CC BY
10УДК 616-092.19 DOI: 10.37279/2224-6444-2020-10-3-43-47
БИОФИЗИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА КЛЕТОЧНОЙ ПОВЕРХНОСТИ И ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ ГРАНУЛОЦИТОВ БОЛЬНЫХ ОСТРЫМ ЛИМФОБЛАСТНЫМ ЛЕЙКОЗОМ ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ НАГРУЗКИ С АТФ IN VITRO
Скоркина М. Ю., Жернакова Н. И., Шевченко Т. С., Зеленцова А. С.
ФГАОУ ВО Белгородский государственный национальный исследовательский университет Министерство науки и высшего образования, 308015, ул. Победы, 85, Белгород, Россия
Для корреспонденции: Скоркина Марина Юрьевна, доктор биологических наук, доцент, заведующая кафедрой биохимии медицинского института Белгородского государственного национального исследовательского университета, e-mail: skorkina@bsu.edu.ru
For correspondence: Skorkina Marina Yu., MD, Associate Professor, Head of the Department of Biochemistry of Medical Institute of Belgorod State National Research University, e-mail: skorkina@bsu.edu.ru
Information about authors:
Skorkina M. Yu., http://orcid.org/0000-0002-9441-5295 Zhernakova N. I., http://orcid.org/0000-0001-7648-0774 Shevchenko T. S., http://orcid.org/0000-0001-7327-2662 Zelentsova A. S., http://orcid.org/0000-0001-6022-0206
РЕЗЮМЕ
Выполненное исследование посвящено изучению биофизических свойств клеточной поверхности и функциональной активности гранулоцитов больных острым лимфобластным лейкозом при моделировании нагрузки с АТФ in vitro. Эксперимент был выполнен на периферической крови больных острым лимфобластным лейкозом, прошедших стандартный курс химиотерапии. В опытных пробах моделировали экзогенную нагрузку с АТФ in vitro, добавляя 100,0 |jM аденозин-5-трифосфат динатриевая соль тригидрат к суспензии гранулоцитов. Инкубацию с препаратом проводили в течение 15 мин. при 370С. В качестве контроля использовали суспензию гранулоцитов в среде RPMI 1640 от того же больного, но без добавления препарата, которую инкубировали в течение 15 мин. при температуре 370С. По истечении времени инкубации изучали биофизические свойства (жесткость, заряд клеточной поверхности, силу межклеточной адгезии) гранулоцитов в опытных и контрольных пробах, используя метод атомно-силовой микроскопии, а также оценивали миграционную активность клеток в прямом капиллярном тесте под агарозой. На модели с экзогенной АТФ у больных ОЛЛ установлено снижение жесткости и потенциала поверхности плазмалеммы, усиление адгезивных свойств и миграционной активности гранулоцитов. Выявленные эффекты указывают на ключевую роль молекулы АТФ в механизмах межклеточной сигнализации в микроциркуляторном русле.
Ключевые слова: гранулоциты, модуль Юнга, адгезия, заряд клеточной поверхности, миграция.
BIOPHYSICAL PROPERTIES OF CELL SURFACE AND FUNCTIONAL ACTIVITY OF GRANULOCYTES OF PATIENTS WITH ACUTE LYMPHOBLASTIC LEUKEMIA DURING MODELING OF ATP LOAD IN VITRO
Skorkina M. Yu., Zhernakova N. I., Shevchenko T. S., Zelentsova A. S.
Belgorod State National Research University
SUMMARY
The current study is devoted to the investigation of the biophysical properties of the cell surface and the functional activity of granulocytes in patients with acute lymphoblastic leukemia when simulating the ATP load in vitro. The experiment was performed on the peripheral blood of patients with acute lymphoblastic leukemia (ALL) who underwent a standard course of chemotherapy. In experimental tests, exogenous loading with ATP was simulated in vitro by adding 100.0 jiM adenosine-5-triphosphate disodium salt trihydrate to the granulocyte suspension. Incubation with the drug was carried out for 15 min at 370C. As a control, a suspension of granulocytes in RPMI 1640 medium from the same patient, but without the addition of the drug, was used, this was incubated for 15 min at a temperature of 370C. After the incubation time, the biophysical properties (rigidity, charge of the cell surface, the strength of intercellular adhesion) of granulocytes in experimental and control samples were studied using atomic force microscopy, and the migration activity of cells was also assessed in a direct capillary test under agarose. A model with exogenous ATP in ALL patients showed a decrease in the rigidity and potential of the plasma membrane surface, an increase in the adhesive properties and migration activity of granulocytes. The revealed effects point to the key role of the ATP molecule in the mechanisms of intercellular signaling in the microvasculature.
