CC BY
8ВЕТЕРИНАРНЫЕ НАУКИ
Gryazneva Tatiana Nicolaevna
doctor of biological sciences, professor of the department of microbiology, FGBEU IN MGAVM&B - MVA named after K.I.Skryabin
Shlionskiy Vadim Yurievich graduate student of the department of microbiology FGBEU IN MGAVM&B - MVA named after K.I.Skryabin Shlionskaya Alevtina Anatolievna graduate student of the department of microbiology FGBEU IN MGAVM&B - MVA named after K.I.Skryabin
THE SAFETY OF PHOTOSENSITIZERS AS A PREVENTIVE DRUG FOR INDUSTRIAL POULTRY FARMING
Грязнева Татьяна Николаевна
доктор биологических наук, профессор кафедры микробиологии, ФГБОУВО МГАВМиБ - МВА им.К.И.Скрябина Шлёнский Вадим Юрьевич аспирант кафедры микробиологии, ФГБОУ ВО МГАВМиБ - МВА им.К.И. Скрябина Шлёнская Алевтина Анатолиевна аспирант кафедры микробиологии, ФГБОУ ВО МГАВМиБ - МВА им.К.И. Скрябина
БЕЗОПАСНОСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРОВ В КАЧЕСТВЕ ПРОФИЛАКТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА ДЛЯ ПРОМЫШЛЕННОГО ПТИЦЕВОДСТВА
DOI: 10.31618/ESSA.2782-1994.2021.1.71.80
Annotation. The aim of the work was to determine the safety of the use of photosensitizers as a preventive drug for industrial animals.
In the theoretical part, the definition of photosensitizers was given with a description of the reactions in which they enter into biological systems, the purpose of the work and the tasks were formulated.
In the practical part, the effectiveness of the Photoditazine photosensitizer was determined in order to maintain the well-being of the livestock of industrial birds and to obtain high-quality and safe poultry products. In vivo experiments were conducted to determine the effectiveness of photosensitizers as a preventive drug for production animals. Studies were also conducted to determine the safety of products obtained from experimental animals by feeding their meat to laboratory rats with further determination of their pancreatic elastase concentration by ELISA. For the experiments, non-linear white female rats were selected as the most adequate test object for rapid analysis of the safety of raw materials obtained after the use of photosensitizers.
Аннотация. Целью работы было определить эффективность применения фотосенсибилизаторов в качестве профилактического препарата для промышленных животных. В теоретической части было дано определение фотосенсибилизаторов с описанием реакций, в которые они вступают в биологических системах, была сформулирована цель работы и задачи. В практической части была определена эффективность фотосенсибилизатора «Фотодитазина» в целях поддержания благополучия поголовья промышленных птиц и получения качественной и безопасной продукции птицеводства. Были проведены опыты in vivo с целью определение эффективности применения фотосенсибилизаторов в качестве профилактического препарата для производственных животных. Так же были проведены исследования по определению безопасности продукции, полученной от подопытных животных, путем скармливания их мяса лабораторным крысам с дальнейшим определением у них концентрации панкреатической эластазы методом ИФА. Для экспериментов были выбраны нелинейные белые самки крысы, как наиболее адекватный тест-объект для экспресс-анализа безопасности сырья, получаемого после применения фотосенсибилизаторов.
Key words: photosensitizers, industrial poultry farming, product safety, microbiological assessment, prevention.
Ключевые слова: фотосенсибилизаторы, промышленное птицеводство, безопасность продукции, микробиологическая оценка, профилактика.
Введение. фотодинамической терапии (ФДТ). Данный метод
В настоящее время в ветеринарной хирургии основан на взаимодействии с мембраной клеток для лечения онкологий используют метод молекул фотосенсибилизаторов [10].
ив
ЕШШ
Фотосенсибилизаторы - это вещества, способные передавать энергию света другим веществам, тем самым запуская цепочку физическо-химических процессов, из которых наибольший интерес представляют те реакции, которые приводят к образованию свободных радикалов и активных форм кислорода. К примеру, возбужденный сенсибилизатор может отделить атом водорода от молекулы белка. Белковая молекула превращается в радикал, и начинается цепочка окислительных реакций. Сама молекула фотосенсибилизатора в процессе реакции не изменяется, она передает кислороду водород, отделенный от белковой молекулы, и возвращается в исходное состояние, готовая поглотить очередную порцию света. Что касается кислорода, то он в результате превращается в очень активный анион-радикал, супероксид. Если триплетная молекула сенсибилизатора напрямую сталкивается с молекулой кислорода, то кислород отбирает у сенсибилизатора энергию и сам переходит в возбужденное состояние. Кислород в синглетном возбужденном состоянии, как и супероксид, чрезвычайно активен: обе эти высокоактивные частицы очень подвижны и являются универсальными окислителями [2].
