CC BY
55
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2012, № 2
Молекулярная биология
УДК 636.52/.58:591.436.2:577.217.346
БИОГЕНЕЗ РИБОСОМ В ПЕЧЕНИ ЦЫПЛЯТ ПОСЛЕ ВВЕДЕНИЯ
17-р-ЭСТРАДИОЛА
Л.Г. КОРШУНОВА, Р.В. КАРАПЕТЯН
На цыплятах породы белый леггорн в научном опыте изучали влияние однократной и повторной эстрогенизации на содержание белка, ДНК, РНК, рибосом в печени. Показано, что введение цыплятам 17-р-эстрадиола вызывало пролиферацию и гипертрофию гепатоцитов, увеличение содержания рибосом в них. Содержание рибосом в тканях печени после повторной эстрогенизации было выше, чем после однократной. Наблюдаемые изменения после однократного и повторного введения 17-р-эстрадиола носили обратимый характер.
Ключевые слова: цыплята, 17-р-эстрадиол, печень, рибосома, РНК, ДНК.
Keywords: chicken, 17-p-estradiol, liver, ribosome, RNA, DNA.
Печень — место синтеза большинства желточных белков у яйцекладущих позвоночных. Белки желтка в основном происходят из вителло-генина и липопротеидов очень низкой плотности (ЛОНП), синтез которых начинается в печени самок по достижении ими репродуктивного возраста (1). С наступлением периода яйценоскости печень курицы приобретает новую вителлогенную функцию без утраты предшествующих. Такая диф-ференцировка уже специализированной ткани находится под контролем эстрогенов. Синтез вителлогенина и ЛОНП может быть вызван также у петухов и неполовозрелой птицы введением им эстрадиола (2). Становление вителлогенной функции печени у кур при половом созревании, а также печени цыплят под влиянием экзогенного эстрогена сопровождается значительным усилением биосинтетических процессов (3-6). Потенциальный уровень белкового синтеза зависит от содержания рибосом в клетках печени, а биогенез рибосом, в свою очередь, обусловлен интенсивностью белкового синтеза и активностью ядрышковых организаторов, где происходит синтез рибосомных РНК (7, 8).
Целью работы было изучение динамики содержания рибосом и макромолекул в тканях печени цыплят после однократного и повторного введения 17-р-эстрадиола.
Методика. Исследования выполняли на птице породы белый леггорн, которая содержалась в условиях вивария ГУП «Загорское ЭПХ ВНИ-ТИП Россельхозакадемии» (Московская обл.). Были сформированы две опытные и одна контрольная группы цыплят в возрасте 75 сут (по 70 гол. в каждой). Цыплятам одной опытной группы внутримышечно ввели раствор 17-р-эстрадиола в пропиленгликоле в дозе 20 мг/кг живой массы. Через 16 сут 17-р-эстрадиол в той же дозе инъецировали цыплятам из обеих опытных групп. В контроле птице вводили пропиленгликоль.
Цыплят (по 5 гол.) декапитировали через 3, 6, 9 и 12 ч, затем через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 и 9 сут после инъекции препарата. Приготовление го-могенатов печени и выделение из них рибосом проводили в боксе при температуре 0-4 °С. В гомогенатах определяли содержание общего белка, РНК, ДНК (9) и РНК-азную активность по скорости расщепления очищенного препарата дрожжевой РНК. Концентрацию продуктов реакции оценивали по поглощению при X = 260 нм. Рибосомы осаждали преципитацией 0,2 М MgCl2 (10). Количество рибосом определяли по оптической
плотности (ОП) растворов в додецнлсульфате натрия (SDS) при X = 260 нм.
Полученные результаты обрабатывали статистически общепринятыми методами в программе Microsoft Excel.
