CC BY
39
2011/3
10. Fournier R.O. Rowe J.J. Amer. Mineralogist. - 1962. - V.47, №7. - Р. 122-125.
11. Truesdell A.H. Geochemical techniques in exploration. - Proc. Soc. United. Nat. Sumpos. Develop. and Use of Geotherm. Res. San Francisko. Сalifornia. USA. - 1976. - V.1.
12. Fournier R.O. Potter R.W. A magnesium correction for the Na-K-Ca geothermometer // Geochim. Et Cosm. Asta. - 1979. -V.43. - P.1543-1550.
13. Рассказов С.В. Сопоставление вулканизма и новейших структур горячих пятен Йеллоустоуна и Восточного Саяна // Геология и геофизика. - 1994. - №10. - С. 67-75.
Бадминов Прокопий Сократович, ведущий инженер, лаборатория гидрогеологии и охраны подземных вод, Институт земной коры СО РАН, 664033, Иркутск, ул. Лермонтова, 128, т. 89025139137
Ганчимэг Дармаа, кандидат геолого-минералогических наук (PhD), старший научный сотрудник, лаборатория гидрохимии и минералогии, Институт химии и химических технологий АН Монголии, 210351, Улаанбаатар, пр. Мира, Монголия, [email protected]
Оргильянов Алексей Июльевич, главный специалист, лаборатория гидрогеологии и охраны подземных вод, Институт земной коры СО РАН, 664033, Иркутск, ул. Лермонтова, 128
Крюкова Ирина Георгиевна, ведущий инженер, лаборатории гидрогеологии и охраны подземных вод, Институт земной коры СО РАН, 664033, Иркутск, ул. Лермонтова, 128, [email protected]
Оюунцэцэг Долгоржав, магистр (Mc.S), научный сотрудник, лаборатория гидрохимии и минералогии, Институт химии и химических технологий АН Монголии, 210351, Улаанбаатар, пр. Мира, Монголия
Badminov Prokopiy Sokratovich, leading engineer, laboratory of hydrogeology and protection of groundwater, Institute of Earth's Crust SB RAS.
Ganchimeg Darmaa, candidate of geology and mineralogy, (PhD), senior researcher, laboratory of hydrochemistry and mineralogy, Institute of Chemistry and Chemical Technologies MAS. Mongolia, 210351, Ulaanbaatar, Mir ave.
Orgilyanov Alexey Iul'evich, chief specialist, laboratory of hydrogeology and protection of groundwater, Institute of Earth's Crust SB RAS.
Krukova Irina Georgievna, leading engineer, laboratory of hydrogeology and protection of groundwater, Institute of Earth's Crust SB RAS.
Oyuntsetseg Dolgorzhav, master (McS), researcher, laboratory of hydrochemistry and mineralogy, Institute of Chemistry and Chemical Technologies MAS. Mongolia, 210351, Ulaanbaatar, Mir ave.
УДК 577.151.01
БИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КУЛЬТУРЫ Um-09m
А.А. Раднагуруева, Е.В. Лаврентьева, Б.Б. Намсараев, Я.Е. Дунаевский
Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ №10-04-90798_моб_ст, №10-04-93169_Монг_а, МО РФ РНП 2.1.1/2165, программы "Фундаментальные исследования и высшее образование" (НОЦ-017 "Байкал")
Изучена биохимическая характеристика культуры Um-09m. Показано, что культура обладает высокой субтилизино-подобной активностью. Протеаза стабильна в широком диапазоне температур от 23 до 60°С и рН от 7,52 до 11,41.
Ключевые слова: щелочные гидротермы, протеазная активность, субстратная специфичность, ингибиторный анализ.
BIOCHEMICAL CHARACTERISTIC OF Um-09m STRAIN A.A. Radnagurueva, E.V. Lavrentieva, B.B. Namsaraev, Ya.E. Dunaevskiy
Biochemical characteristic of Um-09m strain has been studied. It is shown, that strain possesses high subtilisin-like activity. Protease is stable in a wide range of temperatures from 23 to 60°С and рН from 7.52 to 11.41.
Keywords: alkaline hydrotherm, protease activity, substrate specificity, inhibitor analysis.
В последние годы микроорганизмы, обитающие в экстремальных условиях, находятся в центре внимания исследователей. Большой интерес ученых вызывает изучение механизмов биохимической адаптации микроорганизмов к экстремальным условиям окружающей среды [1].
В гидротермах Бурятии широко распространены микроорганизмы - потенциальные продуценты ферментативных систем, устойчивые к высоким значениям температуры и рН. Исследования по выделению, идентификации и классификации ферментов в последние годы проводятся особенно интенсивно, что объясняется востребованностью и многообразием протеолитических ферментов. Они играют ключевую роль в использовании микроорганизмами органических субстратов [2].
