Биодеградируемый материал на основе гидроксиапатита для замещения костной ткани в эксперименте на животных Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

УДК 615.46.:616.71-001.52:57.082.2

Ключевые слова: биодеградируемый материал, дефект костной ткани, регенерация костной ткани

Key words: biodegradable material, bone defect, bone regeneration

Бочкарев В. В., Виденин В. Н., Дружинина Т. В., Трофимов К. В., Климентьев А. А., Попов В. П.

биодеградируемый МАТЕРИАЛ НА ОСНОВЕ ГИДРОКСИАПАТИТА ДЛЯ ЗАМЕЩЕНИЯ КОСТНОй ТКАНИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ НА ЖИВОТНЫХ

BIODEGRADABLE MATERIAL BASED ONHYDROXYAPATITE FOR REPLACEMENT OF BONE TISSUE IN EXPERIMENTAL ANIMALS

'ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины» Адрес: 196084, Россия, Санкт-Петербург, ул. Черниговская, 5 'Saint-Petersburg State Academy of Veterinary Medicine,

Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education Address: 196084, Russia, Saint-Petersburg, Chernigovskaya str., 5 2ФГБУЗ «Сибирский федеральный научно-клинический центр Федерального медико-биологического агентства», Медицинский центр № 2

Адрес: 636070, Россия, Томская обл., г. Северск, ул. Мира, 4 2Federal State Institution of Health "Siberian Federal Clinical Research Center of the Federal Medical and Biological Agency", Medical Center N 2 Address: 636070, Russia, Tomsk region, Seversk, Mira str., 4 3ФГБОУ ВО «Северо-Западный государственный медицинский университет им. И. И. Мечникова» Адрес: 191015, Россия, Санкт-Петербург, ул. Кирочная, 41 3I. I. Mechnikov North-West State Medical University, Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education Address: 191015, Russia, Saint-Petersburg, Kirochnaya str., 41 4ГБОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет» Адрес: 634021, Россия, г. Томск, ул. Каспийская, 87 4Siberian State Medical University, State Budget Educational Institution of Higher Professional Education Address: 634032, Russia, Tomsk, Kaspiyskaya str., 41

Бочкарёв Владислав Витальевич, аспирант1. Тел. +7 (911) 820-67-07. E-mail: [email protected]

Bochkarev Vladislav V., Postgraduate1. Tel. +7 (911) 820-67-07. E-mail: [email protected] Виденин Владимир Николаевич, д. в. н., проф. кафедры акушерства и оперативной хирургии1. Тел. +7 (911) 971- 27-87. E-mail: [email protected] Videnin Vladimir N., Doctor of Veterinary Medicine, Professor of the Dept. of Obstetrics and Operative Surgery1. Tel. +7 (911) 971- 27-87. E-mail: [email protected] Дружинина Татьяна Валентиновна, к. м. н., зав. клинико-диагностической лабораторией2. Тел. +7 (905) 260-69-78. E-mail: [email protected] Druzhinina Tatiana V., PhD in Medicine, Head of the Clinical Diagnostic Laboratory2. Tel. +7 (905) 260-69-78. E-mail: [email protected] Трофимов Константин Викторович, зав. кабинетом КТ2. Тел. +7 (913) 807-73-45. E-mail: [email protected] Trofimov Konstantin V., Head of the Computer Tomography Room2. Tel. +7 (913) 807-73-45. E-mail: [email protected] Климентьев Алексей Александрович, студент3. Тел. +7 (965) 080-84-58. E-mail: [email protected] Klimentyev AlexeyA., Student3. Tel. +7 (965) 080-84-58. E-mail: [email protected] Попов Владимир Петрович, к. м. н., ассистент кафедры травматологии,

ортопедии и ВПХ2. Тел. +7 (903) 915-57-63. E-mail: [email protected] Popov Vladimir P., PhD in Medicine, Assistant of the Dept. of Traumatology, Orthopedics and Field Surgery2. Tel. +7 (903) 915-57-63. E-mail: [email protected]

Аннотация. Материал для замещения костной ткани представляет собой смесь порошков фосфатов кальция и магния и раствор фосфопротеина. Регенеративные свойства материала оценили в экспериментах на крысах при имплантации в костные дефекты. По данным рентгеновской томографии использование биодеградируемого материала обеспечивало восстановление целостности кости. При анализе динамики регенерации было выявлено, что его использование приводит к более быстрому восстановлению костной ткани в зоне дефекта по сравнению с группой контроля.

