CC BY
129
2010
Известия ТИНРО
Том 161
УДК 668.393.5
Е.Л. Конева, Н.М. Аминина, Е.В. Якуш*
Тихоокеанский научно-исследовательский рыбохозяйственный центр, 690091, г. Владивосток, пер. Шевченко, 4
БИФИДОГЕННЫЕ СВОЙСТВА ПРОДУКТОВ ПЕРЕРАБОТКИ
БУРЫХ ВОДОРОСЛЕЙ
Установлена пребиотическая активность биогеля из бурых водорослей в отношении Bifidobacterium bifidum. Показано, что бифидобактерии могут использовать альгинат натрия в качестве единственного источника углерода и энергии.
Ключевые слова: биогель из бурых водорослей, альгинат натрия, пребио-тики, пробиотики, бифидогенная активность.
Koneva E.L., Aminina N.M., Yakush E.V. Bifidogenic properties of kelp products // Izv. TINRO. — 2010. — Vol. 161. — P. 303-308.
Prebiotics activity toward Bifidobacterium bifidum is determined for biogel from kelps. In the biogel, sodium alginate is defined as a sole source of carbon and energy for the bifidobacteria.
Key words: biogel, kelp, sodium alginate, prebiotic, probiotic, bifidogenic activity.
Введение
Пребиотики являются уникальным инструментом для создания кисломолочных пробиотических продуктов с регулируемым количественным составом бифи-добактерий. По мнению большинства исследователей (Dubep, Mistre, 1996; Шен-деров, 2001; Goderska et al., 2008; Macfarlane et а1, 2008), пребиотическими свойствами обладает довольно широкий спектр веществ: олигосахариды (галак-то-, фрукто-, изомальтоолигосахариды), полисахариды, сахарные спирты, биологически активные иммунные белки (лактоглобулин, гликопептиды), отдельные витамины и их производные (пантотеновая кислота, в-каротин).
Потребность промышленности в пребиотиках натурального происхождения для производства пробиотических продуктов, содержащих высокий титр бифидо-бактерий, полностью не удовлетворена. Новым направлением является получение пробиотических продуктов питания с использованием сырья морского происхождения. Ранее было показано (Akiyma et al., 1992), что деполимеризованные альгинаты (олигосахариды альгината натрия) могут применяться в качестве субстрата для роста бифидобактерий, а также выяснено (Wаng et al., 2006), что олигосахариды альгината натрия стимулируют рост Bi-fidobacterium bifidum и B. longum как in vivo, так и in vitro более значительно, чем фруктоолигосахари-
* Конева Елена Леонидовна, кандидат технических наук, научный сотрудник, e-mail: [email protected]; Аминина Наталья Михайловна, кандидат биологических наук, заведующая лабораторией, е-mail: [email protected]; Якуш Евгений Валентинович, кандидат химических наук, заместитель генерального директора, е-mail: [email protected].
ды. Более того, под их действием наблюдается снижение численности энтеро-бактерий и энтерококков в желудочно-кишечном тракте человека. Таким же действием in vivo обладает и продукт переработки бурых водорослей, содержащий альгинат натрия (Аминина, 2006). Получены данные (Аминина и др., 2006), что биогель из бурых водорослей, содержащий альгинат натрия, активизирует развитие бифидобактерий в процессе молочнокислого брожения. В то же время в литературе не встречаются сведения о способности бифидобактерий расщеплять высокомолекулярные альгинаты.
Целью настоящей работы являлось исследование бифидогенных свойств биогеля из бурых водорослей, а также альгината натрия в условиях in vitro.
Материалы и методы
В качестве объектов исследований использовали культуру B. bifidum, полученную из коллекции микроорганизмов Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (г. Москва); биогель из бурых водорослей, соответствующий требованиям ТУ 9284-175-00472012-2007; альгинат натрия, полученный из ламинарии японской (Laminaria japónica Aresch.), соответствующий ТУ 15-54483. Молекулярная масса альгината натрия — 85,7 кДа, вязкость 1 %-ного раствора альгината натрия — 4,1 0Э.
