CC BY
123
(15 / 2 х 6) = 60 мл среды, что составило, соответственно, 355,05 руб / 1000 х 22,5 = 7,99 руб. и 1710,1 / 1000 х 60 = 102,61 руб.
Таким образом, при условии оптимизации протоколов, получение первичной монослойной культуры ЗКФ в 12,844 раза дороже по себестоимости культуральной среды, чем ЭФ. Поскольку сроки формирования монослоя при последующем пассировании ЭФ и ЗКФ на оптимальных средах достоверно не отличаются, то себестоимость культуральной среды для поддержания жизнеспо-
собности и размножения ЭФ и ЗКФ для клинического использования отличается в 983,3 / 355,05 = 2,77 раза.
Исходя из представленных выше данных, а также доказанной ранее одинаковой клинической эффективности трансплантации фибробластов различной степени зрелости [7], практическое применение эмбриональных фибробластов оказывается значительно более целесообразным по экономическим показателям.
Таблица 4
Сроки формирования монослойной культуры в процессе пассирования и длительность пролиферации
in vitro эмбриональных фибробластов (в сутках)
№ линии ЭФ 10% СКРС 5% СКРС
Срок формирования монослоя Кол-во пассажей Срок формирования монослоя Кол-во пассажей
1 2 50 7 2
2 2 51 10 2
3 2 51 12 1
4 3 48 12 1
5 2 64 12 2
6 2 59 нет нет
7 3 49 13 1
8 3 46 9 3
9 2 49 нет нет
10 2 53 нет нет
M±tm 2,30±0,30 52,00±3,39 10,71±1,58* 1,71±0,56**
Примечание: статистическая значимость различий между сроком формирования монослоя * и количеством пассажей ** р<0,05.
Таблица 5
Сроки формирования монослойной культуры в процессе пассирования и длительность пролиферации
in vitro зрелых кожных фибробластов (в сутках)
е « го К и н к « № Стандартный (1) 20%ЭТС (2) 10%ЭТС+ 10%СКРС (3) 10% СКРС (4)
Срок формирования монослоя Кол-во пассажей Срок формирования монослоя Кол-во пассажей Срок формирования монослоя Кол-во пассажей Срок формирования монослоя Кол-во пассажей
1 3 45 2 43 3 12 3 3
2 3 49 2 48 3 18 4 7
3 2 52 2 49 2 16 4 10
4 3 53 2 51 3 16 5 5
5 3 49 2 51 3 13 3 3
6 2 49 2 50 3 9 3 3
7 4 50 2 51 4 14 3 6
8 3 52 3 52 3 20 6 9
9 2 51 2 45 2 17 3 11
10 2 52 2 50 2 17 3 6
M±tm 2,70(4) ±0,42 50,20(3,4) ±1,46 2,10(3,4) ±0,20 49,00(3,4) ±1,80 2,80(2) ±0,39 15,20(1,2,4) ±2,00 3,70(1,2) ±0,66 6,30(1,2,3) ±1,83
Примечание: в скобках в верхнем регистре статистически значимые (р<0,05) различия между сроком формирования монослоя и количеством пассажей в соответствующей модификации культуральной среды.
Таблица 6
Стоимость основных компонентов для выращивания АДФ в рублях
Наименование компонента ПанЭко БиолоТ Средняя цена
Питательная среда Игла МЕМ жидкая, с Ь-глутамином, стерильная, из полнокомпонентной смеси фирмы HyQlone, 450 мл 126,5 130 128,25
Сыворотка крови эмбриональная телячья, для культур эукариотических клеток, жидкая, стерильная, 500 мл 3068 4200 3634
Сыворотка крови крупного рогатого скота, для культур клеток, жидкая, стерильная, 400 мл 389,4 399 394,2
Раствор трипсина-версена, 0,05%, 200 мл 64,9 105 84,95
8. Парамонов Б.А., Порембский Я.О., Яблонский В.Г. Ожоги: рук-во для врачей. - СПб: СпецЛит, 2000. - 480 с.
9. Рахаев А.М., Крутиков М.Г. Современные методы лечения пограничных ожогов IIIA степени и донорских ран // Комбустиология (электронный журнал). - 1999, № 3.