Согласно данным из статьи Бондаренко В.М., Коновалова Г.Н., Николаева Е.В. и соавторов «Эффект фотодинамического воздействия металлокомплексов производных хлорина Е6 на условно-патогенные бактерии с использованием сверхъярких светодиодов холодного белого света», опубликованной в 2008 году,
фотосенсибилизаторы могут обладать
бактерицидными свойствами [1].
На основании свойств фотосенсибилизаторов реагировать с белками и образовывать высокоактивные окислители были сделаны предположения о возможности использования фотосенсибилизаторов, как бактерицидных препаратов, и были проведены исследования по выявлению антимикробной активности фотосенсибилизаторов на примере
фотосенсибилизатора второго поколения на основе хлоринов - «Фотодитазина».
Целью нашей работы являлось определение эффективности фотосенсибилизаторов при пероральном введении их растворов в фармацевтических дозах промышленным животным в качестве профилактического препарата. Кроме того, была поставлена цель выявить отсутствие неспецифической токсичности у мяса животных, получавших
фотосенсибилизаторы.
Для этого были поставлены следующие задачи:
1) Измерить суточные приросты массы тела цыплят - бройлеров с 9 суток жизни и до убоя на 30-ые сутки жизни в четырех подопытных группах:
- в группе, получавшей активированный «Фотодитазин»;
- в группе, получавшей неактивированный «Фотодитазин»;
- в группе, получавшей антибиотик широкого спектра действия;
- в контрольной группе.
2) Определить общую микробную обсемененность тушек цыплят из подопытных групп методом подсчета КМАФАнМ;
3) Выявить является ли продукция, полученная от подопытных животных, получавших фотосенсибилизатор, безопасной путем мониторинга состояния лабораторных самок крыс, которым скармливалось мясо от цыплят бройлеров из первой подопытной группы;
4) Сравнить полученные результаты и сделать выводы об эффективности применения фотосенсибилизаторов, как бактерицидных препаратов и предложить наиболее эффективные методики их применения.
Материалы и методы.
Исследовательская работа выполнялась на кафедре микробиологии ФГБОУ ВО МГАВМиБ-МВА имени К.И. Скрябина. Материалом для исследования служил испытуемый препарат «Фотодитазин»- диметилглюкаминовая соль хлорина Е6, фотосенсибилизатор второго поколения, это водорастворимые производные хлорофилла, предложенные к использованию для медицинских целей. Данный препарат обладает способностью поглощать свет в видимой области, результатом чего является его фотоактивация и последующая релаксация возбужденного состояния с переносом энергии на растворенный в тканях молекулярный кислород и органические субстраты. После введения препарат попадает в печень, а затем в кровь, после чего он перераспределяется в органы и ткани животных. «Фотодитазин» был активирован лазером мощностью 0,8 Вт с длиной волны 662 нм.
Исследовательская работа проводилась в соответствии со следующей нормативной документацией:
- ГОСТ Р ИСО 20776-1-2010 «Клинические лабораторные исследования и диагностические тест-системы in vitro» [3];
- ГОСТ Р 50396.0-92 «Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты птичьи. Методы отбора проб и подготовка к микробиологическим исследованиям» [4];
- ГОСТ ИСО/МЭК 17025:2009 (ISO/IEC 17025:2005) «Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий» [6];
- ГОСТ 10444.15-94 «Продукты пищевые. Методы определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов» [7];
- СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов» [11].
Для данных опытов использовались цыплята - бройлеры 9-суточного возраста в количестве 12 особей. Для определения
10 EastEuropean Scientific Journal #7(71), 2021 эффективности применения «Фотодитазина» в качестве профилактического препарата для домашней птицы, он выпаивался подопытным цыплятам аналогично методике, предусмотренной для выпаивания птице антибиотиков в профилактических целях в предписанной фармакологической дозировке 0,2 мл препарата на 1 кг массы тела. Исследования проводились на 4 группах, по 3 цыпленка в каждой:
- 1-я группа получала каждый день раствор антибиотика широкого спектра действия «Фурацилин»; - 2-я группа получала каждый день раствор активированного фотосенсибилизатора «Фотодитазин»;
- 3-я группа получала каждый день раствор неактивированного фотосенсибилизатора «Фотодитазин»;
- 4-я группа использовалась для контроля.