Summary. The material for the substitution of bone tissue is a mixture ofpowders of calcium phosphate and magnesium phosphate and phosphoprotein solution. Regenerative material properties have been evaluated in experiments in rats by implantation into bone defects. According to X-ray tomography the use of biodegradable material provides restoration of the bone integrity. By analyzing the dynamics of regeneration it has been found that the use of the mentioned material leads to a more rapid recovery of the bone tissue in the defect area, compared with the control group.

Введение

Благодаря достижениям в хирургической практике и быстрому старению населения, существует постоянно растущий спрос на костные трансплантаты. Современные трансплантаты должны не только заменить утраченные кости, но также должны обладать высокой остеоиндуктивностью, выступая в качестве подложки для направленного роста костей [1, 2]. Материалы для замещения костной ткани на основе гидроксиапати-та используются в стоматологии, ортопедии и хирургии уже на протяжении более 30 лет ввиду их химического сходства с кальцинированными тканями млекопитающих и, следовательно, превосходной биосовместимостью [1, 3]. В связи с быстрым развитием нанотехнологии, потенциальные возможности наноразмерных и нанокристаллических фосфатов кальция привлекли значительное внимание благодаря тому, что они демонстрируют положительные результаты при восстановлении дефектов кости.

Таким образом, разработка новых костнопластических материалов преследует две основные цели: оптимизация регенерации костной ткани и восстановление костных дефектов [3, 4]. В лечении поврежденной костной ткани в настоящее время развивается ряд методологий, из числа которых одной из наиболее актуальных является использование костных цементов, в частности цементов на основе фосфорнокислого кальция как заполняющего и скрепляющего материала [5].

Этим материалом заполняют пустоты и отверстия разной природы в живой кости, после чего они представляют организму

строительный материал и матрицу для реге-нирирующейся костной ткани.

Цель исследования - оценка результатов применения биодеградируемого материала на основе гидроксиапатита для замещения дефекта костной ткани в эксперименте на животных.

Материалы и методы

Все процедуры по уходу и работе с животными выполняли в соответствии с протоколами, утвержденными Комитетом по уходу и использованию животных, согласно руководству Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, приказ № 755 от 12.08.1977 г. и декларации Всемирной медицинской организации (Хельсинки, 2000 г.). В ходе проведения эксперимента было прооперировано 30 крыс породы Wistar, все животные были разделены на группы исследования, что представлено в таблице 1.

Дефект кости выполнялся по следующей методике: в проекции диафиза бедренной кости в передне-заднем направлении выполнялось сквозное отверстие диаметром 2 мм. Затем в сформированное отверстие закладывался биодеградируемый материал на основе гидроксиапатита для заполнения дефекта.

Во все сроки наблюдения у животных осуществлялся отбор крови из хвостовой вены, в сроки 2, 4 и 8 недель по 5 животных из каждой группы выводились ингаляционной передозировкой эфира. Путем экзартикуля-ции по суставам производилось извлечение бедренных костей с окружающими мягкими тканями, мягкие ткани удалялись (рис. 2)

Таблица 1.

Группы исследования крыс в зависимости от сроков наблюдения

Сроки наблюдения Группы наблюдения —■—____ 1 неделя 2 недели 4 недели 8 недель

биодеградируемый материал 5 крыс 5 крыс 5 крыс

контроль 5 крыс 5 крыс 5 крыс

и кость помещалась в 10 % нейтральный раствор формалина.

В целях выявления системных реакций организма на биодеградируемый материал во все сроки наблюдения было проведено исследование показателей периферической крови.

Определение биохимических показателей и формулы крови. Определение уровней общего белка, аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (АСТ), а также креатинина на автоматическом биохимическом анализаторе проточного типа "Verno" (производства Electa Lab., Италия). Щелочную фосфатазу определяли на биохимическом анализаторе "Sapphire 350" (Audit Diagnostics, Ирландия).