10. Саркисов Д.С., Федоров В.Д., Глущенко Е.В., Алексеев А.А. Теоретические и практические аспекты использования культивированных фибробластов при восстановлении кожных покровов // Вестн. Рос. АН. - 1994, № 6. - С. 6-11.
11. Селезнёв Ю.П., Иванов С.В., Гапонов А. М. и др. Способ трансплантации фибробластов в остаточную полость легкого. - Патент РФ № 2130288 от 20.05.1999 г.
12. Фёдоров В.Д, Саркисов Д.С., Алексеев А.А. и др. Применение культивированных фибробластов при ожогах кожи // Врач. - 1993, № 11. - С. 26-28.
13. El-Ghalbzouri A., Gibbs S., Lamme E. et al. Effect of fibroblasts on epidermal regeneration // Br. J. Dermatol. - 2002. - Vol. 147. - P. 230-243.
14. Freshney R.I. Culture of animal cells: a manual of basic techniques. - NY: Wiley-Liss, 2000. - 577 p.
15. Morimoto N., Saso Y., Tomihata K. et al. Viability and function of autologous and allogeneic fibroblasts seeded in dermal substitutes after implantation // J. Surg. Res. - 2005. - Vol. 125. - P. 56-67.
ЛИТЕРАТУРА
1. Азолов В.В., Жегалов В.А., Перетягин С.П. Состояние и перспективы развития комбустиологии в России // Комбустиология (электронный журнал). - 1999, № 1.
2. Алексеев А.А., Крутиков М.Г., Попов С.В. и др. Современные методы хирургического лечения ожогов с использованием культивированных ал-лофибробластов. Пособие для врачей. - М., НИИ хирургии им. А.В. Вишневского. - 2007. - 28 с.
3. Вихриев Б.С., Бурмистров В.М. Ожоги. Руководство для врачей. - Л.: Медицина, 1986. - 272 с.
4. Воздвиженский С.И., Окатьев В.С., Будкевич Л.И., Булетова А.А. Оперативное лечение глубоких ожогов у детей // Детская хирургия. - 1997. -№ 2. - С. 17-19.
5. Герасимова Л.И., Назаренко Г.И. Термические и радиационные ожоги: Руководство для врачей. -М.: Медицина, 2005. - 384 с.
6. Гланц С. Медико-биологическая статистика. - М.: Практика, 1998. - 459 с.
7. Ледовской С.Н., Бурда Ю.Е., Лазаренко В.А. Анализ клинической эффективности применения фетальных и зрелых аллогенных диплоидных фиб-робластов в лечении пограничных ожогов // Успехи современного естествознания. - 2008. - № 9. -С. 92-94.
УДК 615.072:543.05
БИОФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ IN VITRO ТРАНСДЕРМАЛЬНЫХ ПЛАСТЫРЕЙ
С МЕКСИДОЛОМ
©Лосенкова С.О., Степанова Э.Ф., *НовиковВ.Е.
Кафедра фармацевтической технологии Смоленской государственной медицинской академии, Смоленск; кафедра технологии лекарств Пятигорской государственной фармацевтической академии, Пятигорск, Ставропольский край;
кафедра фармакологии с курсом фармации ФПК Смоленской государственной медицинской академии, Смоленск E-mail: [email protected]
Разработаны составы и сконструированы матричные пластыри с мексидолом. Процесс высвобождения лекарственного вещества из матричных композиций, таблеток и субстанции изучали биофармацевтическим методом диализа через мембрану по свойствам и структуре близкую к натуральным мембранам. В качестве диализной среды использована вода очищенная, хорошо имитирующая кровеносную систему. Отбор проб осуществляли через определённые промежутки времени. Количественное содержание мексидола в диализате анализировали УФ-спектрофото-метрически. В качестве основных исследуемых параметров были выбраны количество высвободившегося мексидола (мкг/см2), скорость трансдермальной подачи за определённый промежуток времени (мкг/ч-см2), степень высвобождения (%) мексидола из матрицы.
Ключевые слова: мексидол, пластырь, метод диализа, скорость трансдермальной подачи.