Откорм всех вышеперечисленных цыплят
проводился в течение 21 суток с ежедневным взвешиванием для определения среднесуточных приростов массы, после чего был проведен убой для получения проб мяса для дальнейших исследований.
Для определения общей микробной обсемененности тушек цыплят из подопытных групп методом подсчета КМАФАнМ были приготовлены серийные десятикратные разведения из взвеси, полученной из мяса исследуемых тушек. Перед посевом каждую пробу освобождали от видимой соединительной и жировой ткани, погружали в спирт и обжигали поверхность. Затем ножницами из глубины каждого образца вырезали кусочки размером 2,5x1,5x2,5 см, взвешивали и помещали в стерильную ступку и добавляли физиологический раствор. Ножницами измельчали до получения кашицеобразной массы, в которой исследуемый материал находился в соотношении к общему количеству 1 x10-1. Полученную взвесь отстаивали не менее 10 минут, затем готовили ряд десятикратных разведений [5].
Для этого в пробирку с 9 см3 стерильного физиологического раствора было внесено 1см3 взвеси. После перемешивания получено разведение 1x10-2. Из полученного разведения после переноса 1 см3 в следующую пробирку с физиологическим раствором получается разведение 1x10-3 и т.д. Для каждого разведения бралась отдельная стерильная пипетка. Из второго, третьего и четвертого десятикратного разведения было внесено по 1см3 содержимого в стерильные чашки Петри, после чего в них были залиты 12-15 см3 расплавленного и охлажденного до 45°С - 46°С МПА. Путем осторожного вращения чашек по поверхности стола содержимое было смешано. После застывания агара чашки Петри были перевернуты
вверх дном и помещены в термостат на 24 часа при температуре 37°С [8].
По истечении трех суток при температуре 37°С подсчитывали число выросших колоний в глубине и на поверхности агара с помощью прибора для подсчета колоний, перевернув чашку вверх дном. Результаты учитывали только на тех чашках, где выросло от 10 до 300 колоний. Число выросших колоний умножали на соответствующее разведение, чтобы определить величину КМАФАнМ в 1 г продукта [7].
В качестве контроля в термостат при 37оС на 3 суток были помещены 2 пробирки с используемым физиологическим раствором и 2 чашки с используемым МПА для подтверждения отсутствия в них сопутствующей микрофлоры [9].
Для определения влияния на организм продукции, обработанной фотосенсибилизатором, мясо цыплят-бройлеров из первой подопытной группы скармливалось группе из 6 лабораторных крыс. Также была сформирована вторая такая же группа, как контрольная, получавшая обычный корм. По истечении 14 суток был отобран помет самок крысы из подопытных групп для исследования на содержание панкреатической эластазы методом ИФА [3,6].
Сущность данного метода заключается в твердофазном ферментном иммуносорбентном анализе, основанным на технике двойного сэндвича с применением двух поликлональных антител, распознающих несколько разных эпитопов видо- и органоспецифичных последовательностей
пептидов панкреатической эластазы мышей, ИФА микроплашки покрыты антителами,
направленными против панкреатической эластазы. Они связываются с панкреатической эластазой, присутствующей в образце или в стандартах, соответственно. На следующем этапе вторичные антитела, меченные биотином, прикрепляются к иммобилизированной панкреатической эластазе. Для визуализации связавшейся панкреатической эластазы, биотин связывается на следующем этапе с меченной стрептавидином, пероксидазой хрена. Затем пероксидаза ферментативно окисляет внесенный субстрат TMB
(3,3 ',5,5'тетраметилбензидин). Реакцию
останавливают, добавляя 0.25 моль/л H2SO4. Развитие окрашивания (количество окисленного TMB) можно определить фотометрически при 450 нм и на основании интенсивности окрашивания оптическая плотность образца переводится в концентрацию панкреатической эластазы в мкг/г
[3].
Результаты и обсуждение.
