пивненко, Е.П. Караулова, А.П. Ярочкин
БИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЫШЕЧНОЙ ТКАНИ ГЛУБОКОВОДНЫХ РЫБ КАК ИСТОЧНИКА СВОБОДНЫХ АМИНОКИСЛОТ И БИОГЕННЫХ ПЕПТИДОВ
Исследован технохимический состав глубоководных рыб: макрурус малогла-зый, ликод одноцветный и ликод редкозубый — в сравнении с наиболее изученным пелагическим видом — тихоокеанским минтаем. Показано, что количество воды, белка и фракционный состав белков в мышечной ткани зависят от глубины обитания. Суммарное содержание свободных аминокислот и дипептидов возрастает в ряду макрурус — ликод одноцветный — ликод редкозубый. В составе мышечной ткани макруруса обнаружен нехарактерный для рыб ансерин. У редкозубого ликода содержание свободных аминокислот в тканях необычайно велико — 0,6 %, при этом много таурина и карнозина, что способно обеспечить высокую биологическую ценность продукции из этого объекта. Протеолитическая активность убывает в ряду ликод редкозубый — минтай тихоокеанский — ликод одноцветный и макрурус мало-глазый. Са2+-АТФазная активность повышается в ряду макрурус малоглазый — ли-код одноцветный — ликод редкозубый — минтай тихоокеанский, в той же последовательности возрастают двигательная активность, стабильность миофибриллярных белков и реологические показатели фаршей из исследованных видов рыб.
Drozdova L.I., Pivnenko T.N., Karaulova E.P., Yarochkin A.P. Biochemical description of muscular tissue from deep-water fish as the source of free amino acids and biogenic peptides // Izv. TINRO. — 2007. — Vol. 150. — P. 383-390.
Technochemical composition of muscular tissue for some deep-water fish species as giant grenadier, ebony eelpout and marbled eelpout is investigated and compared with the better studied pelagic species as walleye pollock. Contents of water and proteins in the tissue and fractional structure of proteins were different in dependence on depths of the fishes dwelling. The giant grenadier had the lowest total content of water-soluble proteins but the highest share of salt-soluble myofibril proteins. Generally, the ratio myosin/actin was lower for deep-water fishes in comparison with pollack that characterized their muscular tissue as inactive, distinguished by low physiological and metabolic activity. Total contents of free amino acids and dipeptides grew in the following order: giant grenadier — ebony eelpout — marbled eelpout. Anserine was found in the tissue of giant grenadier that was unusual for fish. Comparing with other fish species, the content of free amino acids in the tissue of marbled eelpout was extraordinary high (0.6 %), in particular taurine and carnosine, that provided high biological value of production from this species. Spectrum of proteolytic enzymes activity was almost identical for all investigated species, with the maximum activity in acid zone and zero activity in alkalescent zone. Proteolytic activity decreased in the order: marbled eelpout — walleye pollock — ebony eelpout — giant grenadier. Ca2+-ATP activity raised in the order: giant grenadier — ebony eelpout — marbled eelpout — walleye pollock. The same order of increase concerned impellent activity, myofibril proteins stability, and reological parameters of the forcemeat produced from these fishes.
Основные технохимические характеристики некоторых видов глубоководных рыб были исследованы ранее (Kapayлoвa и др., 2003а). Установлено, что мышечная ткань глу6оководных рыб, таких как лемонема, мaкpypyc пепельный и мaкpypyc малоглазый, очень обводнена, содержит мало белка и незначительное количество липидов.
В данной работе продолжено исследование мышечной ткани глу6оководных рыб, включая такие виды, как ликод редкозубый Lycodes brevicaudus, ликод одноцветный L. concolor и макрурус малоглазый Albatrossia pectoralis, в части определения основных миофибриллярных белков, свободных аминокислот (CAK), активности мышечных протеаз и ATФaз. Ликод одноцветный, ликод редкозубый и макрурус малоглазый — глубоководные рыбы, обитающие в Беринговом и Охотском морях, — относятся к малоизученным объектам промысла. В сравнительных целях использовался минтай тихоокеанский Theragra chalcogramma как наиболее изученный по биохимическим и технологическим характеристикам вид.