Формула крови была подсчитана на лабораторном микроскопе "Nikon Eclipse 50i" (Nikon Instruments, USA) после окрашивания мазков крови по стандартной методике гематоксилин-эозином. Кровь отбиралась у животных прижизненно из хвостовой вены.

Для выяснения локального действия материала выполнялись рентгенологические исследования области интереса в сроки 2, 4, 8 недель после операции. Исследования проводились на 64-срезовом мультиспираль-ном компьютерном томографе (модель Light Speed VCT) компании General Electric (GE)). Параметры сканирования: 120 кВ, 80 мА, толщина реконструкции 0,6 мм. Полученные серии изображений обрабатывались на рабочей станции экспертного класса с многопрофильным просмотром изображений AW VolumShare 4 по 3D (three-dimensional) и VR (virtual reality) протоколам. Количественная оценка проводилась по индексу костной мозоли (ИКМ) по шкале Хаунсфилда. С этой целью проводили динамические измерения денситометрических показателей интерме-диарной зоны регенерированной ткани и интактного кортикального слоя с помощью спиральной компьютерной томографии, ИКМ вычисляли по формуле:

ИКМ= ИР (HU) / KC (HU) х 100,

где ИР - плотность интермедиарной зоны регенерированной ткани в единицах Хаунс-филда, HU;

КС - плотность интактного кортикального слоя прилежащего отдела кости в единицах Хаунсфилда, HU.

Оценка полученных результатов проводилась с помощью методов вариационной статистики с использованием пакетов стандартных статистических программ Microsoft Excel XP, а также с помощью программы Statistica for Windows Version 6.0 (StatSoft Inc., США). Определялось среднее значение (Х), статистическая девиация (SD), значение вероятности (р). Для анализа имеющихся выборок данных использовали гипотезу нормальности распределения (критерий Колмогорова-Смирнова). Для оценки достоверности различий выборок, не подчиняющихся критерию нормального распределения, применяли непараметрический критерий Манна - Уитни (U-тест). Различия двух сравниваемых величин считали статистически значимым, если вероятность их тождества составляла менее 5 % (p < 0,05).

Результаты и обсуждение

В послеоперационном периоде и у экспериментальных животных, и в группе контроля в течение первых двух суток отмечался отек прооперированной зоны. Затем в период до 1 недели указанные явления уменьшались, через 4 недели наступало полное восстановление.

При анализе динамики показателей лейкоцитарной формулы периферической крови у крыс были выявлены изменения, приведенные в таблице 2.

Явления умеренного воспаления сопровождаются изменениями в лейкоцитарной формуле, а именно: увеличением уровня лейкоцитов, смещением лейкоцитарной формулы в сторону увеличения содержания сегментоядерных нейтрофилов и моноцитов. Все явления воспаления уменьшаются в течение 2 недель. Через 2 недели после введения материала содержание нейтрофилов не отличалось от физиологической нормы. Также были выявлены изменения в лейкоцитарной формуле, свидетельствующие о наличии легкой аллергической реакции в ранние сроки наблюдения при применении материала для заполнения дефекта по срав-

Примечание: * - статистически значимые различия согласно и-критерию Манна - Уитни с соответствующим показателем до операции; * - р < 0,05.

Таблица 3.

Среднестатистические значения биохимических показателей крови у крыс до и после операции через 1, 2, 4, 8 недель, Х±SD, п = 30

Таблица 2.

Среднестатистические значения гематологических показателей крови у крыс до и после операции через 1, 2, 4, 8 недель, Х±SD, п = 30

^^^^ Сроки Показатели ^^^^ До операции Материал на основе ГА Контроль

1 неделя 2 недели 4 недели 8 недель 1 неделя 2 недели 4 недели 8 недель

Лейкоциты 109/л 4,4 ±0,3 7,1 ±0,5* 4,95 ±0,5* 4,6 ±0,6 4,5 ±0,5 6,9 ±0,4* 5,65 ±0,6* 5,03 ±0,5 4,6 ±0,4

Лимфоциты 109/л 6,43 ±0,4 3,7 ±0,7 4,0 ±0,8 5,75 ±0,6 6,4 ±0,5 4,04 ±0,5 4,65 ±0,7 5,74 ±0,5 6,52 ±0,4