Целью представленной работы было изучение внеклеточной протеазной активности алкалотермо-фильной бактерии иш-09ш, выделенной из горячего источника Умхей.
Объекты и методы исследования
Культура иш-09ш выделена из цианобактериального мата горячего источника Умхей, расположенного в Баргузинском районе Республики Бурятия. Штамм бактерий культивировали на среде состава (г/л): N^0 - 0,3; КН2Р04 - 0,3; MgCl2 - 0,3; СаС12 - 0,3; дрожжевой экстракт - 0,5. В качестве источника азота использовали пептон в конечной концентрации 1,5%. Оптимальные значения рН роста бактерий устанавливали карбонат-бикарбонатным буфером до рН 8,5-9,0. Культура инкубировалась при 55оС на комплексной среде в течение трех суток. После инкубации клетки осаждали центрифугированием (12000 об/мин, 15 мин), полученный супернатант использовали для определения активности протеиназ.
Определение внеклеточной протеазной активности в культуральной жидкости проводили по методу Эрлангера с соавт. [3], используя 5 мМ пара-нитроанилидные субстраты протеаз - трипсиноподобных, субтилизиноподобных и цистеиновых (ВАРА, G1pAALpNA и G1pFApNA соответственно), и на белковом субстрате азоказеине, используемым для определения общей активности. Для выяснения природы функциональных групп активного центра штамма к раствору фермента добавляли раствор соответствующего ингибитора, инкубировали 1 ч при температуре 37оС, затем добавляли раствор субстрата и определяли активность, как указано выше. В работе использовались ингибиторы метал-лопротеаз-этилендиаминтетраацетат № (ЭДТА), цистеиновых протеаз-иодацетамид (ИAA) и сери-новых протеаз-фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ). Для определения оптимума рН активности исследуемых протеиназ по отношению к синтетическим субстратам был использован универсальный буфер [4] в диапазоне рН 1,66-12,5. Температурный оптимум и стабильность ферментов определяли, измеряя их активность после часовой инкубации при температурах от 23-80оС.
Результаты исследования
1. Определение субстратной специфичности
Определение субстратной специфичности показало, что изученный штамм не гидролизует субстраты, специфичные для трипсинподобных, химотрипсинподобных и цистеиновых протеиназ, независимо от времени культивирования. Культура наиболее активна по отношению к субстрату для суб-тилизнподобных протеаз. Так, максимум активности по субстрату G1pAALpNa обнаружена на 84 ч культивирования и составила 1,147 ед. Общая активность по азоказеину была равна 0,335 ед.
2. Определение рН-оптимума и стабильности фермента
Исследования рН-оптимума проведены в диапазоне рН от 1,66 до 12,5 (рис.1). Как следует из полученных данных, изученный фермент штамма иш-09ш активен в широком диапазоне щелочных значений рН 8,48-11,41, что характерно для сериновых протеиназ с максимумом при рН 11,1. Исследуемые ферменты стабильны в интервале рН 7,52-11,41. Полученные данные согласуются с литературными данными, свидетельствующими о том, что многие бактериальные субтилизинподобные про-теиназы сохраняют активность при высоких значениях рН.
3. Определение температурного оптимума и стабильности фермента
Определение температурного оптимума и стабильности ферментов проведены для диапазона 23-80оС (рис. 2). Протеиназа культуры иш-09ш стабильна до 50оС, оптимум активности фермента приходится на 50оС. Повышение температуры до 70оС в течение 1 ч, приводит к практически полной потере ферментативной активности.
4. Анализ природы функциональных групп активного центра
Ингибиторный анализ препарата показал (табл. 1), что активность протеазы подавляется ингибитором сериновых протеиназ PMSF (0,1М) на 22% и ингибитором металлопротеаз ЭДТА (0,1 М) и фе-нантролин (0,1 М) на 60,7 и 76,4%, соответственно. Влияние ингибитора (ИАА) цистеиновых протеиназ не действовал на изученный фермент. Исходя из результатов ингибиторного анализа и субстратной специфичности, можно предположить, что культура иш-09ш секретирует ферменты, относящиеся к двум классам протеаз - субтилизин-подобного типа и металлопротеаз.
2011/3
Рис. 1. рН-оптимум и стабильность фермента культуры Иш-09ш
1,2
23 30 40 50 60 70 80 ^°0
| п.-^-оптимум Um-09^ ^^^t-стабильность Um-09m |
Рис. 2. Температурный оптимум и стабильность фермента культуры Иш-09ш
Таблица 1
Влияние ингибиторов на активность протеиназ культуры иш-09ш
Реагент Концентрация, М Остаточная активность, %
Иш-09 мат
контроль 100
РМ8Б 0,1 22
0,01 27,5
ЭДТА 0,1 60,7
0,01 71,3
Фенантролин 0,1 76,4
0,01 82,7
ЙАА 0,1 100
0,01 100
Совокупность данных по субстратной специфичности и ингибиторному анализу показала, что изученные внеклеточные протеазы культуры иш-09ш относятся к классу сериновых протеиназ суб-тилизинподобного типа. Возможно, высокий показатель активности субтилизинподобных протеиназ указывает на способность бактерий адаптироваться к существованию в экстремальных условиях щелочных гидротерм.