Размерно-массовый состав рыб определяли по существующей методике (Me-тодические рекомендации ..., 1981). В работе использовали рыбу, хранившуюся при температуре минус 18 °C в течение 3 мес, при определении выхода мышечной ткани применяли рекомендуемый способ разделки Мельникова, 1976). Для экспериментов готовили филе из мороженой рыбы, которое вначале измельчали на волчке с диаметром решетки 2-3 мм, затем 5-7 мин (при вращении ножа 166-250 с-1) в гомогенизаторе AM-10.
Общее количество белка и фракционный состав белков мышечных тканей определяли по общепринятым методикам (Лазаревский, 1976). Aктoмиoзин экстрагировали из концентрата миофибрилл, полученного пятикратной экстракцией саркоплазматических белков мышц 5 мM раствором ЭДTA с дитиотриэти-лом (1 iM раствор) при температуре 2-6 oC при соотношении ткань/раствор 1 : 5 в течение 12 ч ^араулова и др., 2003б).
Mиoзины из скелетных мышц глубоководных рыб извлекали из концентрата миофибриллярных белков, который сначала гомогенизировали 2 мин в растворе 0,1 M KCl, 10 мM MgCl2, 1 мM ЭДTA, 7,5 !M KH2PO4 при pH 7,0, а затем экстрагировали белок 1,56 M раствором сульфата аммония в этом же буфере. K полученному экстракту добавляли насыщенный раствор сульфата аммония. Осадок, полученный в интервале насыщения 35-50 %, отделяли фильтрованием и диализовали против воды до полного растворения осадка в диализной ячейке и далее против пятикратного объема раствора Хассельбаха-Шнайдера (0,6 M KCl, 10 мM Na4P2O7, 1 мM MgCl2, 0,1 M K2HPO4), разбавленного 10 раз ^араулова и др., 2003в).
Aктин выделяли экстракцией 0,6 M KJ в соотношении 1 : 1 в течение 5 мин. Aктинин осаждали высаливанием сульфатом аммония (15-25 % насыщения). Раствор центрифугировали, при этом a-актинин выпадал в осадок, а маточный раствор, содержащий актин, денатурируровали на водяной бане (Ishikawa, 1983).
Koличecтвeннoe определение азота проводили на приборе Kjeltec Auto 10 SO Analyser (Швеция). ^личество воды определяли на инфракрасном влагомере Kett F-1A (Kett Electric Laboratory, Япония). Определение Ca-ATФ-aктивнocти проводили по Фиске^аббароу (Mori et al., 1980). За единицу активности принимали количество фосфора, высвобождаемого в результате реакции, в мкM в минуту на грамм ткани. Aминoкиcлoтный состав определяли на приборе Amino Acid Analyzer Hitachi L-8800.
Определение протеолитической активности мышечной ткани проводили по установлению количества низкомолекулярных растворимых белковых компонентов, образующихся при ферментативном гидролизе субстратов. В качестве субстрата использовали 2 %-ный раствор гемоглобина в 0,1 M цитратно-фосфатном буфере (pH 2,4; 5,0; 8,0). K раствору субстрата добавляли 2 г мышечной ткани,
384
выдерживали 60 мин при 37 0C на водяной бане. Реакцию останавливали добавлением 5 % ТХУ, фильтровали и замеряли оптическую плотность при X 280 нм против контрольного раствора, полученного добавлением к 2 мл раствора субстрата 4 мл 5 % ТХУ, а затем 2 г мышечной ткани с последующей фильтрацией.
За единицу активности принимали такое количество фермента, которое приводит к увеличению поглощения при 280 нм на 1 оптическую единицу за 1 мин в пересчете на 1 г ткани.
Расчет проводили по формуле:
A = (D - Dj) 4P/60a, Е/г мин, где D — средняя арифметическая величина плотности испытуемых растворов; Dj — величина оптической плотности контрольного раствора; 4 — постоянный коэффициент разбавления реакционной смеси; P — коэффициент разбавления гомо-гената мышечной ткани; 60 — время реакции, мин; a — масса мышечной ткани, г.