Количество жизнеспособных клеток бифидобактерий определяли методом предельных разведений на среде Блаурокка. Наиболее вероятную численность клеток в единице объема рассчитывали по таблице Мак-Креди (Руководство ..., 1983). Морфологию клеток исследовали после окраски по Граму в мазках с помощью оптического микроскопа МБИ-15.
С целью регенерации питательную среду перед инокулированием кипятили 10 мин, затем охлаждали до температуры культивирования. Культивирование проводили при температуре (38 ± 1) 0С в течение 24-72 ч.
Бифидогенные свойства биогеля и альгината натрия оценивали по росту пробиотической культуры бифидобактерий B. bifidum in vitro в среде Блаурокка или изотоническом 0,9 %-ном растворе хлорида натрия, содержащих указанные субстраты. Для предупреждения оседания бифидобактерий в физиологический раствор добавляли "голодный агар" в концентрации 0,05 %.
Результаты и их обсуждение
С целью установления бифидогенных свойств биогеля исследовали его влияние на рост бифидобактерий in vitro. Для этого определяли динамику численности В. bifidum на полужидкой среде Блаурокка, включающей 5, 10 и 20 % биогеля. Контролем служила питательная среда Блаурокка без биогеля, которая является общепринятой для культивирования бифидобактерий.
Результаты исследований показали, что увеличение концентрации биогеля "Ламиналь" способствует увеличению численности бифидобактерий (рис. 1), причем зависимость носит нелинейный характер. Максимальный прирост бифидобактерий наблюдали при концентрации биогеля 10 %. Дальнейшее увеличение его концентрации до 20 % не способствовало возрастанию численности бифидобактерий. К концу срока наблюдения численность микроорганизмов в присутствии 10 и 20 % биогеля "Ламиналь" была в 10 раз выше, чем при его 5-ной % концентрации, и в 100 раз больше, чем в контроле.
Как известно, важнейшим фактором, определяющим скорость размножения бактерий, является присутствие в среде в достаточной мере основных компонентов питания (Тамбиев, Кирикова, 1981; Bezkorovainy, Miller-Catchpole, 1989). Для бифидобактерий это в первую очередь углеводы — как источник углерода (Bezkorovainy, Miller-Catchpole, 1989; Biavati, Matarelli, 2006).
304
(N
Концентрация Ламиналя, %
Рис. 1. Влияние концентрации биогеля на рост В. bifidum (N — кл./мл) Fig. 1. Effect of the biogel concentration on the growth of Bifidobacterium bifidum - cel./ml)
Ср. Бл. + биогель 20%
Помимо компонента питания на интенсивность репродукции бактерии оказывают влияние и биологически активные вещества (стимуляторы роста) (Си-ренко, Козицкая, 1988). Известно, что стимулирующее деИствие компонентов питания на размножение бактериИ снижается при уменьшении концентрации этих веществ, тогда как стимуляторы роста оказывают влияние на рост бактериИ при их разведении вплоть до 10-11 (Дьяков, 2000). Таким образом, усиление биологического эффекта при разведении указывает на деИствие стимулятора роста. Обратная ситуация или отсутствие подобного эффекта свидетельствуют о влиянии исследуемого вещества на рост бактериИ как компонента питания.
В нашем случае возрастание концентрации биогеля свыше 10 % не приводит к увеличению численности В. bifidum. Следовательно, можно сделать вывод, что активизация процесса размножения бифидобактериИ в присутствии биогеля обусловлена деИствием компонента питания.
Известно, что одним из основных компонентов питания бифидобактериИ являются углеводы (моно-, олиго- и полисахариды) (Bezkorovainy, МШег-Са1:Лро1е, 1989; Goderska е1 а1., 2008). Бифидобактерии активно сбраживают сахарозу, глюкозу, фруктозу, лактозу и др. (Scardovi, 1986). Благодаря наличию специфических ферментов бифидобактерии способны усваивать и полисахариды: амилозу, амилопектин, полигалактуронаны, гуммиарабик — и использовать их в качестве углеродного и энергетического источника своИственным только им способом, называемым "бифидус путь" (Scardovi, Trovatelli, 1965; Salyers е1 а1., 1978; РаИтатап е1 а1., 2003).
