CC BY
252
Химия растительного сырья. 2005. №4. С. 41-44.
УДК. 630.905
БИОДЕСТРУКЦИЯ ЛИГНИНА ИЗ ДРЕВЕСНО-СТРУЖЕЧНЫХ ПЛИТ МИКРОСКОПИЧЕСКИМИ ГРИБАМИ
© Ю.П. Клягина1, В.Ф. Смирнов1, И.В. Стручкова1, А.Н. Трофимов2, А.Н. Кислицын2
1 Нижегородский государственный университет им. Н. И. Лобачевского, пр. Гагарина, 23, корп. 1, Нижний Новгород, 603950 (Россия)
E-mail: nto@ichem.unn.runnet.ru
2Государственное унитарное предприятие «Центральный научноисследовательский и проектный институт лесохимической промышленности», Московское шоссе, 85, ГСП-703, Нижний Новгород,
603603 (Россия) E-mail: tsnilkhi@internet2.ru
Исследована метаболизируемость лигнина, выделенного из ДСП сернокислотным и диоксановым методами. В качестве связующего при производстве ДСП были использованы фенолформальдегидная и карбамидная смолы. Наибольшую способность к деструкции лигнина продемонстрировал гриб Aspergillus fumigatus, а также Stemphylium verruculosum и Paecilomyces carneus. Биостойкость ДСП с фенолформальдегидными смолами выше, чем с карбамид-ными. Таким образом, показано, что лигнин подвержен деструкции под действием грибов.
Введение
Один из распространенных материалов, имеющий широкое применение в строительстве, мебельной промышленности, вагоно- и автомобилестроении, - древесно-стружечные плиты (ДСП) [1]. Однако в процессе эксплуатации ДСП могут подвергаться негативным воздействиям различных микроорганизмов, главным образом микроскопических грибов [2]. Микроскопические грибы способны использовать компоненты плиты в качестве единственного источника питания. Основные компоненты древесно-стружечных плит - древесные частицы, формирующие каркас плиты. В качестве связующих древесных частиц выступают смолы (фенолформальдегидная или карбамидная). Из литературных источников известно, что фе-нолформальдегидная и карбамидная смолы не являются питательным субстратом для микроскопических грибов [3], поэтому единственный компонент ДСП, на котором возможен рост грибов, - это древесные частицы. Древесина, входящая в состав ДСП, содержит целлюлозу, гемицеллюлозы, лигнин. Особый интерес вызывает лигнин, как потенциальный субстрат для роста грибов. Данный интерес обусловлен тем, что очень долгое время считалось, что разложение лигнина невозможно [4]. Полагали, что лигнин является наиболее устойчивым компонентом органического вещества древесины и нативный лигнин не может ме-таболизироваться. Однако существует и другая точка зрения на этот вопрос. Ряд авторов предполагают, что возможно частичное разрушение лигнина под действием грибов, содержащих комплекс лигнинразру-шающих ферментов (лакказа, фенолоксидаза, полифенолоксидаза, тирозиназа, каталаза, пероксидаза) [5].
В связи с вышесказанным представляло интерес получить препарат лигнина из опилок древесностружечных плит на основе фенолформальдегидных и карбамидных смол, изучить лигнинразрушающий комплекс ферментов грибов - деструкторов ДСП.
* Автор, с которым следует вести переписку.
Экспериментальная часть
Известно, что фенолформальдегидные и карбамидные смолы используются при производстве ДСП и выступают в качестве связующих древесных частиц. Смолы могут химически взаимодействовать с активными группировками лигнинового и целлюлозного компонентов ДСП, тем самым влияя на их грибостойкость. В связи с этим представляло интерес исследовать не чистый препарат лигнина, а лигнин, подвергшийся химическому воздействию смол, входящих в состав ДСП (фенолформальдегидной или карбамидной).
Для получения веществ лигниновой природы использовали опилки древесно-стружечных плит на основе фенолформальдегидных и карбамидных смол ГОСТ 10632-89. Опилки просеивались через сито с диаметром пор 0,5 см и для дальнейшей работы использовались лишь те частицы, чей диаметр был больше. Далее проводили экстракцию опилок спирто-бензольной смесью по методу TAPPI [6]. Для получения модифицированного (сернокислотного) лигнина нами использовался метод Комарова с 72%-ной серной кислотой [6], а для получения немодифицированного лигнина - диоксановый метод [7].
Объектами исследования служили «дикие» грибы - истинные деструкторы ДСП, выделенные нами ранее с пораженных плит: Paecilomyces carneus, Stemphylium verruculosum, Aspergillus fumigatus. Для исследования влияния препаратов лигнина на рост грибов, микромицеты культивировались на твердой питательной среде Чапека-Докса (агар 20 г/л), голодной по сахарозе (БС), с добавлением в среду культивирования грибов веществ лигниновой природы в конечной концентрации (2%). Культивирование грибов осуществлялось в чашках Петри. Для заражения чашек приготавливали суспензию спор для каждого гриба (концентрация 1-2 млн/мл), суммарную суспензию получали путем смешивания споровых суспензий в равных объемах.