Исследуемые виды рыб обитают на разных глубинах (макрурус малогла-зый — до 3500 м, ликод одноцветный — до 1030 м, ликод редкозубый — до 360 м, минтай — до 700 м), при этом масса наиболее крупных экземпляров достигает 2,0-2,4 кг. Макрурус малоглазый характеризуется наибольшим выходом тушки — до 64,0 % с выходом мяса до 48,0 %, по сравнению с этим у ликодов выход тушки меньше — 47,0-50,8 % с выходом мяса до 30,8-34,1 % (табл. 1).
Таблица 1
Размерный состав глубоководных рыб
Table 1
Demensional structure of deep-water fishes
Показатель Макрурус малоглазый Ликод одноцветный Ликод редкозубый
Длина рыбы, см 67-93 48-70 48-66
Длина тушки, см 42-54 36-55 38-52
Длина головы, см 12-18 13-16 9-17
Высота тела, см 10-12 8-10 7-12
Толщина тела, см 8-10 7-9 5-9
Масса рыбы, г 900-2400 1170-2010 615-2440
Выход тушки, %
от массы рыбы 61,0-64,1 34,3-47,0 48,3-50,8
Выход мяса, %
от массы рыбы 45,0-47,5 26,2-30,8 31,7-34,1
Мышечная ткань макруруса малоглазого характеризуется более низким содержанием экстрактивных веществ по сравнению с ликодами (табл. 2). По содержанию белковых веществ макрурус малоглазый относится к низкобелковым рыбам, ликод одноцветный — к среднебелковым и ликод редкозубый — к белковым. Как уже отмечалось, содержание белков в мышечной ткани глубоководных рыб на 30-40 % меньше, чем у видов, обитающих на небольших глубинах (Караулова и др., 2003а). Мышечные ткани исследованных рыб характеризуются низким содержанием липидов. Относительное содержание миофибрилляр-ных белков при сроке хранения 3 мес составляет около 20 % от общего содержания белка для всех исследуемых видов (табл. 2). Доля водорастворимых белков в исследуемых объектах тем выше, чем выше общее содержание белка, что согласуется с данными, полученными Е.П. Карауловой с соавторами (2003в) для лемонемы и макруруса пепельного.
Наибольшее количество водорастворимых белков содержится в минтае тихоокеанском (3,1 г/100 г мышечной ткани) (табл. 3). Суммарное содержание миофибриллярных белков в этом объекте составляет 0,08 г/100 г мышечной ткани. По составу белков с минтаем сравним ликод редкозубый, который содержит водорастворимых белков 2,7 г/100 г ткани и миофибриллярных белков 0,095 г/100 г мышечной ткани, что, возможно, связано с небольшой разницей в
глубине обитания. Ликод одноцветный занимает промежуточное положение по белковому составу между минтаем и глубоководным макрурусом малоглазым. Белки макруруса малоглазого существенно отличаются от белков минтая: количество водорастворимых белков и миофибриллярных белков почти в два раза ниже.
Таблица 2
Химический состав мышечной ткани глубоководных рыб, %
Table 2
Chemical compound of a muscular fabric of deep-water fishes, %
Содержание белков, %
Объект Вода Липиды Небелковый Всего В том числе
азот водорастворимые* солераство-римые*
Макрурус
малоглазый 92,2±0,2 0,4±0,1 0,155±0,010 7,1±0,1 15,4 19,8
Ликод
одноцветный 84,3±0,2 1,8±0,1 0,320±0,012 12,7±0,1 18,2 20,2
Ликод
редкозубый 80,2±0,2 2,0±0,1 0,206±0,010 17,4±0,1 18,4 20,3
* В процентах от общего количества белка.