BIOPHARMACEUTICAL RESEARCHES IN VITRO TRANSDERMAL OF PLASTERS WITH MEXIDOL
Losenkova S.O., Stepanova E.F., Novikov V.E.
Pharmaceutical Technology Department of the Smolensk State Medical Academy, Smolensk;
Technology of Drugs Department of the Pyatigorsk State Pharmaceutical Academy, Pyatigorsk, Stavropol Region;
Department of Pharmacology with a Course of Pharmacy FPQ of the Smolensk State Medical Academy, Smolensk
Structures are developed and matrix plasters with Mexidol are designed. Process of liberation of medicinal substance of matrix compositions, tablets and a substance studied a biopharmaceutical method of a dialysis through a membrane on properties and structure close to natural membranes. As the dialysis environment pure water, which is similar to the blood system, has been used. Sampling carried out through certain time intervals. The quantity ofMexidol in dialysatum was analyzed by Uf-spektrofotometricheski. As the basic investigated parametres have been chosen quantity liberated of Mexidol (mkg/sm2), speed transdermal givings for a certain time interval (mkg/ch-sm2), degree of liberation (%) of Mexidol from a matrix.
Keywords: Mexidol, a plaster, a dialysis method, speed transdermal givings.
Анализ имеющихся в литературе сведений о роли лекарственной формы (ЛФ) в современной фармакотерапии свидетельствует о том, что успешно подобранные ЛФ позволяют максимально использовать действие лекарственных средств при минимальных побочных эффектах [1]. Наиболее предпочтительными в настоящее время являются интраназальный, лёгочный и транс-дермальный пути введения лекарственных средств. Пригодность лекарственного вещества для использования в форме ТТС определяется несколькими факторами, основным из которых являются его физико-химические свойства, обеспечивающие способность проникать через кожу в терапевтических дозах.
Трансдермальные терапевтические системы являются альтернативой парентеральному и пероральному введению лекарственных средств. Причем альтернативой весьма привлекательной. По сравнению с пероральным приемом
трансдермальное введение обеспечивает более быстрое действие препарата и помогает избежать проблем, связанных со снижением его активности в результате первого пассажа желудочного метаболизма. Мало того, при таком введении появляется возможность снизить частоту назначения лекарства, уменьшить необходимые дозы и при этом избежать колебаний его концентрации в крови, а при развитии нежелательных реакций — немедленно прекратить лечение [3, 5]. К тому же трансдермальное введение намного удобнее для пациентов. Особенно страдающих хроническими заболеваниями, протекающими на фоне повышенного свободно-радикального окисления. Эндогенная антиоксидантная система организма противостоит повреждающему действию свободных радикалов, но очень часто при патологии антиоксиданты вводят извне, так как присутствующие в клетке в малых количествах антиоксиданты не справляются с патологическим про-
цессом [2]. Поэтому включение антиоксидантов и антигипоксантов в комплексное лечение таких заболеваний является рациональным. Транс-дермальные лекарственные формы с антиоксидантами и антигипоксантами в настоящее время не зарегистрированы, поэтому целью нашего исследования явились разработка, конструирование и биофармацевтические исследования транс-дермальных матричных композиций.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Согласно цели исследования сконструированы матричные пластыри следующего состава:
композиция № 1: спирт этиловый 95%, субстанция мексидола, поливинилпирролидон среднемолекулярный 40000 (BioChemica), полиэти-ленгликоль низкомолекулярный (ПЭГ-400).
Композиция № 2: спирт этиловый 95%, субстанция мексидола, поливинилпирролидон высокомолекулярный 1500000 (Пласдон К 90), поли-этиленгликоль низкомолекулярный (ПЭГ-400). Композиции наносили на плёнку-подложку с не-металлизированной стороны. Площадь пластыря 25 см2. Высушивали при комнатной температуре 24 часа. Пласдон К90 любезно предоставлен нам для исследования компанией ISP (г. Москва). Субстанция мексидола любезно предоставлена нам для исследования производственной компанией "Фармасофт".
Пласдон К90 выполняет роль плёнкообразо-вателя, пролонгатора и адгезива, ПЭГ -400 является универсальным растворителем для лекарственного вещества, стабильным при хранении, а также способствует проникновению мексидола через кожные покровы. Спирт этиловый 95% обеспечивает микробиологическую чистоту ЛФ, являясь консервантом и растворителем.
