CC BY
19
< ^T
LÜ
Чем дальше эксперимент
от теории, тем ближе он к Нобелевской премии.
Фредерик Жолио-Кюри
Бикарбонатный буфер с куркумином
против спазмирования вазоаутотрансплантатов
УДК 57.085.2/608.2/616-092.4/616.13-089/616.14-089
Резюме. Проведена оценка физиологической устойчивости артериальных и венозных сегментов сосудов к вазоспазму in vitro. Протестирован оригинальный состав неаэрированного консервирующего раствора, представляющий собой бикарбонатный буфер, содержащий инкапсулированный в поливинилпирролидоне флавоноид природного происхождения - куркумин. Показано, что данный раствор обладает ярко выраженными антиспазматическими свойствами, превосходя по своей эффективности существующие аналоги, применяемые в сосудистой хирургии. Полученные результаты дают основание использовать его в качестве перспективной альтернативы для профилактики и снятия спазма кровеносных сосудов.
Ключевые слова: кровеносные сосуды, трансплантация, вазоспазм, атеросклероз, эндотелий, куркумин.
Среди заболеваний сердечно-сосудистой системы основное место занимает ишемическая болезнь сердца (ИБС) -патологическое состояние с абсолютным или относительным нарушением кровоснабжения миокарда вследствие поражения коронарных артерий. Его лечение симптоматично и зависит от клинической формы. Опасность для жизни представляет внезапное изменение характера течения заболевания, сопровождающееся нестабильностью клинического статуса пациента. В таких случаях традиционная антиангинальная терапия нередко оказывается неэффективной и состояние больного требует оперативных вмешательств.
В 1960 г. американским хирургом Р.Х. Гётцем в клиническую практику было внедрено аортокоронарное шунтирование (АКШ) - операция, при которой кровоснабжение миокарда улучшают путем соединения коронарных сосудов ниже места их поражения с аортой при помощи шунта. В качестве такового часто используют аутотрансплантаты: графты из внутренней грудной артерии (a. mammaria interna), лучевой артерии (a. radialis) и большой подкожной вены ноги человека (v. saphena magna). Однако в раннем послеоперационном периоде одним из основных осложнений является окклюзия шунтов, возникающая в первую очередь за счет их спазмирования. Так, спазм анастомоза из лучевой артерии считается главной причиной раннего закрытия шунтов [1]. Это связывают с повреждениями, которые претерпевает сосуд при извлечении, хранении, транспортировке.
Задачу по защите органов и тканей, в том числе профилактике вазоспазма, современная трансплантология возлагает на консервирующие растворы, ориентированные на комплексное сохранение структурно-функциональной целостности трансплантата. Поскольку основная причина вазоспазма - повреждение и нарушение эндотелия сосудистых имплантатов в ходе
подготовительных мероприятии, использовать такие растворы начинают уже непосредственно с момента изъятия биологического материала у донора и до пересадки в организм реципиента. Жизнеспособность трансплантата при этом напрямую зависит от качеств консервирующей гомогенной системы и/или от применяемых кар-диоваскулярных средств.
Защитное действие популярного в мировой клинической практике кардиоплегического раствора «Кустодиол» основано на торможении окислительных и активационных процессов нервно-мышечного и секреторного типов в мембранных структурах. Подбор компонентов для повышения эффективности буферных смесей, используемых при профилактике спазма сосудистого графта, достаточно сложен. С этой целью применяют различные вазодилататоры: ингибиторы фосфодиэстеразы, включая папаверин, блокаторы кальциевых каналов, сочетания препаратов «верапамил и нитроглицерин», «вера-памил и папаверин» и др. Однако существующие фармсубстанции полностью не решают данной проблемы. Кроме того, известно, что препараты одних групп или их комбинации более действенны в интраоперационный период, а другие - в постоперационный.
К тому же сами сосуды, предназначенные для анастомозирования, имеют свои особенности: морфологические отличия в диаметрах и строении стенок артерий и вен, различия в биохимической активности эндотелия, составе рецепторов, склонности к спазмированию среди артериальных трансплантатов [2, 3]. Так, венозный шунт, помещенный в артериальное русло, сначала поэтапно подвергается гиперплазии интимы, а затем - тромботическим и атероскле-ротическим изменениям. Несмотря на то что гиперплазия интимы редко способствует развитию серьезного стенозирования венозных трансплантатов, она зачастую провоцирует поздние стенозы и окклюзии, возникающие на фоне прогрессирующих атероматозных отклонений.