Таблица 3
Количественный состав белков мышечной ткани рыб, г/100 г ткани
Table 3
Concentration of fibers of a muscular fabric of various fishes, g/100 g fabrics
Объект Водорастворимые белки Актомиозин Миозин Актин Актинин
Макрурус малоглазый 1,55 0,021 0,011 0,0042 0,00094
Ликод одноцветный 2,05 0,032 0,017 0,0059 0,00111
Ликод редкозубый 2,70 0,051 0,030 0,0102 0,00350
Минтай тихоокеанский 3,10 0,044 0,027 0,0088 0,00113
Известно, что среднестатистическое соотношение миозин/актин для мышечной ткани колеблется от 2,0 до 4,0 и в основном составляет величину 3,5— 4,0 (Соппе1, Howgate, 1959). Следует отметить, что для глубоководных рыб характерно низкое соотношение миозин/актин (рис. 1), что свойственно малоподвижным объектам, обладающим низкой физиологической и метаболической активностью (Соппе1, Howgate, 1959).
Объекты
Е^Макрурус малоглазый g Ликод одноцветный Щ Ликод редкозубый [Г] Минтай тихоокеанский
Рис. 1. Соотношение миозин / актин в мышечной ткани различных рыб
Fig. 1. A parity myosin / actin in a muscular fabric of various fishes
В табл. 4 приведены данные, характеризующие содержание в тканях различных глубоководных рыб и минтая свободных аминокислот и некоторых ди-пептидов. Привлекают внимание значительные различия в содержании свободных аминокислот в мышечной ткани макруруса малоглазого и ликодов. Среди исследуемых видов макрурус обитает наиболее глубоко, хотя и совершает вертикальные миграции. Его мышечные ткани обеднены свободными аминокислотами, при этом необычно высоко содержание ансерина — гистидинсодержащего ди-пептида, характерного для беспозвоночных, но не для рыб (Давидович и др., 2000). Последнее можно отметить и для минтая.
Таблица 4
Содержание свободных аминокислот и гистидинсодержащих дипептидов в мышечной ткани глубоководных рыб и минтая, мг/100 г ткани
Table 4
The contents of free amino acids and histidine contened dipeptides in a muscular fabric of deep-water fishes and a pollack, mg/100 g fabrics
Компонент Макрурус малоглазый Ликод одноцветный Ликод редкозубый Минта
САК
Фосфосерин 0,35 1,32 4,55 4,59
Таурин 0,73 5,07 199,32 91,71
Аспарагиновая 0,37 0,88 9,47 5,40
Треонин 0,63 4,14 15,24 5,07
Серин 0,78 1,78 28,99 4,73
Глутаминовая 1,22 1,93 20,20 20,57
Глицин 0,72 3,06 107,21 28,37
Аланин 0,92 11,20 78,72 26,58
Валин 1,13 5,65 3,95 13,20
Метионин - - 1,58 5,45
Цистатионин 0,05 0,67 4,68 9,38
Изолейцин 0,53 3,22 3,50 6,18
Лейцин 0,69 6,07 5,99 8,31
Тирозин 0,54 3,01 2,54 9,39
Фенилаланин 0,59 3,31 3,03 3,55
Гидроксилизин 0,16 0,80 1,24 2,26
Орнитин 0,16 0,23 4,84 1,06
Лизин 0,51 1,29 3,19 7,11
Гистидин 1,48 2,83 5,39 0,54
Аргинин 0,27 3,58 3,88 2,10
Пролин 0,55 10,51 7,11 -
Цистин - 0,55 3,19 -
Фосфоэтаноламин 0,15 2,94 0,92 -
Всего 12,30 74,40 520,10 255,30
Гистидинсодержащие дипептиды
Карнозин 0,91 1,88 6,40 7,18
Ансерин 2,76 - - 44,17
Суммарное содержание свободных аминокислот возрастает в ряду макру-рус — ликод одноцветный — ликод редкозубый. Для редкозубого ликода содержание свободных аминокислот в тканях необычайно велико по сравнению с другими видами рыб и достигает 0,6 % от массы, при этом много таурина и карнозина, что способно обеспечить высокую биологическую ценность продукции из этого объекта.