Биогель из бурых водорослеИ содержит в основном высокомолекулярныИ полисахарид — альгинат натрия (не менее 35 %), а также в незначительных количествах клетчатку, белок, маннит и другие минорные компоненты (Подко-рытова, 1991). Поскольку основным составляющим компонентом биогеля является альгинат натрия, мы предположили, что бифидобактерии могут использовать его в качестве источника питания. Чтобы проверить это, бифидобактерии выращивали на физиологическом растворе с добавлением "голодного агара" в
концентрации 0,05 %, содержащего в качестве единственного источника углерода альгинат натрия (0,5 %).
Исследования показали, что В. bifidum способны размножаться на указанном субстрате и использовать его как источник питания. Это подтверждается снижением концентрации альгиновой кислоты в процессе культивирования микроорганизмов в среде Блаурокка и на физиологическом растворе с добавлением альгината натрия (рис. 2).
72
(___
о
68
1-о 64
с
и
S ¡£ 60
>5
О ш 56
о
X 52
s
>_
л
Ц л 48
о
5 I 44
<0
*
о. 40
<и
ч
о о 36
32
К S X я ш о К S X ге m
а s а s 1л Ц к о а. s ш S 1-J к
s X га о s X (В о
£ о t=L с о а. s
а s &
са s 1- а 5 1л
1 с >1 ь
со о (В <0 о га Т
t CN
Ср.Блаурокка+Альгинат
Физ.раствор+Альгинат
Рис. 2. Изменение содержания альгиновой кислоты в средах, содержащих альгинат натрия, в процессе культивирования
Fig. 2. Change of alginic acid contents in the media containing sodium alginate during the process of bifidobacteria cultivation
По мере роста культуры В. bifidum содержание альгиновой кислоты в среде Блаурокка уменьшается в 1,3 раза, а в полужидком голодном агаре — в 2,0 раза. Более интенсивное потребление альгината натрия бактериями при культивировании на физиологическом растворе объясняется отсутствием в данной системе каких-либо питательных компонентов помимо альгината натрия.
Еще одним доказательством того, что альгинат натрия утилизируется бифи-добактериями, является установленный факт роста В. bifidum на среде, содержащей физиологический раствор с добавлением 0,5 % альгината натрия (рис. 3). Однако значительно меньший размер колоний бифидобактерий, выращенных на физиологическом растворе, содержащем альгинат натрия, по сравнению со средой Блаурокка свидетельствует о том, что альгинат натрия в чистом виде не является сбалансированным питательным субстратом для бифидобактерий.
Более благоприятным питательным субстратом для бифидобактерий, чем альгинат натрия, является биогель (рис. 4). Как видно, через 24 ч культивирования количество бифидобактерий в среде с добавлением альгината натрия составило 1013 кл./мл. Это на порядок выше, чем в контроле (среда Блаурокка). За этот же период времени на среде Блаурокка с добавлением биогеля концентрация В. bifidum достигала 1014 кл./мл. Следовательно, биогель является более благоприятным питательным субстратом для бифидобактерий по сравнению с альгинатом натрия. Можно предположить, что это связано с присутствием в биогеле других компонентов (клетчатки, макро- и микроэлементов), стимулирующих размножение бифидобактерий (Bezkorovainy, Miller-Catchpole, 1989).
306
Рис. 3. Культура В. bifidum на разных средах: 1 — среда Блаурокка; 2 — физиологический раствор с добавлением 0,5 % альгината натрия. 24 ч культивирования
Fig. 3. Culture of В. bifidum on different media after 24 h of cultivation: 1 — Blaurock medium; 2 — normal saline solution with the addition of 0.5 % sodium alginate
Рис. 4. Динамика численности B. bifidum на разных средах: 1 — среда Блаурокка; 2 — среда Блаурокка + альгинат натрия; 3 — среда Блаурокка + биогель (N — кл./мл)
Fig. 4. Population dynamics of B. bifidum on different media: 1 — Blaurocka medium; 2 — Blaurock medium + sodium alginate; 3 — Blaurock medium + biogel (N — cel./ ml)
Заключение
Таким образом, биогель из бурых водорослей стимулирует рост бифидобак-терий in vitro и, следовательно, является бифидогенным фактором. Полученные результаты позволяют сделать вывод, что биогель может применяться как основной компонент питания в биотехнологии пробиотиков.