Результаты. Масса печени цыплят заметно увеличивалась на 2-е сут после однократного и повторного введения 17-р-эстрадиола (р < 0,001) — по группам 36,1 и 38,2 г против 28,1 г в контроле, достигая максимума на 4-е сут (37,6 и 41,1 г) и на 8-е сут возвращаясь к контрольному уровню (28,7 и 29,2 г). В изменении содержания ДНК в тканях печени отмечалась некоторая периодичность (табл. 1). Так, на 1-е и 3-и сут после однократного введения гормона происходило повышение количества ДНК, перемежаемое снижением этого показателя, что может быть обусловлено частичной синхронизацией клеток печени по митотическому циклу. Наименьшее содержание ДНК наблюдали на 4-е сут, когда отмечались максимумы по массе печени и содержанию рибосом. Следовательно, развитие белок-синтезирующего аппарата клеток печени достигало максимума на 4-е сут, что и вызывало некоторое снижение содержания ДНК. В последующем содержание ДНК постепенно повышалось и на 9-е сут достоверно отличалось от регистрируемого на 4-е сут (р < 0,05). Количество рибосом при этом уменьшалось (р < 0,01) и на 9-е сут возвращалось к контрольному значению. Очевидно, что увеличение содержания ДНК и уменьшение содержания рибосом вызваны распадом гипертрофированного под влиянием 17-р-эстрадиола белоксинтезирующего аппарата клеток печени.
1. Динамика содержание общего белка, РНК, ДНК и рибосом в тканях печени после однократного (О) и повторного (П) введения 17-р-эстрадиола 75-суточным цыплятам породы белый леггорн
Время после Белок, мг/г РНК, мг/г ДНК, мг/г Рибосомы, ОП2б0/г
введения О 1 П О 1 П О П О 1 П
Контроль 195±2 189±4 б,81±0,ЗУ У,08±0,ЗУ 2,11 ±0,24 2, П±0,10 152±8 145 ±5
З-й ч ПЗ±5 1бб±2 бЛ±0,40 У,04±0,1б 2,40±0,18 2,б4±0,08 108±З 14б± 10
б-й ч 1б2±З 1б8±1 У,48±0,29 б,82±0,40 2,41±0,09 2,54±0,15 ПЗ±4 1бб±10
9-й ч П8±З Ш±4 У,85±0,2З У,У8±0,ЗУ 2,З2±0,04 2,45±0,12 Ш±З 128±5
12-й ч П5±2 1бУ±4 У,48±0,0б б,5У±0,1б 2,45±0,1З 2,1б±0,09 150±8 1У1±4
1-е сут 1б9±З 1б9±4 бЛ±0,2З б,8З±0,1б 1,94±0,04 1,98±0,1З 199±9 18У±4
2-е сут 1б9±З 1б2±4 8,51±0,1З 8,З9±0,29 2,19±0,02 1,У9±0,11 16У±У 1У9±У
З-и сут 1б5±2 П0±З 8,б8±0,18 8,44±0,20 1,93 ±0,0У 2,0У±0,0У 184±4 21З±2
4-е сут 1бб±З 1б8±2 8,41±0,21 8,50±0,05 2,04±0,0У 1,Уб±0,0У 20У±8 204±5
З-е сут 180±4 1У9±1 9,21±0,28 9,21±0,24 2,З4±0,14 2,П±0,0б 191±У 19З±4
б-е сут 189±4 191±10 8,8У±0,24 8,84±0,4У 2,n±0,10 2,3б±0,11 183±б 215±2
У-е сут 181±1 1Уб±4 8,41±0,4З 8,55±0,2З 2,1З±0,15 2,12±0,04 21У±8 218±У
8-е сут 18У±5 19У±2 У,85±0,25 9,15±0,ЗЗ 2,ЗУ±0,08 2,80±0,19 185±З 20б±14
9-е сут 18б±З 18б±12 8,45±0,4У 8,б0±0,1б З,20±0,09 2,5У±0,1У 148±1З 1б8±5
П р и м е ч а н и е. Поскольку введение пропиленгликоля цыплятам из контрольной группы не оказало влияния на изученные показатели, в контроле приведены значения, соответствующие средним по опыту
и исходным по группам.
Это подтверждается изменением рибонуклеазной активности в тканях печени (табл. 2). С 5-х сут после введения гормона она значительно превышала контрольные значения (р < 0,01-0,02), а на 2-4-е сут в период нарастания содержания рибосом в печени становилась ниже контроля. Наблюдаемое уменьшение содержания РНК и рибосом в печени на 4-й ч после однократного введения гормона сопровождалось резким увеличением рибонуклеазной активности (р < 0,02).