Ежесуточное взвешивание каждого цыпленка-бройлера из каждой опытной группы на лабораторных весах представлены в таблице 1:
Таблица 1
Результаты ежесуточного взвешивания цыплят из подопытных групп_
Время откорма, начатого с 9-го суточного возраста Цыплята, получавшие активированный Фотодитазин Цыплята, получавшие неактивированный Фотодитазин Цыплята, получавшие антибиотик Цыплята, выращиваемые с обычным кормлении
400 500 450 450
1 сутки 400 500 450 450
350 450 500 450
450 550 450 450
2 сутки 500 550 450 450
400 550 500 450
500 600 500 500
3 сутки 500 600 500 475
450 550 500 475
550 650 550 500
4 сутки 600 620 550 480
500 570 550 480
700 700 600 520
5 сутки 800 680 600 520
550 630 550 500
800 780 650 560
6 сутки 900 750 700 560
650 700 600 540
850 800 680 600
7 сутки 1050 850 730 600
750 750 620 580
1000 900 710 640
8 сутки 1200 900 760 630
850 820 650 610
1100 1000 800 700
9 сутки 1300 900 850 660
950 850 700 650
1200 1050 850 730
10 сутки 1350 950 900 700
1050 950 750 700
1300 1100 900 760
11 сутки 1400 1020 930 740
1150 1030 800 735
1400 1200 950 800
12 сутки 1500 1100 980 780
1250 1100 850 780
1500 1250 1000 840
13 сутки 1600 1200 1020 820
1350 1150 900 810
1600 1250 1050 870
14 сутки 1700 1300 1070 850
1450 1200 940 850
1700 1350 1100 900
15 сутки 1800 1400 1110 900
1550 1300 980 885
1800 1450 1150 940
16 сутки 1900 1480 1160 935
1650 1360 1040 920
1900 1550 1200 970
17 сутки 2000 1520 1200 970
1750 1400 1080 960
2000 1650 1250 1000
18 сутки 2100 1600 1250 1000
1850 1480 1140 1000
19 сутки 2100 1750 1300 1040
2250 1680 1300 1025
1950 1570 1200 1030
2200 1850 1350 1080
20 сутки 2320 1760 1350 1060
2050 1650 1240 1070
2300 1950 1400 1140
21 сутки 2450 1860 1400 1100
2170 1750 1300 1110
Как видно из таблицы 1, средние приросты веса цыплят из контрольной группы составили примерно 33 г., средние привесы цыплят из группы, получавшей антибиотик широкого спектра действия «Фурацилин» - 45 г., средние привесы цыплят из группы, получавшей неактивированный «Фотодитазин»- 63 г., а средние привесы цыплят из группы, получавшей активированный
«Фотодитазин»- 74 г. Кроме того, была замечена
плохая переносимость антибиотика при первых днях дачи - диспепсия и частые жидкие дефекации, а также 3 цыпленка, не участвующие в эксперименте, но содержащиеся без дачи каких-либо препаратов, пали на 9, 12 и 16 сутки.
Показатели общей микробной обсемененности исследуемых проб мяса представлены в таблице 2:
Показатели общей микробной обсемененности проб мяса
Таблица 2
Наименование образца КМАФАнМ, КОЕ/г
СанПиН2.3.2.1078-01 Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов 1 х 105
Проба мяса из группы, получавшей активированный «Фотодитазин» 2,7 х 104
Проба мяса из группы, получавшей неактивированный «Фотодитазин» 1,4 х 106
Проба мяса из группы, получавшей антибиотик 0,9 х 106
Контроль, проба мяса из группы, выращиваемой с обычным кормлением 2 х 106
На основании данных представленных в соответствует нормативам действующего таблице 2, можно сделать вывод, что мясо птицы, СанПиН2.3.2.1078-01.
получавшей активированный препарат, наиболее Показатели панкреатической эластазы
лабораторных крыс представлены в таблице 3:
Таблица 3
Показатели панкреатической эластазы у лабораторных самок крысы в исследуемой группе,
На основании данных представленных в соответствует нормативам действующего таблице 2, можно сделать вывод, что мясо птицы, СанПиН2.3.2.1078-01.
получавшей активированный препарат, наиболее Показатели панкреатической эластазы
лабораторных крыс представлены в таблице 3:
Таблица 3
Показатели панкреатической эластазы у лабораторных самок крысы в исследуемой группе,
Показатели панкреатической эластазы у лабораторных самок крысы, измеренные методом ИФА, мкг/г
Контрольная группа Подопытная группа
35.384 42.91
50.57 268.2
200.3 239.4
159.7 263.4
167.4 257.8
113.8 219.4
На основании данных из таблицы 3, можно сделать вывод о том, что потребление сырья, обработанного фотосенсибилизатором не приводит к развитию кишечной недостаточности у самок крысы.