Наиболее распространённым биофармацевти-ческим методом изучения процесса высвобождения лекарственных веществ является метод диализа. Эффективное использование этого метода определяется главным образом выбором подходящей мембраны. Нами использована мембрана по свойствам и структуре близкая к натуральным мембранам, с длительным сроком хранения и использования, с большой рабочей поверхностью. Мембраны получали путём приготовления 6% раствора лецитина (БАД "Наш лецитин" г. Краснодар) в кипящем 95% этиловом спирте, погружения мелкопористых бумажных фильтров " синяя лента" диаметром 15 см в раствор лецитина и выдерживания в нём в течение 48 часов. Удаления избытка спирта от фильтров деаэрацией. Именно лецитин составляет основу биологической мембраны [4].
На адгезионный слой модельных матриц № 1 и № 2 (площадь 25 см2), полученных по вышеописанной технологии, наклеивали образец модели биологической мембраны, заменяющей "переживающую" кожу животных. Ламинат модельных матриц с мембраной закрепляли в держателе и погружали в химический стакан с 50 мл воды очищенной. Полученная система термостатиро-валась при температуре 37±0,5°С. Отбор проб диализата (3,0 мл) осуществлялся через 30 минут, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 18, 24, 48, 72 часа с немедленным возвращением в диализат взятого объёма растворителя. Далее 3,0 мл диализата помещали в мерную колбу на 50 мл и доводили до метки 0,01 М раствором кислоты хлористоводородной. Полученное разведение анализировали спектрофотометрически в диапазоне волн 240-340 нм. Оптическую плотность измеряли в максимуме поглощения (297±3 нм) согласно ФСП "мексидол 5% раствор для инъекций". Толщина слоя 10 мм. Параллельно измеряли оптическую плотность контрольных образцов композиций № 1 и № 2. Содержание мексидола в диализате рассчитывали с учётом разведения РСО.
В качестве основных исследуемых параметров были выбраны количество высвободившегося мексидола (мкг/см2), скорость трансдермальной подачи за определённый промежуток времени (мкг/ч-см2), степень высвобождения (%) мексидола из матрицы. Скорость трансдермальной подачи мексидола за определённый промежуток времени через модель биологической мембраны определяли по формуле 1 :
V=Q / t*S,
где V - скорость высвобождения мексидола через мембрану за определённый промежуток времени мкг/ч-см2;
Q - количество мексидола, проникшее через мембрану за определённый промежуток времени, мкг; t - изучаемый промежуток времени, ч;
S - площадь мембраны (пластыря), см2.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Результаты проведённых биофармацевтиче-ских исследований представлены в таблице 1.
Представленные в таблице 1 данные, характеризующие количество высвободившегося мекси-дола (мкг/см2) и скорость его подачи за промежуток времени (мкг/ч-см2) из матрицы № 1 и № 2 соответственно, свидетельствуют о том, что в первые 4 часа наблюдалось увеличение скорости подачи ЛВ из матрицы № 1 и в первый час из матрицы № 2. Начиная со 2 по 48 час из матрицы № 1 и с 1 по 24 час из матрицы № 2 отмечалось непрерывное снижение скорости подачи мекси-дола.