Эффективность вазотрансплантатов во многом предопределена процедурами их подготовки и хранения до момента имплантации, поэтому в последнее время активизировались поиски препаратов универсального действия, предотвращающих спазмирование и нарушение функции эндотелия различных шунтов. Установлено, что повреждение структуры эндотелия вследствие вазоспазма и тромбоза в дальнейшем может привести к атеросклеротиче-скому поражению имплантата [4]. В этой связи
перспективным представляется создание буфера для подготовки шунта с использованием соединений, обладающих не только антиспазматическими, но и эндотелиопротекторными свойствами. Ранее было показано [5], что за счет добавления нанокуркумина модифицированный неаэрированный бикарбонатный буфер (БКБ) Кребса - Хенселейта примерно на 88% защищает эндотелий изолированной грудной аорты крыс-самцов линии Wistar.
Целью нашей работы стало исследование возможностей раствора для сохранения эндотелия и предотвращения спазма сосудистых трансплантатов человека. При этом использовались кольцевые сегменты лучевой и внутренней грудной артерий, большой подкожной вены бедра пациентов с ИБС. Забор артериальных и венозных графтов проводился в РНПЦ «Кардиология» в ходе подготовки операций по аортокоронар-ному шунтированию. Изъятые сегменты сосудов помещались в стерильные, биоинертные и герметичные контейнеры, наполненные раствором кустодиола, при температурном режиме 5-8 °С. Время от момента забора биологического материала до начала эксперимента составляло не более 1 часа.
В опытах применялся неаэрированный раствор, содержащий нанокуркумин (1,5 мкМ), инкапсулированный (для повышения водо-растворимости) в поливинилпирролидоне (Fluka, Германия) - «БКБ + нанокуркумин» [5]. Контрольной средой являлся модифицированный неаэрированный БКБ Кребса - Хенселейта следующего состава: NaCl - 118,5 мМ, KCl - 4,7 мМ, СаС12-2,5 мМ, MgS04-1,2 мМ, KH2PÜ4-1,2 мМ, NaHCO3-25 мМ, глюкоза - 11 мМ (рН 7,4) [6].
Устойчивость кровеносных сосудов к спаз-мированию оценивалась на основании изучения показателей их сократимости после повторного введения одного из вазоконстрикторов: 10-5М норадреналина (NE), хлорида калия (KCl) в концентрации 75 мМ. Подготовку образцов и регистрацию сосудистых реакций на действие вазоактивных веществ осуществляли по методике [7] с некоторыми модификациями [8]. Вазоконстрикция сосудов измерялась на многоканальной установке Multi Myograph DMT 610P (Дания). Изменения в напряжении сегмента сосуда фиксировались автоматически при помощи компьютерной программы. Все сегменты были растянуты в течение 1 часа при напряжении покоя ~30 mN. Те из них, которые расслаблялись менее чем на 50%, исключались из дальнейших экспериментов.
234,7
229,5
Рис. 1. Влияние повторного введения (через 30 минут) норадреналина (10-5 М) и хлорида калия (75 мМ) в контрольной и экспериментальной («БКБ + нанокуркумин») группах на изометрическое напряжение, развиваемое изолированными сегментами большой подкожной вены бедра человека
5,8
В камеру миографа с целью устранения расслабляющего эффекта норадреналина к БКБ добавляли раствор ß-адреноблокатора «Тимолол» (РУП «Белмедпрепараты») до его концентрации в ячейке 1 цМ. Инкубация сосудов проводилась в течение 10 минут, после чего в камеру добавлялся констриктор (первое введение). При выходе показателей на плато регистрировалось изометрическое напряжение сегментов сосудов, которое определялось как исходное, принимаемое за 100%.
В контрольных исследованиях после введения вазоконстриктора сосуды продолжали оставаться в БКБ-растворе 30 минут. В экспериментальной группе сосуды после первого введения констриктора помещались в состав «БКБ + нано-куркумин» на это же время. По его истечении констриктор добавлялся повторно в растворы к сосудам контрольной и экспериментальной выборок. Тестовое изометрическое напряжение сегментов сосудов регистрировалось при выходе показателей на плато после добавления вазокон-стриктора. На момент измерения повторного сокращения сосудов обеих групп в ячейке миографа всегда находился БКБ-раствор.