Для определения влияния растворов препаратов лигнина на активность лигнолитических ферментов грибы культивировали на жидкой питательной среде Чапека-Докса, обедненной по углероду, в колбах Эр-ленмейера объемом 300 мл, в течение 34 дней на качалках (180 об/мин). Вещества лигниновой природы вносили в среду культивирования грибов в конечной концентрации (2%). Определение активности перок-сидазы и фенолоксидазы проводили на фотоэлектрокалориметре модифицированным быстрым методом Бояркина, получившим широкое распространение при исследовании пероксидазной и фенолоксидазной активности у грибов [8, 9]. Активность определяли в условных единицах по окислению бензидина - для пероксидазы и по окислению парафенилендиамина - для фенолоксидазы. Определение проводили при желтом светофильтре (590 нм). Активность внеклеточной каталазы измеряли по методу Бергмайера, при длине волны 240 нм [10].
Обсуждение результатов
Ранее с пораженных ДСП было выделено в чистую культуру 412 изолятов микроскопических грибов, относящиеся к 27 видам. Наши предварительные исследования показали, что только 12 видов оказались истинными деструкторами ДСП, т.е. были способны использовать компоненты материала в качестве источника питания. Из них наибольшей активностью обладали: Paecilomyces carneus, Stemphylium verruculosum, Aspergillus fumigatus [11, 12].
Из древесно-стружечных плит на первом этапе работы были получены сернокислотный и диоксановый лигнин. Методы выделения лигнина из древесины можно разделить на две группы:
- методы, основанные на переводе углеводной части в раствор и получении лигнина в виде нерастворимого осадка (обработка концентрированными кислотами);
- методы, основанные на растворении лигнина с последующим осаждением его из полученного раствора (растворение в органических растворителях).
Нами при получении веществ лигниновой природы были использованы оба этих метода выделения лигнина из древесины, так как препараты лигнинов, выделенные различными методами, неидентичны и в большей или меньшей степени отличаются от природного.
Природный лигнин в подавляющей своей массе нерастворим в органических растворителях, и выделение его из стенок растительной ткани представляет сложную задачу. Лабильный природный лигнин претерпевает при выделении те или иные изменения. Однако химия лигнина еще не располагает методами, которые позволяли бы зафиксировать незначительные изменения природного лигнина, не затрагивающих его реакционную способность. Почти всем способам выделения лигнина присущи те или иные недостатки, связанные с изменением и загрязнением лигнина. При сернокислотном методе выделения изменения в
лигнине обусловлены реакциями конденсации, протекающими всегда при кислотном гидролизе, причем влияние этих реакций исключить нельзя. Диоксановый метод выделения не вызывает существенных изменений в лигнине, однако эти препараты не всегда свободны от неуглеводных примесей [7].
Все четыре препарата веществ лигниновой природы: сернокислотный лигнин из древесно-стружечных плит на основе фенолформальдегидных смол (СЛ из ФФДСП), сернокислотный лигнин из древесностружечных плит на основе карбамидных смол (СЛ из КДСП), диоксановый лигнин из древесностружечных плит на основе фенолформальдегидных смол (ДЛ из ФФДСП), диоксановый лигнин из древесно-стружечных плит на основе карбамидных смол (ДЛ из КДСП) исследовались на устойчивость к действию мицелиальных грибов (табл. 1, 2).
В качестве тест-организмов использовались штаммы трех видов грибов Paecilomyces carneus, Stemphylium verruculosum, Aspergillus fumigatus, известные, как истинные деструкторы ДСП.
Анализ результатов показывает (табл. 1), что не все полученные препараты лигнина подвержены биодеструкции микроскопическими грибами.
Так, диоксановый лигнин из древесно-стружечных плит на основе фенолформальдегидных смол (ДЛ из ФФДСП) не мог подвергнуться действию ни одного из тестируемых грибов, в то время как все остальные препараты лигнина активно использовались данными грибами в качестве единственного источника питания. В дальнейшем нами была проведена оценка действия препаратов лигнина на скорость роста грибов (табл. 2), которая оценивалась по величине D - диаметр колоний грибов на поверхности агаризованной среды Чапека-Докса.
Результаты этих исследований показали, что наибольшую скоростью роста, а значит и наибольшую способность к биодеструкции лигнина, продемонстрировал гриб Aspergillus fumigatus. В меньшей степени к биодеградации лигнина был способен гриб Stemphylium verruculosum, диаметр колоний на каждой из видов сред был существенно меньше. Наименьшей скоростью роста из трех тестируемых грибов обладал
Paecilomyces carneus.