Key words: granulocytes, Young's module, adhesion, charge of cell surface, migration.
КРЫМСКИЙ ЖУРНАЛ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ И КЛИНИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЫ
Развитие иммунной недостаточности у больных со злокачественными лимфопролифератив-ными процессами в системе крови сопровождается клональной пролиферацией лимфоидных клеток с молекулярными аномалиями в виде генных аббераций и мутаций, в результате чего изменяются процессы транскрипции, нарушается способность контролировать клеточный цикл и продуцировать ряд ключевых белков [1]. В этих условиях гранулоциты выступают основным звеном, осуществляющим реакции клеточного врожденного иммунитета на фоне недостаточности адаптивного иммунитета. Следовательно, важным аспектом является изучение функциональных свойств плазмалеммы гранулоцитов, которая активно участвует в межклеточной коммуникации за счет рецепторного аппарата. На поверхности биомембраны происходит сигнальная трансдукция - переключение внешних сигналов во внутренние, в результате чего формируется скоординированный ответ, направленный на эффективное выполнение грану-лоцитами своих функций.
Универсальным мессенджером в механизмах межклеточной коммуникации между опухолевыми и здоровыми клетками выступает внеклеточная молекула АТФ. Известно, что концентрация АТФ во внеклеточной среде опухоли находится в диапазоне сотни микромолей, тогда как в здоровых тканях обнаруживаются субмикромолярные количества [2]. Согласно данным литературы, рост злокачественной опухоли сопровождается выраженной воспалительной реакцией, формированием диффузных некротических очагов, в результате накопления АТФ во внеклеточной среде [3]. При этом, рядом работ установлено, что АТФ стимулирует хемотаксис нейтрофилов [4] и вызывает значительную задержку апоптоза нейтрофилов, который опосредуется через рецепторы P2Y11 [5]. В связи с вышеизложенным, актуальным является изучение биофизических свойств плазмалеммы иммунных клеток в условиях опухолевого роста в системе крови. Целью выполненного исследования явилось изучить изменения биофизических свойств плазмалем-мы гранулоцитов больных острым лимфобласт-ным лейкозом при моделировании экзогенной нагрузки АТФ in vitro.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В эксперимент отбирали кровь больных острым лимфобластным лейкозом (n=20) в возрасте от 25 до 45 лет, поступивших на лечение в гематологическое отделение областной клинической больницы г. Белгорода. Постановку диагноза и взятие крови осуществляли при непосредственном участии врачей клиницистов.
Больным был проведен стандартный курс химиотерапии, бластные формы в периферической крови отсутствовали.
Кровь собрали в вакуумные пробирки Vacuette K3E, содержащие сухую ЭДТА КЗ в концентрации 2,0 мг (0,006843 моль/литр) на 1 мл крови. Исследования выполнены с соблюдением требований Хельсинской декларации, получено предварительное информированное согласие участников эксперимента в соответствии с рекомендациями1.
Суспензию гранулоцитов получали путем центрифугирования цельной крови при 1500 об./мин в течение 15 мин. Клетки отбирали и ресуспендировали в культуральной среде RPMI 1640 (ПанЭко, Россия). Каждую пробу делили на две части - контрольную и опытную. В опытных пробах моделировали экзогенную нагрузку с АТФ in vitro, добавляя 100,0 цМ аденозин-5-трифосфат динатриевая соль тригидрат (АТФ-Na2x3H2O) (Sigma) к суспензии гранулоцитов. Инкубацию с препаратом проводили в течение 15 мин при 370С. В качестве контроля использовали суспензию гранулоцитов в среде RPMI 1640 от того же больного, но без добавления препарата, которую инкубировали в течение 15 мин при температуре 370С.
По истечении времени инкубации изучали биофизические свойства (жесткость, заряд клеточной поверхности, силу межклеточной адгезии) гранулоцитов в опытных и контрольных пробах, используя метод атомно-силовой микроскопии. Для оценки жесткости клеточной поверхности измеряли модуль Юнга на атомно-силовом микроскопе (АСМ) ИНТЕГРА ВИТА (конфигурация на базе инвертированного оптического микроскопа Olympus IX-71) в режиме силовой спектроскопии, согласно алгоритму, описанному в работе [6]. Из каждой пробы сканировали по 20 клеток. В целом, в эксперименте отсканировано по 400 клеток и получено 800 силовых кривых подвода и отвода в опытной и контрольной группах.