Для сравнения использовались данные изометрического сокращения изолированных кровеносных сосудов, вызванного первым и вторым введением вазоконстриктора. Критерием оценки антиспазматической эффективности исследуемых растворов являлись показатели вазокон-стрикции, индуцированные норадреналином и хлоридом калия. Полученные результаты статистически обрабатывались в Microsoft Excel 2010.
Известно, что имплантированные графты сосудов со временем начинают терять свои свойства, претерпевая ряд структурно-функциональных изменений. Самый высокий риск послеоперационных осложнений, возникающих вследствие тромбоза, гиперплазии интимы и атероматоза, отмечается при использовании венозных
шунтов [9]. В 1996 г. Г. Фитцгиббон и соавторы показали, что уже через месяц после операции были окклюзированы 10% таких имплан-татов, через год - 17%, а через 5 лет - 26%. В раннем послеоперационном периоде в большинстве случаев нарушение функции шунта вызвано тромбозом в результате повреждения сосудистой стенки и слущивания эндотелия. Атеросклеротические изменения отмечаются через 3 месяца после имплантации в артериальную циркуляцию и определяются на данном этапе только микроскопически. Спустя год они фиксируются ангиографически в 20% венозных шунтов, к 5 годам - в 40%, а к 10 годам эти изменения приводят к значительному сужению или окклюзии более чем 70% имплантатов [10].
Учитывая особенности использования венозных сосудов в аортокоронарном шунтировании, представляется целесообразным установить, какое влияние на их структурно-функциональные характеристики оказывает тестируемый раствор. При исследовании тонуса большой подкожной вены бедра человека обнаружено, что при повторной стимуляции сосудов NE 10-5М и KCl 75 мМ в контрольной группе (раствор «БКБ») происходит увеличение силы сокращения сегментов v. saphena magna на 134,7 и 129,5% соответственно. В экспериментальной группе, наоборот, наблюдается снижение изометрического напряжения (на 87,1% - для NE 10-5М и на 94,2% - для KCl 75 мМ). Это свидетельствует об уменьшении гомогенной системой «БКБ + нанокуркумин» физиологического ответа сосудов на вазоконстрикторы как рецеп-торного (норадреналин), так и нерецептор-ного (хлорид калия) действий (рис. 1). Исходя из полученных данных, можно полагать, что тестируемый раствор будет пригодным для предотвращения развития спазма венозного шунта.
В настоящее время при выполнении операций АКШ кардиохирурги в качестве импланта-тов предпочитают использовать не венозные, а артериальные сосуды, поскольку они в меньшей степени подвержены атеросклерозу [11]. Один из таких трансплантатов - a. mammaria interna, или внутренняя грудная артерия (ВГА). Преимущества левой ВГА перед венозными шунтами впервые описаны в 1981 г. шведским кардиохирургом В. Бьорком и соавторами, которые установили, что годичная проходимость внутренней грудной артерии составляет 97%, а венозных шунтов - 72%. В 1987 г. исследователь Б. Литл с коллегами опубликовали отдаленные результаты АКШ у больных с ИБС.
Как оказалось, проходимость ВГА выше проходимости v. saphena magna в сроки как до 5, так и до 12 лет после операции.
Основным фактором, предотвращающим развитие гиперплазии интимы в ВГА, считается отсутствие фенестраций (разрывов) в компактной внутренней эластической мембране этой артерии. Согласно работам профессора Г. Анжелини и соавторов, именно данное обстоятельство определяет длительную проходимость трансплантатов из ВГА - лучшего на сегодня материала для реваскуляризации миокарда. Однако артериальные шунты, в отличие от венозных, в гораздо большей степени подвержены спазмированию [12]. В связи с этим целесообразно выяснить, насколько эффективен состав «БКБ + нанокуркумин» в отношении артериальных сосудов человека, находящихся в искусственно вызванном состоянии гипертонуса.
Как следует из рис. 2, наблюдается различная физиологическая реакция сегментов внутренней грудной артерии человека - в зависимости от выбранного тестируемого раствора. Повторное добавление вазоконстрикторов в контрольной группе («БКБ») вызывало спазм сосудов, что сопровождалось увеличением изометрического напряжения на 74,8% после воздействия NE 10-5М и на 117% - после внесения KCl 75 мМ. В экспериментальной группе («БКБ + + нанокуркумин») при повторном введении NE 10-5М и KCl 75 мМ изометрическое напряжение сосудов уменьшилось на 92,2 и 78,2% соответственно. Данные указывают на высокую способность буфера с нанокуркумином предотвращать спазмы ВГА за счет снижения физиологического ответа сосудов, опосредованного рецепторными (NE) и нерецепторными (KCl) механизмами.