Список литературы
Аминина Н.М. Лечебно-профилактический продукт "Ламиналь — биогель из морских водорослей" : науч-практ. пособие. — Владивосток : ТИНРО-центр, 2006. — 34 с.
Аминина Н.М., Половинкина Е.С., Якуш Е.В. Пробиотические продукты на основе "Ламиналя" — биогеля морской капусты // Молоч. пром-сть. — 2006. — № 5. — С. 70-71.
Дьяков Ю.Т. Введение в альгологию и микологию : учеб. пособие. — М. : МГУ, 2000. — 192 с.
Подкорытова А.В. Биологически активные вещества морских водорослей Дальневосточных морей // Всесоюз. совещ. "БАВ гидробионтов — новые лекарственные, лечебно-профилактические и технологические препараты" : тез. докл. — Владивосток : ТИНРО, 1991. — С. 106.
Руководство к практическим занятиям по микробиологии / под ред. Н.С. Егорова. — М. : МГУ, 1983. — 215 с.
Сиренко Л.А., Козицкая В.И. Биологически активные вещества водорослей и качество воды : монография. — Киев : Наук. думка, 1988. — 256 с.
Тамбиев А.Х., Кирикова Н.Н. Выделение органического вещества у морских водорослей // Успехи совр. биол. — 1981. — Т. 92, вып. 1, № 4. — С. 100-114.
ТУ 15-544-83 Альгинат натрия пищевой.
ТУ 9284-175-00472012-2007 Биогель "Ламиналь".
Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. Пробиотики и функциональное питание. — М. : Грантъ, 2001. — Т. 3. — 288 с.
Akiyama H., Endo T., Nakakita R. et al. Effect of depolymerized alginates on the growth of bifidobacteria // Biosci. Biotechnol. Biochem. — 1992. — Vol. 56. — P. 355-356.
Bezkorovainy A., Miller-Catchpole R. Biochemistry and physiology of Вifidobacte-ria. — Boca-Raton, FL : CRC Press, 1989. — 213 р.
Biаvati B., Matarelli P. The family Bifidobacteriaceae // The prokaryotes. — N.Y., 2006. — Vol. 3. — P. 322-359.
Dubep U.K., Mistre V.V. Effect of bifidogenic factors on growth characteristics of Bifidobacteria in infant formulas // J. Dairy Sci. — 1996. — № 79. — Р. 1156-1163.
Goderska K., Nowak J., Czarnecki Z. Comparison of the growth of Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium bifidum species in media supplement with selected saccharides including prebiotics // Acta. Sci. Pol., Technol. Aliment. — 2008. — Vol. 7, № 2. — Р. 5-20.
Macfarlane G.T., Steed H., Macfarlane. S. Bacterial metabolism and health-related effects of galacto-oligosaccharides and other prebiotics // J. of Applied Microbiology. — 2008. — № 104. — Р. 305-344.
Palframan R.J., Gibson G.R., Rastall R.A. Carbohydrate preferences of Bifidobacterium species isolated from the human gut // Curr. Issues Intest. Microbiol. — 2003. — № 4. — Р. 71-75.
Salyers A.A., Palmer J.K., Wilkins T.D. Degradation of polysaccharides by intestinal bacterial enzymes // Am. J. Clin. Nutr. — 1978. — № 31. — Р. S128.
Scardovi V. Genus Bifidobacterium Orla-Jensen 1924, 472AL // Bergey's Manual of systemic Bacteriology, 1th ed. Baltimore : Williams and Wilkins, 1986. — Vol. 2. — Р. 1418-1434.
Scardovi V., Trovatelli L.D. The fructose-6-phosphateshuntas peculiar pattern of hexoce degradation in the genus Bifidobacterium // Ann. Microbiol. Enzimol. — 1965. — № 15. — Р. 19-29.
Wang Y., Han F., Hu B. et al. In vivo prebiotic properties of alginate oligosaccha-rides prepared through enzymatic hydrolysis of alginate // Nutrition research. — 2006. — Vol. 26, iss. 11. — P. 597-603.
Поступила в редакцию 2.03.10 г.