Описанные изменения становятся более наглядными при пересчете на содержание ДНК в тканях печени. Приведенные в таблице 2 результаты по числу, массе клеток печени и содержанию в них рибосом после однократного введения гормона получены, исходя из того, что у кур на диплоидный геном приходится 2,3 пг ДНК (11), 1 мг рибосом соответствует 11 ед. ОП260 (10) и рибосома содержит 2,3*106 Да РНК, которая состав-
ляет 40 % ее массы (12). Из этих данных следует, что увеличение массы печени под влиянием 17-р-эстрадиола происходит как за счет увеличения числа клеток, так и за счет увеличения их массы. Эти показатели начинали заметно возрастать через 2 сут после введения гормона. На 2-6-е сут в их изменении отмечалась 2-суточная периодичность, причем соответствующие кривые были сдвинуты относительно друг друга по фазе на полпериода (1 сут): рост числа клеток сопровождался уменьшением их массы и наоборот. По окончании действия 17-р-эстрадиола (8-9-е сут) возвращение массы печени к исходному значению осуществляется за счет распада клеток, который начинается, по-видимому, с цитоплазмы, что и обусловливает уменьшение массы гепатоцитов. Это согласуется с характером изменения рибонуклеазной активности в печени: на 2-4-е сут она была ниже, а на 5-9-е сут — выше контроля.
2. Размер печени и показатели белоксинтезирующей активности при однократном введении 17-р-эстрадиола 75-суточным цыплятам породы белый леггорн
Время после введения Число клеток на орган, х109 Масса клетки, пг Число рибосом на клетку, х106 РНК-азная активность, %
Контроль 38,1 ±2,5 683±41 1,38±0,05 100±5
4-й ч 35,3±2,3 658±23 1,15±0,03 135±8
12-й ч 39,7±3,9 697±64 1,33±0,07 93±5
1-е сут 39,6±1,7 637±9 1,25±0,04 99±8
2-е сут 46,4±3,5 727±53 1,79±0,07 71±5
3-и сут 56,6±3,6 660±37 1,51±0,04 93±9
4-е сут 49,7±2,7 821±41 2,06±0,05 84±1
5-е сут 55,6±2,7 729±9 1,57±0,09 141±8
6-е сут 48,4±2,8 743±37 1,74±0,03 154±8
7-е сут 47,9±4,7 731±30 1,54±0,04 131±6
8-е сут 44,6±2,0 697±9 1,39±0,05 130±4
9-е сут 36,4±8,7 559±39 0,94±0,02 129±6
П р и м е ч а н и е. То же, что в таблице 1
Одновременно с ростом числа гепатоцитов увеличивался их белок-синтезирующих аппарат. На 4-е сут после введения гормона отмечали увеличение содержания рибосом в расчете на клетку в 1,5 раза относительно контроля. Наибольший рост этого показателя был более чем 2-кратным, что позволяет печени обеспечивать вителлогенез без ущерба для остальных функций.
Эффективность биосинтеза белка в клетках зависит от времени жизни молекул РНК, то есть от числа циклов их использования. Одним из главных факторов, определяющих время жизни РНК, служит активность внутриклеточных рибонуклеаз. Изучение этой активности в тканях печени цыплят после введения 17-р-эстрадиола выявило двухфазный характер ее динамики. В первую фазу ответа на эстрогенизацию, когда увеличивалось число гепатоцитов и содержание в них рибосом, рибонуклеазная активность была ниже, во вторую фазу, когда действие гормона прекратилось и возникла необходимость распада гипертрофированного белоксинтезирую-щего аппарата, — выше контроля. Так, на 9-е сут после эстрогенизации содержание рибосом в клетках печени оказалось на 30 % меньше контрольного, что объясняется, по-видимому, не только снижением интенсивности биосинтеза в рибосомах, но и их усиленным распадом. Интерес представляет резкое и кратковременное повышение рибонуклеазной активности в первые часы после введения гормона, которое сопровождалось достоверным снижением числа рибосом в гепатоцитах. Возможно, это увеличение отражает необходимость распада определенной части РНК перед перестройкой метаболизма гепатоцитов. Рост активности рибонуклеаз по продолжительности совпадал с лаг-периодом, который после эстрогениза-
ции продолжается до начала синтеза вителлогенина. Эти данные свидетельствуют, что первые часы после эстрогенизации наиболее важны для становления вителлогенной функции у цыплят.