Второй по частоте использования артериальный графт для реваскуляризации миокарда - лучевая артерия (ЛА) - до недавнего времени не рассматривался как потенциальный вазотрансплантат ввиду нередких окклю-зий, связанных с вазоспазмом и гиперплазией интимы [13]. Однако с усовершенствованием метода подготовки (иссечение ЛА вместе с окружающими венами и тканями, бесконтактная техника, отказ от механического бужирова-ния металлическими зондами для предупреждения повреждения эндотелия, проведение антиспастической терапии) появились сообщения о реальных перспективах его применения [14].
По последним данным, средняя состоятельность шунтов лучевой артерии в течение 6
Контроль
7,8
«БКБ + нанокуркумин»
21,8
месяцев после операции составляет 98,1%, количество идеально функционирующих импланта-тов - 90,8%. Их преимуществами стали особенности физиологических, анатомических, гемоди-намических и других характеристик: структура стенки, сопоставимый с коронарными артериями диаметр просвета, достаточная длина, устойчивость к давлению и превосходное заживление ран на предплечье по сравнению с ранами на нижних конечностях, слабая подверженность атеросклерозу. Тем не менее шунты ЛА очень чувствительны к хирургической травме, гипотонии и предрасположены к ранней дисфункции в случаях использования а-адренергических препаратов [15]. Известно, что ЛА, в отличие от артерий эластического типа (как, например, ВГА), характеризуется повышенной контрак-тильностью на различные раздражители, реализующейся не только через а-адренорецепторы и рецепторы к тромбоксану, но также посредством активации RhoA и Ва-чувствительных KIR-рецепторов.
Представляет интерес исследование влияния системы «БКБ + нанокуркумин» на лучевую артерию. Согласно полученным данным (рис. 3) выявлено: в контрольной группе изометрическое напряжение сегментов ЛА увеличилось при повторном введении 10-5М NE на 117,7%, 75 мМ KCl - на 163,4%, что подтверждает сведения о высокой спазмированности ее участков [1]; в экспериментальной, напротив, уменьшилось на 90,3 и 84,8% соответственно. Следовательно, раствор «БКБ + нанокуркумин» проявляет высокую спазмолитическую активность в отношении и артериальных сосудов.
В целом, согласно опытам, наблюдалась закономерная реакция разных сосудов человека на повторное введение норадреналина и хлористого калия. В контрольной группе отмечалась сильная их спазмированность, выражавшаяся в повышенной вазоконстрикции на NE и KCl,
Рис. 2.
Изометрическое напряжение сегментов внутренней грудной артерии человека в контрольной и экспериментальной («БКБ + нанокуркумин») группах
при добавлении 10-5М норадре-налина и 75 мМ хлорида калия
Рис. 3. 250
Изометрическое
напряжение 200
сегментов лучевой
артерии человека
в контрольной s 150
и эксперимен- s рт
тальной («БКБ + и н 100
нанокуркумин») * О
группах лз cû
при добавлении 50
норадреналина
(10-5) и хлорида 0
калия (75 мМ)
Контроль
263,4
217,7
--
И
1-1
IkciI
9 7 «БКБ + нанокуркумин» 15,2
а в экспериментальной - значительное (80-90%) снижение функционального ответа лучевой, внутренней грудной артерий и большой подкожной вены бедра на констрикторные агенты и предотвращение вазоспазма. Значит, можно полагать, что разработанная гомогенная система «БКБ + нанокуркумин», используемая для временного хранения вазотрансплантатов и обеспечения их нормального метаболизма, станет эффективным средством предупреждения
спазма как венозных, так и артериальных шунтов в постоперационном периоде.
Таким образом, неаэрированный консервирующий буферный раствор «БКБ + нано-куркумин» способен предотвращать развитие вазоспазма, превосходя по своей эффективности аналоги, используемые в медицинской практике. Поскольку он отличается от контрольного только дополнительным наличием нанокурку-мина в концентрации 1,5 мкМ, то именно эту форму куркумина можно связать с проявленной в отношении исследованных сосудов человека (a. mammaria interna, a. radialis, v. saphena magna) антиспазматической активностью буфера. Такая активность компонентов раствора обнаружена впервые. Разработанный состав перспективен для применения в сосудистой хирургии как потенциальное средство защиты вазотрансплан-тата при замене коронарных сосудов. СИ
Статья поступила в редакцию 05.12.2016 г.
http://innosfera.by/2017/07/curcumin
The physiological constancy of the arterial (a. mammaria interna, a. radialis) and venous (y. saphena magna) grafts to vasospasm in vitro was evaluated. The original composition of the non-aerated preservative solution, which is a bicarbonate buffer containing naturally occurring flavonoid curcumin encapsulated in polyvinylpyrrolidone at concentrations of 1.5 pmol was tested. It is shown that the solution, in addition to their endotelioprotective properties, has a strongly pronounced antispasmodic activity in respect of investigated human vessels, and excels any other existing analogues used in vascular surgery in effectiveness.