C/я нейтрофилы 109/л 2,8 ±0,3 5,98 ±0,1* 3,4 ±0,2 2,9 ±0,15 2,9 ±0,2 4,82 ±0,2* 4,0 ±0,2* 3,6 ±0,2 2,9 ±0,3

Эозинофилы 109/л 0,2 ±0,01 2,84 ±0,07 2,05 ±0,04 0,8 ±0,03 0,15 ±0,03 2,02 ±0,05 1,05 ±0,12 0,52 ±0,01 0,3 ±0,06

Моноциты 109/л 0,15 ±0,02 6,25 ±0,02 3,26 ±0,01 1,08 ±0,02 0,1 ±0,01 2,1 ±0,01 1,3 ±0,02 0,2 ±0,01 0

^^^^ Сроки Показатели ^^^^ До операции Материал на основе ГА Контроль

1 неделя 2 недели 4 недели 8 недель 1 неделя 2 недели 4 недели 8 недель

Общий белок, г/л 86,7 ±1,8 80,6 ±1,8 83,0 ±1,9 85,2 ±1,5 86,6 ±1,8 83,3 ±1,5 85,4 ±1,6 85,8 ±1,8 86,5 ±1,7

Щелочная фосфатаза, Ед/л 70,0 ±1,2 92,4 ±1,7 91,2 ±1,5* 85,4 ±1,6* 71,5 ±1,3 75,6 ±1,4 72,8 ±1,6 72,2 ±1,5 71,8 ±1,4

Билирубин общий, мкмоль/л 3,6 ±0,4 3,4 ±0,3 3,2 ±0,2 3,5 ±0,2 3,5 ±0,16 3,4 ±0,2 3,4 ±0,15 3,5 ±0,2 3,53 ±0,3

Креатинин, мкмоль/л 105,3 ±6,5 101,6 ±8,5 104,8 ±8,0 106,3 ±7,8 105,8 ±7,1 103,7 ±8,3 104,4 ±7,5 105,1 ±7,0 106,3 ±6,8

АЛТ, нмоль/л 72,7 ±5,5 75,6 ±5,5 74,5 ±6,0 73,9 ±5,7 73,0 ±5,2 74,2 ±5,4 75,3 ±6,0 74,1 ±5,8 73,2 ±5,8

АСТ, нмоль/л 101,0 ±8,4 96,6 ±8,5 98,2 ±7,5 100,1 ±8,0 99,5 ±8,2 97,9 ±7,7 99,2 ±8,3 103,9 ±9,5 101,6 ±8,0

Примечание: * - статистически значимые различия согласно и-критерию Манна - Уитни с соответствующим показателем до операции; * - р < 0,05.

нению с группой контроля. Такая реакция постепенно затухала в динамике наблюдения и полностью исчезала через 2 недели после операции.

Восстановительный послеоперационный период у животных протекал удовлетворительно, без проявлений локальных и системных осложнений, что подтверждается исследованием уровней биохимических показателей в сыворотке крови животных.

Уровни содержания общего белка, АЛТ, АСТ, а также креатинина оставались в пределах физиологической нормы во все сроки наблюдения.

Данные биохимического исследования представлены в таблице 3.

Как видно из таблицы 3, в группе с применением материала для заполнения костного дефекта в послеоперационном наблюдении отмечается рост содержания в сыворотке

крови щелочной фосфатазы, и, т. к. ко второй неделе наблюдения явления воспаления полностью исчезали, увеличение уровня щелочной фосфатазы, вероятно, отражает активацию остеобластов и, следовательно, процессов регенерации костной ткани.

При анализе изменений содержания макроэлементов в сыворотке крови крыс получены данные, свидетельствующие об увеличении содержания кальция и фосфора в крови уже через 2 недели наблюдения и наиболее выраженные через месяц после операции при применении материала для замещения костной ткани. Это дает основания предположить, что при деградации в организме материал насыщает кальцием организм не только локально, но и системно. В группе контроля, напротив, содержание кальция в крови уменьшалось в процессе послеоперационного наблюдения (табл. 4).