Содержание РНК в тканях печени цыплят (см. табл. 1) возрастало как после однократного, так и после повторного введения 17-р-эстрадиола при наибольшем значении на 5-е сут. Изменение количества ДНК зависело от схемы применения эстрогена. Так, на 2-е и 4-е сут содержание ДНК было достоверно ниже при повторном введении эстрадиола, что свидетельствует о более высокой степени гипертрофии гепатоцитов. На 9-е сут после однократного введения эстрадиола этот показатель возрастал и превышал контрольное значение (р < 0,01). При повторном введении эстрадиола повышения количества ДНК на последних стадиях ответа не наблюдали. Содержание общего белка при однократной и повторной эстрогенизации не различалось.
В динамике содержания рибосом в печени после однократного и повторного введения цыплятам 17-р-эстрадиола тоже имелись некоторые различия: снижения в первые часы после введения гормона, характерного для однократной эстрогенизации (р < 0,02), после повторной не отмечали. На 12-й ч после повторного введения эстрогена, а также на 3-е и 6-е сут содержание рибосом было достоверно выше, чем после однократного. В остальные сроки достоверных различий не обнаружили.
Наличие разбросов, обусловленных индивидуальной чувствительностью цыплят к 17-р-эстрадиолу, затрудняет непосредственное сравнение изменений показателя. Поэтому для оценки динамики содержания рибосом методом наименьших квадратов были построены уравнения регрессии: А = а + Ь1 + Л2 + 113, где А — содержание рибосом в тканях печени, А260А; 1 — время после введения гормона, сут (рис.). При сравнении полученных кривых видно, что содержание рибосом в печени цыплят после повторной эстрогенизации в целом выше (р < 0,05). Это позволяет заключить, что после повторной эстрогенизации интенсивность синтеза белка в печени выше, чем после однократной, и требует большего числа рибосом.
Таким образом, биогенез рибосом в печени у цыплят представляет собой один из главных факторов, количественно определяющих ответ на введение 17-р-эстрадиола. Изменения в печени после однократного и повторного введения 17-р-эстрадиола носили обратимый характер.
Л И Т Е Р А Т У Р А
Динамика содержания рибосом в тканях печени после однократного (1) и повторного (2) введения 17-р-эстрадиола 75-суточным цыплятам породы белый леггорн.
1. B e r g i n k E.W., W a l l a c e R.A. Precursor-product relationship between amphibian vitellogenin and the yolk proteins, lipovitellin and phosvitin. J. Biol. Chem., 1974, 249: 2897-2903.
2. J o s t J.P., P e h l i n g G., B a c a O.G. Rate of synthesis of beta L-lipovitellin in the liver of immature chicks treated with 17-beta estradiol. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1975, 62(4): 957-65.
3. Ж у p а в л e в И.В., Ф и с и н и н В.И., Т о л к а ч е в П.С., Д а н и л и н а В.А. Действие гормонов на содержание свободных аминокислот в печени цыплят. С.-х. биол.,
1980, 15(6): 949-950.
4. К о р ш у н о в а Л.Г. О роли митохондрий в становлении вителлогенной функции печени у кур. С.-х. биол., 2009, 4: 46-50.
5. К о р ш у н о в а Л.Г., К а р а п е т я н Р.В. Синтез вителлогенина в печени эстроге-
низированных цыплят. Вест. РАСХН, 2011, 4: 67-69.
6. К о р ш у н о в а Л.Г., К а р а п е т я н Р.В. Биохимический подход к прогнозирова-
нию яичной продуктивности кур. Докл. РАСХН, 2011, 6: 43-44.