Таблица 1
Количество высвободившегося мексидола (мкг/см2), степень высвобождения (%) и скорость его подачи
за промежуток времени (мкг/ч-см2) из матриц № 1 и № 2
Период наблюдения Значение показателей через интервалы времени Матрица № І Значение показателей через интервалы времени Матрица № 2
0,5 часа A(мкг/см2) 93,14 ii3,GG
Х,% 4,б5 5,б5
^мкг/ч-см2) 1S6,2S 226,GG
1 час A 24S,43 32б,7б
Х,% 12,42 Іб,34
V (G^-ічас) 24S,43 32б,7б
2 часа A 511,76 59S,44
Х,% 25,6G 29,92
Щ-2часа) 2б3,33 271,6s
4 часа A б45,б2 SS1,96
Х,% 32,2S 44,i
V (2-4часа) iG9,7G І4І,7б
6 часов A SS7,2S 1G19,76
Х,% 44,3б 5G,99
V(4-6часов) 7S,G6 6S,9G
8 часов A 972,S iGS3,GG
Х,% 4S,64 54,Іб
V (б-8часов) 42,7б 3І,б2
12 часов A 97G,S4 ІІ2І,24
Х,% 4S,54 56,G6
V (8-12часов) 3,G9 4,i
18 часов A 964,SS 1G7G,76
Х,% 4S,24 53,54
V (І2-і8часов) 2,37 G,ii
24 часа A 99G,36 iGGG,GG
Х,% 49,52 5G,GG
V (І8-24часа) 2,i4 G,53
48 часов A iG3G,SG 853,32
Х,% 51,54 42,б7
V (24-48часов) G,77 G
72 часа A 7S7,44 ббб,9б
Х,% 39,37 33,35
V (48-72часа) G G
Примечание: ДХ= ±0,3.
Для вычисления скорости трансдермальной подачи мексидола из исследуемых матриц через модельную мембрану построены кривые зависимости количества высвободившегося лекарственного вещества (мкг/см2) от времени (ч) (рис. І). По оси абсцисс представлены временные исследуемые интервалы.
Скорость подачи мексидола из матриц определяли как тангенс угла наклона стационарного участка прямой.
Наиболее прямые участки кинетических прямых трансдермальной подачи мексидола из матрицы № і и № 2 на рисунке і соответствуют интервалам 12-24 часа и 18-24 часа с момента нача-
ла опыта, следовательно, среднее значение скорости трансдермальной подачи мексидола из матрицы № і равно 2,53 ± 0,3 мкг/ч-см2, а из матрицы №2 0,32 ±0,3 мкг/ч-см2. Степень высвобождения мексидола к 24 часу из матрицы № і составила 49,52%, а из матрицы № 2 к 24 часу - 5G,G%.
Для сравнительной оценки влияния вспомогательных веществ на степень и скорость высвобождения мексидола из разнообразных лекарственных форм нами проведены биофармацевти-ческие исследования, где в качестве объекта использованы субстанция (50 мг) и таблетки мекси-дола (0,і25 г). Результаты эксперимента представлены в таблице 2.
І2І
о
ш
OJ
d
эе
о
о
СЭ
U
со
123456789 10 11 12
Рис. І. Кинетические кривые трансдермальной подачи мексидола.
Примечание: ряд 1 - матрица № 1 ; ряд 2 - матрица № 2.
Таблица 2
Количество высвободившегося (мкг) мексидола и степень его высвобождения (%) из субстанции и таблеток
Период наблюдения Субстанция (50000мкг) Таблетка (125000мкг)
0,5 часа A 6S25,GG GG
Х,% І3,б5 G,GG
V(мкг/ч) í365G,GG G
1 час A i4i77,GG 55G,GG
Х,% 28,35 G,44
V(мкг/ч) i4i77,GG 55G,GG
2 часа A 229SG,GG 3S9S,GG
Х,% 45,9б 3,i2
V(мкг/ч) SSG3,GG 334S,GG
4 часа A 2SG9i,GG 23G53,GG
Х,% 5б,І8 iS,44
V(мкг/ч) 2555,5G 9577,5G
6 часов A 3i357,GG 446í2,GG
Х,% 67,7і 35,б9
У(мкг/ч) í633,GG iG779,5G
8 часов A 33534,GG 7iS7G,GG
Х,% 67,G7 57,5
У(мкг/ч) iGSS,5G í3629,GG
12 часов A 3S697,GG 9SG35,GG
Х,% 77,4 78,43
У(мкг/ч) i29G,75 654і,25
18 часов A 394iG,GG 977S7,GG
Х,% 78,82 78,23
У(мкг/ч) iiS,S3 G
24 часа A 3G7iG,GG 94562,5G
Х,% бІ,42 75,б5
У(мкг/ч) G G
48 часов A 29964,GG 93G37,5G
Х,% 59,92 74,43
У(мкг/ч) G G
72 часа A 26522,GG 83бб2,5
Х,% 53,G4 бб,93
G G
Примечание: АХ= ±0,4.
■ Ряді
■ Рн д2
І22