Насыщение кальцием организма имеет огромное значение для процесса репарации костной ткани. Известно, что концентрация кальция оказывает огромное влияние на такие процессы, как пролиферация и дифференциация клеток, адгезия клеток на матрик-се. Кроме того, кальций и фосфор являются основными макроэлементами в минеральной составляющей костной ткани и, следовательно, их достаточное количество необходимо для её построения [5, 6].

Данные рентгеновского исследования также подтверждают более активные процессы репаративной регенерации костной ткани в случае применения материала для заполне-

ния костного дефекта по сравнению с группой контроля. В ходе эксперимента были исследованы оперированные кости в каждой группе из 5 животных в заданные сроки после операции. При денситометрическом анализе мультипланарных томограмм получены абсолютные значения плотности в области дефекта. Результаты исследования представлены на рис. 1 и в таблице 5.

Начиная со второй недели более высокий индекс регенерации костной ткани у крыс наблюдался при заполнении дефекта исследуемым материалом по сравнению с группой контроля.

Процесс образования костной мозоли связан с процессом кальцификации и регенерации костной ткани [3, 5, 7]. Данные процессы более выражены у животных опытной группы, с применением для заполнения дефекта костной ткани исследуемого материала на основе гидроксиапатита, так как его введение создает условия для регенерации костной ткани в области оперативного вмешательства. При применении материала удается достичь его плотного прилегания к сохраненной костной ткани за счет высокой пластичности, и таким образом обеспечивается высокая интеграция костной ткани с им-плантатом с последующим восстановлением целостности кости.

Кроме того, благодаря своему составу при деградации материал способствует увеличению депо кальция в организме, необходимого для адекватной репарации костной ткани. При этом эффект материала начинается уже в первые дни после операции (табл. 4).

Таблица 4.

Среднестатистические значения содержания макроэлементов в периферической крови крыс в различные сроки наблюдения после замещения дефекта бедренной кости биодеградируемым материалом, Х±SD, п = 30

Показатели крови До Материал на основе ГА Контроль

опера- через через через через через через через через

ции 1 нед. 2 нед. 4 нед. 8 нед. 1 нед. 2 нед. 4 нед. 8 нед.

общий кальций 4,2 4,85 6,82 5,88 4,54 4,0 3,81 4,9 3,65

(мМ/л) ±0,8 ±0,4 ±0,3* ±0,17* ±0,16 ±0,5 ±0,11 ±0,18* ±0,15

неорганич. фосфор 5,3 4,73 5,18 4,94 4,2 4,47 4,54 4,22 4,5

(мМ/л) ±1,2 ±0,6 ±0,85* ±0,8* ±0,2 ±0,4 ±0,3 ±0,6 ±05

Примечание: * - статистически значимые различия согласно и-критерию Манна - Уитни с соответствующим показателем до операции; * - р < 0,05.

Срок регенерации

2 неделя

4 неделя

8 неделя

эксперимент

контроль

Рис. 1. Рентгенограммы костей прооперированных животных.

Таблица 5.

Данные рентгеновского исследования образцов бедренной кости в эксперименте и группе контроля в разные сроки наблюдения, Х±SD, п = 30

Материал Сроки наблюдения Плотность интермедиарной зоны регенерированной ткани в единицах Хаунсфилда Плотность интактного кортикального слоя в единицах Хаунсфилда Индекс регенерации

эксперимент 2 недели 481,8±9,5 1066,5±19,2 45,2±0,7

4 недели 599,8±12,2* 1195,1±21,8* 50,2±0,9**

8 недель 912,2±10,6 1589,4±22,5 57,4±0,5*

контроль 2 недели 241,3±9,5 768,2±19,9 31,4±0,7

4 недели 392,5±11,6 998,4±20,6 39,3±0,4

8 недель 464,8±11,5 1016,3±15,9 45,7±0,5

Примечание: *,** - статистически значимые различия согласно и-критерию Манна - Уитни с соответствующим показателем до операции; * - р < 0,05; ** - р < 0,01.

Заключение

Биодеградируемый материал на основе ги-дроксиапатита для замещения костной ткани является перспективным материалом в качестве костного имплантата, способствующего восстановлению костной ткани. Использование материала для замещения костной ткани приводит к более быстрому восстановлению ткани в зоне дефекта по сравнению с группой контроля.