Кроме того, максимальную скорость роста (значение диаметра колоний) все три исследуемых гриба имели на среде с сернокислотным лигнином из древесно-стружечных плит, наименьшую - с диоксановым лигнином из древесно-стружечных плит на основе фенолформальдегидных смол (ДЛ из ФФДСП). При этом скорость роста грибов последовательно убывала в ряду СЛ из КДСП > СЛ из ФФДСП > ДЛ из КДСП > ДЛ из ФФДСП. Видно, что лигнин, выделенный с ДСП на основе фенолформальдегидных смол метабо-лизируется в меньшей степени, чем лигнин из карбамидных ДСП. Полученные данные подтверждаются и более ранними результатами. Фенолформальдегидная смола из ранее проведенных исследований в меньшей степени подвержена воздействию грибов по сравнению с карбамидной. Так как в полученных препаратах веществ лигниновой природы присутствуют смолы, используемые при производстве ДСП в качестве связующих, то полученные данные хорошо коррелируют с результатами грибостойкости данных смол [12].
Таблица 1. Оценка возможности использования препаратов лигнина в качестве источников питания для грибов-деструкторов ДСП
Вид гриба Наличие роста грибов
СЛ из ФФДСП СЛ из КДСП ДЛ из ФФДСП ДЛ из КДСП
Paecilomyces carneus + + - +
Stemphylium verruculosum + + - +
Aspergillus fumigatus + + - +
Суммарная суспензия + + - +
+/— наличие/отсутствие роста грибов.
Таблица 2. Скорость роста колоний грибов-деструкторов ДСП (на 14 сутки)
Вид гриба Диаметр колонии гриба, мм
Контроль БС СЛ из ФФДСП СЛ из КДСП ДЛ из ФФДСП ДЛ из КДСП
Paecilomyces carneus 51,8 1,5 18,5 0 1
Stemphylium verruculosum 66,1 15 24 0 2,5
Aspergillus fumigatus 84,1 50 50 0 25
Выводы
Полученные нами результаты показывают, что лигнин подвержен деструкции под действием микроскопических грибов. Биостойкость препаратов лигнина из фенолформальдегидных плит больше, чем у лигнина из карбамидных плит. Кроме того, полученные данные подтверждают ранее высказанное предположение, что рост грибов и на фенолформальдегидных, и на карбамидных ДСП возможен за счет использования лигнинового компонента.
Список литературы
1. Баженов В.А., Карасев Е.И., Мерсов Е. Д. Технология и оборудование производства древесных плит и пластиков. М., 1992. 413 с.
2. Соломатов В.И., Ерофеев В.Т., Смирнов В.Ф., Семичева А.С., Морозов Е.А. Биологическое сопротивление материалов. Саранск, 2001. 195 с.
3. Соломатов В.И., Черкасов В. Д., Ерофеев В.Т. Строительные биотехнологии и биокомпозиты. М., 1998. 166 с.
4. Сарканен К.В., Людвиг К.Х. Лигнины (структура, свойства и реакции): Пер. с англ. М., 1975. 632 с.
5. Браунс Ф.Э., Браунс Д.А. Химия лигнина): Пер. с англ. М., 1964. 864 с.
6. Практические работы по химии древесины и целлюлозы / Под ред. В.М. Никитина. М., 1965. 365 с.
7. Богомолов Б. Д. Химия древесины и основы химии высокомолекулярных соединений. М., 1973. 400 с.
8. Бояркин А.Н. Быстрый метод определения активности пероксидазы (модифицированный) // Биохимия. 1951. Т. 16, вып. 4. С. 352-357.
9. Бояркин А.Н. Быстрый метод определения активности полифенолоксидазы (модифицированный) // Труды Института физиологии растений АН СССР. 1954. Т. 8. Вып. 2. С. 398-403.
10. Кураков А.В., Куплетская М.Б., Скрынникова Е.В., Сомова Н.Г. Поиск микромицетов - продуцентов внеклеточной каталазы и изучение условий ее синтеза // Прикладная биохимия и микробиология. 2001. Т. 37. №1. С. 67-72.
11. Клягина Ю.П., Забегалина Д.Г. Экологические и физиолого-биохимические аспекты разрушения древесностружечных плит микроскопическими грибами // Тезисы докладов IX нижегородской сессии молодых ученых. (Естественно-научные дисциплины). Н. Новгород, 2004. С. 269-271.
12. Клягина Ю.П., Смирнов В.Ф. Разрушение древесно-стружечных плит (ДСП) микроскопическими грибами // Актуальные вопросы строительства: Мат. междунар. науч.-техн. конф. 14-16 декабря 2004 г. Саранск, 2004. С. 338-342.
Поступило в редакцию 26 сентября 2005 г.
После переработки 9 ноября 2005 г.