Наиболее распространенные протеолитические ферменты мышечной ткани рыб — катепсины В, Н, L, Д, и С, кальцийзависимая нейтральная протеаза (кальпаин), щелочная сериновая протеаза, аминопептидазы (Слуцкая, 1997). Эти ферменты играют важную роль в процессах метаболизма мышечной ткани. Кро-
ме того, они продолжают работать в процессе технологической обработки и при получении готовой продукции из рыб.
Мышечные ферменты, вносящие основной вклад в начальный протеолиз мышечной ткани, подготавливая белки к последующему воздействию протеаз пищеварительных органов, — это катепсин Д и тиоловые катепсины (Слуцкая, 1997).
Установлено, что рН-оптимум этих протеаз лежит в кислой зоне (Wojtowicz, Odense, 1972), что не является исключением для глубоководных объектов (рис. 2) и позволяет предположить, что их мышечные ткани содержат преимущественно катепсины.
0,016 1
0,014
С 0,004
-Макрурус малоглазый
-Минтай тихоокеанский
- Ликод одноцветный
- Ликод редкозубый
Рис. 2. Про-теолитическая активность мышечной ткани глубоководных рыб при различных рН
Fig. 2. Proteolytic activity of a muscular fabric of deep-water fishes at various рН
Полученные данные свидетельствуют о том, что по активности протеолити-ческих ферментов в кислой зоне рН исследованные виды рыб располагаются в порядке убывания: ликод редкозубый — минтай тихоокеанский — ликод одноцветный — макрурус малоглазый.
Ранее (Караулова и др., 2003в) было показано, что актомиозины скелетных мышц глубоководных рыб гидролизуют АТФ, их АТФаза активируется ионами кальция и магния. Разницу в Са2+-АТФазной активности связывают с различиями в скорости сокращения мышц. В физиологическом аспекте высокая АТФазная активность соответствует подвижному образу жизни. В аспекте технологических исследований сохранение АТФазной активности связывают с процессами сохранения нативной структуры миофибрилл и, как следствие, сохранением влагоудерживающей способности и вязкости миофибриллярных белков и всей ткани в целом. Величина относительной вязкости растворов актоми-озинов зависит от соотношения миозин/актин и наличия АТФазной активности. Важной особенностью актомиозинов скелетных мышц глубоководных рыб является отсутствие восстановления вязкости растворов миозинов до исходных значений в течение длительного (до 30 мин) промежутка времени (Карау-лова и др., 2003б). Эти показатели — ферментативная активность и реологические свойства — взаимосвязаны и могут быть регулируемы с помощью одних и тех же приемов. Так, например, известно, что низкомолекулярные пептиды и аминокислоты способны взаимодействовать с миофибриллярными белками таким образом, что образованные комплексы обеспечивают увеличение связывания воды фагта^о et а1., 1997а).
Также обнаружена высокая степень корреляции между степенью связывания воды, сохранением АТФазной активности и стабильностью к денатурации в образцах, обработанных амино-пептидными смесями фагтап1ю е1 а1., 1997Ь). Вышесказанное позволяет предположить, что примером низкой устойчивости миофибриллярных белков к денатурационным воздействиям являются глубоководные рыбы, в частности макрурус малоглазый, содержащие малое количество актомиозина (АТФазного фактора) и низкие концентрации свободных аминокислот и пептидов.
Согласно нашим данным, Са2+-АТФазная активность повышается в ряду макрурус малоглазый — ликод одноцветный — ликод редкозубый — минтай (рис. 3), в той же последовательности возрастают стабильность миофибрилллярных белков и двигательная активность исследуемых рыб (Караулова и др., 2003в).
Объекты
Рис. 3. Са-АТФ-активность в мышечной ткани рыб, мкМР/гмин
Fig. 3. Са-АТФ activity in a muscular fabric of fishes, mkMP/gmin
Проведенные исследования мышечной ткани глубоководных рыб позволяют сделать следующие выводы.
Общее количество водорастворимых белков наименьшее — в мышечной ткани макруруса малоглазого, наибольшее — в мышечной ткани ликода редкозубого.