Внеклеточные протеазы вынуждены работать в более жестких условиях внешней среды и, следовательно, должны иметь более высокую стабильность. Показана широкая вариабельность температурного оптимума и стабильности. Обнаружен широкий рН интервал с высоким значением оптимума. Полученные результаты показали границы приспособляемости и функционирования выделенных бактерий в экстремальных условиях гидротерм Бурятии [1].
Литература
1. Морозкина Е.В., Слуцкая Э.С., Федорова Т.В. и др. Экстремофильные микроорганизмы: биохимическая адаптация и биотехнологическое применение // Прикладная биохимия и микробиология. - 2010. - Т.46, №1. - С. 5-20.
2. Ward O.P. Proteolytic enzymes // Comprehencive Biotechnol. - 1985. - V.3. - P. 789-818.
3. Erlanger B.F., Kokowsky N., Cohen W. The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin // Arch. Biochem. Biophis. - 1961. - V.95. - P. 271-278.
4. Досон Р., Эллиот Д., Элиот У., Джонс К. Справочник биохимика. - М.: Мир, 1991. - 544 с.
Раднагуруева Арюна Арсалановна, аспирант, Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, 670047, Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6, т. 8(3012)434902, arvuna [email protected]
Лаврентьева Елена Владимировна, кандидат биологических наук, научный сотрудник, Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, 670047, Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6, факс: 8(3012)433034, lena [email protected]
Намсараев Баир Бадмабазарович, доктор биологических наук, зав. лабораторией микробиологии, Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, 670047, Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6, bair [email protected]
Дунаевский Яков Ефимович, доктор биологических наук, профессор НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991, Москва, Ленинские горы, стр. А 40, т. 8(495) 9385551, [email protected]
Radnagurueva Aruna Arsalanovna, postgraduate student, Institute of General and Experimental Biology SB RAS.
Lavrentieva Elena Vladimirovna, candidate of biology, researcher, Institute of General and Experimental Biology SB RAS.
Namsaraev Bair Badmabazarovich, doctor of biology, professor, head of laboratory of microbiology, Institute of General and Experimental Biology SB RAS.
Dunaevskiy Yakov Efimovich, doctor of biology, professor, A.N. Belozersky SRI of physical-chemical biology, M.V. Lomonosov Moscow State University. 119991, Moscow, Leninskiye gory, bdg. A 40.
УДК 551.481.1
БАКТЕРИИ-ДЕСТРУКТОРЫ МИНЕРАЛЬНЫХ ИСТОЧНИКОВ ХОЙТО-ГОЛ
Е.С. Кашкак, И.П. Осипова, Э.В. Данилова
Работа выполнена при частичной финансовой поддержке программы "Фундаментальные исследования и высшее образование" (НОЦ-017 "Байкал"), МО РФ РНП 2.1.1/2165, интеграционного проекта СО РАН №95
В микробных матах гидротерм Хойто-Гол (Восточные Саяны) определена численность сульфатредуцирующих бактерий, использующих лактат и ацетат в качестве источника энергии и углерода. Определена общая численность бактерий-деструкторов.
Ключевые слова: сульфатредуцирующие бактерии, бактерии-деструкторы, минеральные источники.
BACTERIA-DESTRUCTORS OF THE KHOITO-GOL MINERAL SPRINGS E.S. Kashkak, I.P. Osipova, E.V. Danilova
In the microbial mats of Hotyo-Gol hydrotherm (Eastern Sayan) number of sulfate-reducing bacteria using lactate and acetate as an energy and carbon source, total number of bacteria-destructors were determined.
Keywords: sulfate-reducing bacteria, bacteria-destructors, mineral springs.
Сульфатредуцирующие бактерии (СРБ) участвуют в процессе деструкции органического вещества и продуцируют химически активное вещество - сероводород [1]. Донорами водорода служат простые низкомолекулярные соединения, образующиеся при анаэробном разложении биомассы, главным образом целлюлозы: лактат, ацетат, пропионат, бутират и др. Легкодоступное органическое вещество разлагается гидролитическими микроорганизмами [2].
Объекты и методы исследования
Минеральные источники Восточных Саян - Хойто-Г ол относятся к низкотемпературным углекислым гидротермам, отличительной чертой которых является присутствие сероводорода, поступающего с вулканическими флюидами.