7. Э р н с т Л.К., К л е н о в и ц к и й П.М., Б а г и р о в В.А., В о л к о в а Н.А., 3 и-
н о в ь е в а Н.А., Г у с е в И.В., Д а н ч С.С., Б р е м Г. Состояние хромосомного
аппарата у свиней, трансгенных по гену соматолиберина человека MT1/RhGH. С.-х. биол., 2009, 2: 31-36.
8. С п и р и н А.С. Молекулярная биология: рибосомы и биосинтез белка. М., 2011.
9. Т р у д о л ю б о в а М.Г. Количественное определение РНК и ДНК в субклеточных
фракциях клеток животных. В кн.: Современные методы в биохимии. М., 1977: 313-316.
10. P a l m i t e r R.D. Magnesium precipitation of ribonucleoprotein complexes. Expedient techniques for the isolation of undergraded polysomes and messenger ribonucleic acid. Biochemistry, 1974, 13(17): 3606-3615.
11. D e e l e y R.G., U d e l l D.S., B u r n s A.T., G o r d o n J.I., G o l d b e r g e r R.F. Kinetics of avian vitellogenin messenger RNA induction. Comparison between primary and secondary response to estrogen. J. Biol. Chem., 1977, 252(22): 7913-7915.
12. L o e n i n g U.E. Molecular weights of ribosomal RNA in relation to evolution. J. Mol. Biol., 1968, 38(3): 355-65.
ГНУ Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт птицеводства Россельхозакадемии,
141300 Московская обл., г. Сергиев Посад, ул. Птицеградская, 10 e-mail: lg@vnitip.ru, vnitip@vnitip.ru
BIOGENESIS OF RIBOSOMES IN CHICKEN LIVER AFTER INTRODUCTION OF 17-p-ESTRADIOL
L.G. Korshunova, R.V. Karapetyan S u m m a r y
On the chicken of the White Leghorn breed in scientific experiment the authors studied an influence of single and repeated estrogens introduction on content of protein, DNA, RNA, ribosome in liver. It was shown, that 17-p-estradiol introduction to the chicken results in proliferation and hypertrophy of hepatocytes, the increase of ribosome content in them. The content of ribosome in liver tissue after repeated estrogen introduction was higher, than after single one. The observed changes after single and repeated 17-p-estradiol introduction had reversible character.
Поступила в редакцию 23 мая 2011 года
Новые книги
И м а ш е в У.Б. Основы органической химии. М.: изд-во «КолосС», 2011, 464 с.
Даны основы современной органической химии с привлечением теоретических представлений, необходимых для понимания химизма и механизма органических реакций. Систематически изложена органическая химия основных классов углеводородов и их функциональных производных; рассмотрены методы получения, физические и химические свойства, механизм типичных реакций и области практического использования важнейших органических веществ. Учебник включает глоссарий основных терминов органической химии, список рекомендуемой литературы и предметный указатель.
К а м к и н А.Г., К и с е л е в а И.С. Физиология и молекулярная биология мембран клеток. М.: изд-во «Академия», 2008, 592 с.
Изложены современные представления об электрофизиологии и молекулярной биологии мембран клеток. Освещены
вопросы молекулярной организации биологических мембран, пассивных электрических свойств мембран, путей перемещения ионов через мембраны клеток. Даны общие представления о структуре и функциях ионных каналов. Описан пассивный ионный транспорт, рассматриваются потенциалы клеток и их связь с ионными токами. Приведены молекулярная организация и функции потен-циалуправляемых натриевых, кальциевых и калиевых каналов, обсуждаются отдельные аспекты лигандуправляемых каналов, подробно рассмотрена работа механосенситивных каналов. Дана новая классификация каналов. Для студентов медицинских и биологических высших учебных заведений.
Б и с с в а н г е р X. Практическая энзимо-
логия. М.: изд-во «Бином. Лаборатория знаний», 2010, 328 с.
Рассмотрены теоретические основы энзимологии, применяемых в этой научной области методов, а также приведены описания основополагающих лабораторных работ.
3І