Для глубоководных рыб характерна величина соотношения миозин/актин менее 3.
Суммарное содержание свободных аминокислот и дипептидов возрастает в ряду макрурус малоглазый — ликод одноцветный — ликод редкозубый. В составе мышечной ткани макруруса малоглазого обнаружен нехарактерный для рыб ансерин. Для редкозубого ликода содержание свободных аминокислот в тканях необычайно велико по сравнению с другими видами рыб — 0,6 % массы, при этом много таурина и карнозина, что способно обеспечить высокую биологическую ценность продукции из этого объекта.
Для мышечной ткани всех исследованных видов рыб характерен одинаковый спектр активности протеолитических ферментов (с наивысшими значениями в кислой зоне рН), которая убывает в ряду ликод редкозубый — минтай тихоокеанский — ликод одноцветный — макрурус малоглазый.
Ca^-АТФазная активность повышается в ряду макрурус малоглазый — ли-код одноцветный — ликод редкозубый — минтай.
Литература
Давидович В.В., Позднякова Ю.М., Эпштейн Л.М. Биологически активная пищевая добавка из гидробионтов, содержащая растворимую форму ДНК и свободные
аминокислоты // Мат-лы Междунар. конф. по устойчивому развитию малого бизнеса. — Хабаровск, 2000. — С. 26-29.
Караулова Е.П., Леваньков С.В., Якуш Е.В. Сравнительная технохимическая характеристика некоторых видов глубоководных рыб // Хранение и переработка сель-хозсырья. — 2003а. — № 12. — С. 50-53.
Караулова Е.П., Леваньков С.В., Якуш Е.В., Акулин В.Н. Качественный и количественный состав миофибриллярных белков некоторых видов глубоководных рыб // Изв. ТИНРО. — 20036. — Т. 134. — С. 309-320.
Караулова Е.П., Леваньков С.В., Якуш Е.В., Акулин В.Н. Актомиозины скелетных мышц глубоководных рыб // Изв. ТИНРО. — 2003в. — Т. 134. — С. 321-333.
Лазаревский А.А. Технохимический контроль в рыбообрабатывающей промышленности. — М.: Пищепромиздат, 1976. — 519 с.
Мельникова О.М. Пищевое использование некоторых глубоководных рыб // Рыб. хоз-во. — 1976. — № 9. — С. 12-15.
Методические рекомендации. Технохимические исследования рыбы и беспозвоночных. — М.: ВНИРО, 1981. — 93 с.
Слуцкая Т.Н. Биохимические аспекты регулирования протеолиза. — Владивосток: ТИНРО-центр, 1997. — 148 с.
Connel J.J., Howgate P.E. Studies on the properties of skeletal Muscle // Biochem. Journ. — 1959. — Vol. 71, № 1. — P. 83-86.
Darmanto, Ichikawa H., Iwamoto M. et al. Effect of protein hydrolysate of pearl oyster meat on the state of water and denaturation of fish myofibrils dehydration // Nippon Suisan Gakkaishi. — 1997a. — Vol. 63, № 3. — P. 378-385.
Darmanto, Ichikawa H., Iwamoto M. et al. Effect of protein hydrolysate of pearl oyster meat on the state of water and denaturation of fish myofibrils during frozen storage // Nippon Suisan Gakkaishi. — 1997b. — Vol. 63, № 3. — P. 386-390.
Ishikawa H. Fine structure of skeletal muscle // Cell and muscle Motility. — N.Y.: Plenum Press, 1983. — P. 1-40.
Mori Y., Horie N., Tsuchiya T., Matsumoto J.J. Characterisation of adenosinetri phosphatase of squid actomyosin // Bull. Jap. Soc. Sci. Fish. — 1980. — Vol. 46, № 12. — P. 1533-1537.
Wojtowicz M.B., Odense P.N. Comparative study of muscle catheptic activity of some marine species // J. Fish. Res. Bd Canada. — 1972. — Vol. 29, № 1. — P. 85-91.
Поступила в редакцию 16.03.07 г.