Заряд клеточной мембраны оценивали по данным потенциала поверхности, который измеряли на атомно-силовом микроскопе в режиме моды Кельвина. Готовили суспензию гранулоци-тов, которую отмывали изотоничным раствором хлорида натрия в течение 5 мин, затем фиксировали 0,25% раствором глутарового альдегида в течение 20 мин. После фиксации суспензию гранулоцитов дважды отмывали изотоничным раствором хлорида натрия по 5 мин и готови-
1 Декларация по этическим принципам медицинских
исследований, в которых участвуют люди, принятая 52-ой Генеральной Ассамблеей Всемирной Медицинской Ассоциации, Эдинбург, Шотландия, октябрь, 2000 г.
ли препараты на обезжиренной металлической подложке. Для сканирования использовали кан-тилеверы с токопроводящим титановым покрытием серии NSG03/TiN (Nanoworld, США). Из каждой пробы сканировали по 20 гранулоцитов. Расчет потенциала поверхности и обработку полученных сканов осуществляли в программе Nova (NT-MDT, Россия).
Силу межклеточной адгезии измеряли на АСМ в режиме силовой спектроскопии, используя для сканирования биосенсорный чип, изготовленный на основе нативного эритроцита и типлесса CSG11 (Nanoworld, США) согласно способу, изложенному в работе [7]. Силу адгезии измеряли в системе «эритроцит-гранулоцит», регистрируя силовые кривые с поверхности 20 клеток. Расчет данных осуществляли с помощью программного обеспечения Nova (NT-MDT, Зеленоград, 2009).
Миграционную активность гранулоцитов определяли в прямом капиллярном тесте под ага-розой. Предварительно оценивали жизнеспособность клеток с помощью счетчика и анализатора жизнеспособности клеток Countress II Automated Cell Counter (Thermo, Life Technologies, США
Биофизические свойства гранулоцитов б
2019), добавляя к 1 мкл клеточной суспензии 5 мкл 0,4% раствора трипанового синего (1пуЙ1^еп, США). В эксперименте работали с пробами с жизнеспособностью лейкоцитарной суспензии не менее 95%. Подсчет мигрировавших клеток в 1 мкл среды проводили в 25 больших квадратах сетки счетной камеры Горяева под большим увеличением (окуляр 20х, объектив 40х).
Результаты экспериментальных исследований обработаны методами вариационной статистики. Достоверность различий между контрольными и опытными пробами определяли с использованием t критерия Стьюдента при р<0,05 в случае нормального распределения признака и и-критерия Манна-Уитни при р<0,05 для непараметрических данных. В работе приведены средние величины (М) и величины статистической ошибки средней (т).
РЕЗУЛЬТАТЫ
В условиях экзогенной нагрузки с АТФ жесткость гранулоцитов снизилась на 71,4 % (р<0,05) по сравнению с контролем (табл.1).
Таблица 1
ьных острым лимфобластным лейкозом
Параметр Контроль(n = 400) Опыт (n = 400)
Модуль Юнга гранулоцитов, мПа 2,441 ± 0,056 0,699 ± 0,015*
Сила адгезии «эритроцит-гранулоцит», нН 52,8 ± 1,3 184,5 ± 9,8**
Потенциал поверхности лейкоцитов, мВ -21,49 ± 1,19 -37,74 ± 1,14*
% мигрировавших гранулоцитов 8,9 ± 0,5 37,3 ± 1,2*
Примечания: п - количество просканированных клеток, * статистически значимые различия между показателями по ^критерию Стьюдента (р < 0,05); **статистически значимые различия между показателями по и-критерию Манна-Уитни (р < 0,05); п - количество просканированных клеток.
Сила адгезии между эритроцитом и грануло-цитом в опытной группе возросла в 3,5 раза, при этом заряд клеточной поверхности стал более отрицательным и снизился на 43% (р<0,05) по сравнению с контролем. Существенное изменение биофизических свойств плазмалеммы отразилось на их миграционной активности. Согласно данным таблицы, процент мигрировавших гранулоцитов в условиях экзогенной нагрузки с АТФ увеличился на 76,14 %(р<0,05) по сравнению с контролем.