Андрей Жив,
научный сотрудник Международного государственного экологического института им. А.Д. Сахарова БГУ; az.starlight@yandex.by
Клавдия Буланова,
доцент кафедры биохимии и биофизики Международного государственного экологического института им. А.Д. Сахарова БГУ, кандидат биологических наук, доцент; bulanova_home@tut.by
Валерий Шилов,
начальник отдела питания
НПЦ НАН Беларуси по продовольствию,
кандидат биологических наук; valery.shilov@gmail.com
Леонид Лобанок,
профессор кафедры нормальной физиологии БГМУ, член-корреспондент
Виктор Афонин,
заведующий лабораторией фармакогенетики Института биоорганической химии НАН Беларуси, кандидат биологических наук; bioresearch@iboch.bas-net.by
Геннадий Жавнерко,
заведующий отделом химии поверхностей и нанотехнологий ООО «Изовак Технологии», кандидат химических наук; zhavnerko@izovac.com
ЛИТЕРАТУРА
1. Total myocardial revascularization with arterial conduits: radial artery combined with internal thoracic arteries / Е. Weinschelbaum [et a l.] // The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 1997. Vol. 114. P. 911-916.
2. Human internal mammary artery produced more prostacyclin than saphenous vein / A. Chaikhoune [et al.] // The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 1986. Vol. 92. P. 88-91.
3. Белов Ю.В. Реконструктивная хирургия при ишемической болезни сердца: дис. ... д-ра мед. наук. М., 1987.
4. Endothelial cell injury in cardiovascular surgery / E. Verrier [et al.] // The Annals of Thoracic Surgery. 1996. Vol. 62, N3. P. 915-922.
5. Инновационный консервирующий раствор для сосудистой хирургии / А.Ю. Жив [и др.] // Наука и инновации. 2015, №11. С. 68-72.
6. БГМУ: 90 лет в авангарде медицинской науки и практики: сб. науч. тр. / Белорус. гос. мед. ун-т; редкол.: А.В. Сикорский [и др.].- Минск, 2011. Т. 1. С. 153.
7. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine / R. Furchgott [et al.] // Nature. 1980. Vol. 288. P. 373-376.
8. Techniques to study the pharmacodynamics of isolated large and small blood vessels / J. Angus [et al.] // Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 2000. Vol. 44. P. 395-407.
9. Coronary bypass graft fate: long-term angiographic of Cardiology. 1991. Vol. 17. P. 1075-1080.
10. Comparison of late changes in internal mammary ; patients 10 years after operation / C. Grondin [et al.
11. Effect of coronary artery bypass graft surgery on su rv
udy / G. Fitzgibbon [et al.] // Journal of the American College
ery and saphenous vein grafts in two consecutive series of / Circulation. 1984. Vol. 70, №3. Pt 2. P. I208-12. ival: overview of 10-year results from randomized trials by the Coronary Artery Bypass Graft Surgery Trialists Collaboration / S. Yusuf [et al.] // The Lancet. 1994. Vol. 344, №8922. P. 563-570.
12. Vasoreactivity of the radial artery. Comparison w implications for coronary artery surgery / A. Carpen
the internal mammary and gastroepiploic arteries with r [et al.] // Circulation. 1993. Vol. 88, №5. Pt 2. P. II115 —2 7.
13. Overview of the nature of vasoconstriction in arterial grafts for coronary operations / G. He [et al.] // The Annals of thoracic surgery. 1995. Vol. 59, №3. P. 676-683.
14. Coronary revascularization with the radial artery: new interest for an old conduit / A. Califore [et al.] // Journal of cardiac surgery. 1995. Vol. 10, №2. P. 140-146.
15. Excellent long-term clinical outcome after coronary artery bypass surgery using three pedicled arterial grafts in patients with three-vessel disease / N. Veeger [et al.] // The Annals of thoracic surgery. 2008. Vol. 85, №2. P. 508-512.