Список литературы

1. Биосовместимые материалы: учебное пособие [Текст] / под ред. В. И. Севастьянова и М. П. Кирпич-никова. - М. : МИА, 2011. - 544 с.

2. Лекишвили, М. В. Новые биопластические материалы в реконструктивной хирургии [Текст] / М. В. Лекишвили, А. Ф. Панасюк // Вестник РАМН. -2008. - № 9. - С. 33-36.

3. Astrand, J. Reduction of instability-induced bone resorption using bisphosphonates: high doses are needed in rats [Текст] / J. Astrand, R. Aspenberg //Acta Orthop. Scand. - 2002. - Vol. 73. - P. 24-30.

4. Moisenovich, M. M. Tissue regeneration in vivo within recombinant spidroin 1 scaffolds [Текст] / M. M. Moisenovich, O. Pustovalova, J. Shackelford, T. V. Vasiljiva, T. V Druzhinina, Y. A. Kamenchuk,

V V. Gizeev, O. S. Sokolova, V. G. Bogush,

V G. Debabov, M. P. Kirpichnikov, I. I. Agapov // Biomaterials. - 2012. - May, 33 (15) : 3887-98.

5. Dickson, G. Orthopaedic tissue engineering and bone regeneration [Текст] / G. Dickson, F. Buchanan, D. Marsh // Technol Health Care. - 2007. - N 15(1).1. - P. 57-67.

6. Hall, T. J. Reapraisal of the effect of extracellular calcium on osteoblastic bone resorbtion [Текст] / T. J. Hall // Biochem. Biophys. Res. Common. - 1994. -V. 202. - P. 456-462.

7. Li, Y. Calcium phosphate biomaterials: from osteoconduction to osteoinduction [Текст] / Y. Li, H. Yuan, X. Zhang // 24th Annual Meeting of the Society for Biomaterials, April 22-26. - San Diego, USA, 1998. - P. 428-428.

АППАРАТ ДЛЯ ИМПУЛЬСНОЙ ЭЛЕКТРОМАГНИТНОЙ ТЕРАПИИ «УМИ-05»

На протяжении многих лет клиника БНПЦ ЧИН и Институт Ветеринарной Биологии (Санкт-Петербург) используют в своей практике уникальный прибор - генератор низкочастотного магнитного импульсного излучения большой мощности «УМИ-05» (ранее «УИМТ-2», «УИМТ-3»). Данный прибор применяется для моно-или комплексной терапии целого ряда заболеваний, которые ранее считались неизлечимыми или очень тяжело поддавались лечению.

Основные направления применения «УМИ-05»

• Заболевания мочевой системы: мочекаменная болезнь, пиелонефрит, поликистоз, цистит.

• Желчекаменная болезнь.

• Заболевания опорно-двигательного аппарата: остеохондроз позвоночника, дископатия, артрозо-артриты, бурсит, растяжение связок, ушибы, контрактуры суставов, миозит.

• Купирование эпилептических приступов и эпилептического статуса.

• Гипертензия.

• Отит гнойный.

• Отит аллергический.

Стандартный курс лечения

• 10 сеансов по 30-50 импульсов на одну патологическую область. Мощность 50-80 %. Курс можно повторить с перерывом в 10 дней.

• Профилактический курс для животных группы риска (остеохондроз, МКБ и пр.) -7-10 сеансов с интервалом 6 месяцев.

• Применение прибора не вступает в противоречие с использованием фармакологических и хирургических методов лечения.

• Магнитотерапию не следует проводить на области тела, содержащей металлоконструкции (например, штифты или пластины для остеосинтеза).

Экономика

• Быстрая окупаемость прибора.

• Минимальная затрата рабочего времени: длительность одного сеанса на одну патологическую зону - 2-3 минуты.

• Высокая эффективность лечения, полное излечение или введение животного в стойкую ремиссию по всем перечисленным заболеваниям гарантируют значительное увеличение рейтинга клиники в целом и приток новых клиентов.

Стоимость прибора 23 000 руб.

Заказать УМИ-05 можно по тел./факсу: (812) 927-55-92; по e-mail: [email protected]. Подробности на сайте: www.invetbio.spb.ru