ОБСУЖДЕНИЕ
В выполненном исследовании в качестве естественной модели опухолевого процесса выбран острый лимфобластный лейкоз на стадии лечения, при котором в периферической крови отсутствовали бластные формы. В этих условиях поверхность гранулоцитов, как непо-
средственных участников иммунных реакций и межклеточных коммуникаций, подвергалась модификациям при проведении стандартных хи-миотерапевтических схем лечения. В результате проведенного эксперимента проанализировано изменение биофизических свойств плазмалем-мы и миграционной активности гранулоцитов больных ОЛЛ при моделировании экзогенной нагрузки с АТФ in vitro.
Под влиянием экзогенной молекулы АТФ установлено существенное снижение модуля Юнга, характеризующего жесткость клеточной поверхности. Выявленные изменения мы связываем с реализацией сигнального каскада с участием ионов Са2+. Согласно данным литературы, активация Р2 рецепторов на клеточной поверхности индуцируют увеличение внутриклеточного Са2+ в нейтрофилах человека и способствует разборке полимеризованного актина [8], что
КРЫМСКИЙ ЖУРНАЛ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ И КЛИНИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЫ
приводит к снижению концентрации актин сшивающих белков [9]. Изменение упруго-эластических свойств тесно связаны с миграционной активностью клетки. Под влиянием внеклеточной АТФ установлено усиление миграционной активности гранулоцитов. Полученные результаты согласуются с данными, согласно которым доказана регулирующая функция внеклеточной АТФ, посредством влияния на Р2Х7 рецептор, в результате изменяется активность селектина и миграция нейтрофилов [10]. Кроме того, под влиянием экзогенной нагрузки с АТФ изменились заряд и сила межклеточной адгезии. Более отрицательный заряд и усиление адгезивных свойств плазмалеммы, на фоне увеличения миграционной активности, указывают на ключевую роль внеклеточной АТФ в развитии воспаления в сосудистой стенке [11].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, в смоделированном нагрузочном тесте с экзогенной АТФ у больных ОЛЛ, прошедшим лечение стандартным курсом химиотерапии, установлено снижение жесткости и потенциала поверхности плазмалеммы, усиление адгезивных свойств и миграционной активности гранулоцитов. Выявленные эффекты указывают на ключевую роль молекулы АТФ в механизмах межклеточной сигнализации в ми-кроциркуляторном русле.
Источники финансирования работы
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 18-015-00032\20.
Acknowledgements. The reported study was funded by the Russian Foundation of Basic Research (RFBR) according to the research project № 18-015-00032\20.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Conflict of interest. The authors have no conflict of interests to declare.
ЛИТЕРАТУРА
1. Долинский Д. А. Молекулярные механизмы лей-когенеза. Основы таргетной терапии. Онкогематология. 2012;(1):46-54.
2. Pellegatti P., Raffaghello L., Bianchi G., Piccardi F., Pistoia V., Di Virgilio F. Increased level of extracellular ATP at tumor sites: in vivo imaging with plasma membrane luciferase. PLoS ONE. 2008;3(7): e2599. doi:10/1371/ journal.pone.0002599.
3. Di Virgilio F. Purines, purinergic receptors, and cancer. Cancer Res. 2012; 72(21):1-7. doi:10.1158/0008-5472.CAN-12-1600.
3. Junger W. G. Purinergic regulation of neutrophil chemotaxis. Cell Mol. Life Sci. 2008;65(16):2528-2540. doi:10.1007/s00018-008-8095-1.
4. Vaughan K .R., Stokes L., Prince L. R., Marriott H. M., Meis S., Kassack M. U., Bingle C. D., Sabroe I., Surpernant A., Whyte M. K. B. Inhibition of neutrophilapoptosis by ATP is mefiated by the P2Y11 receptors. J. Immunol. 2007;179(12):8544-8553. doi:10.4049/jimmunol.179.12.8544.
5. Скоркина М. Ю., Федорова М. З., Муравьев А. В. и др. Использование наномеханического сенсора для изучения морфофункциональных свойств лимфоцитов здоровых доноров и больных хроническим лимфо-бластным лейкозом. Клеточные технологии в биологии и медицине. 2012;(3):172-175.
6. Скоркина М. Ю., Шамрай Е. А., Сладкова Е. А. Измерение сил адгезии в системе «клетка-клетка» на основе технологий атомно-силовой микроскопии. Клеточные технологии в биологии и медицине. 2017;(4):213-215.
7. Chen Yu., Corriden R., Inoue Y., Yip L., Hashiguchi, Zinjernagel A., Nizet V., Insel P.A., Junger W.G. ATP release guides neutrophil chemotaxis via P2Y2 and A3 receptors. Science. 2006; 314 (5806): 1792-1795. doi:10.1126/science.1132559.
8. Goldman N., Chandler-Militello D., Langevin H., Nedergaard M., Takano T. Purine receptor mediated actin cytoskeleton remodeling of human fibroblasts. Cell Calcium. 2013; 53 (4): 297-301. doi:10.1016/j. ceca.2013.01.004.
9. Yap B., Kamm R.D. Cytoskeletal remodeling and cellular activation during reformation of neutrophils into narrow channels. J. Appl. Physiol. 2005;99(6):2323-2330. doi: 10.1152/japplphysiol.00503.2005.
10. Ley K., Laudanna C., Cynulsky M.I., Nourshargh S. Getting to the site of inflammation the leukocyte adhesion cascade updated. Nat. Rev. Imunol. 2007;7:678-689. doi: 10.1038/nri2156.
11. Lohman A.W., Billaud M., Isakov B.E. Mechanisms of ATP release and signaling in the blood vessel wall. Cardiovascular Research. 2012;95:269-280. doi: 10.1093/ cvr/cvs187.
REFERENCES
1. Dolinskii D.A. Molecular mechanisms of lucogenesis. The basis of target therapy. Oncohaematology. 2012;(1):46-54. (In Russ.).
2. Pellegatti P., Raffaghello L., Bianchi G., Piccardi F., Pistoia V., Di Virgilio F. Increased level of extracellular ATP at tumor sites: in vivo imaging with plasma membrane luciferase. PLoS ONE. 2008; 3 (7): e2599. doi:10/1371/ journal.pone.0002599.
3. Di Virgilio F. Purines, purinergic receptors, and cancer. Cancer Res. 2012; 72(21):1-7. doi:10.1158/0008-5472.CAN-12-1600.
3. Junger W.G. Purinergic regulation of neutrophil chemotaxis. Cell Mol. Life Sci. 2008; 65(16): 2528-2540. doi: 10.1007/s00018-008-8095-1.
4. Vaughan K.R., Stokes L., Prince L.R., Marriott H.M., Meis S., Kassack M.U., Bingle C.D., Sabroe I., Surpernant A., Whyte M.K.B. Inhibition of neutrophilapoptosis by ATP is mefiated by the P2Y11 receptors. J. Immunol. 2007;179(12):8544-8553. doi:10.4049/ jimmunol.179.12.8544.
5. Skorkina M.Yu., Fedorova M.Z., Muravyov A.V., Sladkova E.A. Use of nanomechanic sensor for studies of lymphocytes from healthy donors and patients with chronic lymphoblastic leukemia. Cell Technologies in Biology and Medicine. 2012;(3):172-175. (in Russ.)
6. Skorkina M.Yu., Shamray E.A., Sladkova E.A. Mesuring of adhesive forces in the system of «cell-cell» based on the technology of atomic force microscopy. Cellular technology in biology and medicine. 2017;(4):213-215. (In Russ.)
7. Chen Yu., Corriden R., Inoue Y., Yip L., Hashiguchi, Zinjernagel A., Nizet V., Insel P.A., Junger W.G. ATP
release guides neutrophil chemotaxis via P2Y2 and A3 receptors. Science. 2006;314(5806):1792-1795. doi:10.1126/science.1132559.
8. Goldman N., Chandler-Militello D., Langevin H., Nedergaard M., Takano T. Purine receptor mediated actin cytoskeleton remodeling of human fibroblasts. Cell Calcium. 2013; 53(4):297-301. doi:10.1016/j. ceca.2013.01.004.
9. Yap B., Kamm R.D. Cytoskeletal remodeling and cellular activation during reformation of neutrophils into narrow channels. J. Appl. Physiol. 2005;99(6):2323-2330. doi: 10.1152/japplphysiol.00503.2005.
10. Ley K., Laudanna C., Cynulsky M.I., Nourshargh S. Getting to the site of inflammation the leukocyte adhesion cascade updated. Nat. Rev. Imunol. 2007;7:678-689. doi:10.1038/nri2156.
11. Lohman A.W., Billaud M., Isakov B.E. Mechanisms of ATP release and signaling in the blood vessel wall. Cardiovascular Research. 2012;95:269-280. doi: 10.1093/ cvr/cvs187.