Обсуждение полученных результатов и данных.
Использование бактерицидного эффекта фотосенсибилизаторов для санации актуально и из-за того факта, что при длительной даче антибиотиков возможно возникновение резистентности микроорганизмов к
антимикробным препаратам. По литературным данным известно, что еще в начале развития химиотерапии при изучении действия трипанового синего на трипаносомы, П. Эрлих замечал
появление резистентных форм микроорганизмов к данному красителю, по мере расширения арсенала химиопрепаратов увеличивалось число сообщений о таких наблюдениях. Так, после начала широкого применения сульфаниламидных препаратов было отмечено появление многочисленных штаммов бактерий, которые легко выдерживали терапевтические концентрации данных препаратов, антибиотикорезистентные бактерии возникли и стали распространяться сразу после внедрения антибиотиков в клиническую практику, в настоящее время повсеместно возрастает число лекарственно-устойчивых форм бактерий. Так, частота обнаружения пенициллиноустойчивых стафилококков доходит до 90-98 %, стрептомициноустойчивых - 60-70 % и выше,
ив
ЕШШ
резистентность шигелл к ампициллину достигает 90 % и более, к тетрациклину и стрептомицину -54 %.
На основании опытов, проделанных на подопытных группах цыплят, было выяснено, что птица, получавшая раствор активированного фотосенсибилизатора «Фотодитазин» обладала наибольшими привесами из всех подопытных групп, кроме того введение в откорм антибиотика широкого спектра «Фурацилин» в первые дни его дачи привело к диспепсии у подопытной группы, получавшей его, с дальнейшей частой и жидкой дефекацией и снижения аппетита. Как показали микробиологические исследования тушек из каждой подопытной группы, «Фотодитазин» не оказывает отрицательного эффекта на органолептические и физико-химические показатели мяса убойных животных, не вызывает пороков продукта, а бактериальная обсемененность мяса, обработанного фотосенсибилизатором, ниже, чем у мяса, не подвергшегося обработке. Кроме того, при выпаивании фотосенсибилизатора «Фотодитазина» подопытным цыплятам-бройлерам на протяжении всего опыта у цыплят не было обнаружено каких-либо отклонений - кожа была ровная и гладкая, без признаков аллопеции, перьевой покров соответствовал физиологической норме, пигментация не была нарушена, поведенческая активность оставалась неизменной, температура тела не превышала физиологической нормы, вид отходов был без изменений. Фотосенсибилизации не наблюдалось, ни при воздействии солнечного света, ни при облучении кожи подопытных цыплят лазером с длиной волны 662 нм в течение 5 минут. Таким образом, в проведенных опытах на подопытных группах цыплят было выяснено, что качество мяса, полученного от птицы, получавшей активированный фотосенсибилизатор
«Фотодитазин», не уступает по качеству мясу птицы, получавшей антибиотики широкого спектра действия, а привесы птицы, получавшей фотосенсибилизатор превосходят привесы птицы, получающей антибиотик, что может быть обусловлено пагубным влиянием антибиотиков на естественную микрофлору организма, а также введение антибиотиков на ранних этапах развития птицы может быть стресс-фактором для организма, так как, чем моложе птица, тем менее установившийся у нее гомеостаз. Кроме этого, у большинства микробов при длительном применении антибиотиков возникает
антибиотикорезистентность, которая
обусловливается такими факторами, как: превращением активной формы антибиотика в неактивную форму путем ферментативной инактивации и модификации; утратой проницаемости клеточной стенки для определенного химиотерапевтического препарата; нарушениями в системе специфического транспорта данного препарата в бактериальную клетку; возникновением у микроорганизмов
East European Scientific Journal # 7(71), 2021 13 альтернативного пути образования жизненно важного метаболита, заменяющего основной путь, блокированный препаратом.
В итоге можно сделать вывод, что фотосенсибилизаторы обладают бактерицидной активностью и эффективны для профилактической дачи их поголовью для оздоровления хозяйства.
Выводы.
1. Фотосенсибилизаторы обладают бактерицидной активностью и являются перспективными препаратами для санации продукции птицеводства и профилактики сальмонеллеза птиц;
2. При пероральном введении фотосенсибилизатора «Фотодитазин» однократно каждые сутки в дозировке 0,2 мл на 1 кг массы проявляется антибактериальный эффект препарата - аналога антибиотиков. При этом приросты массы у птиц, получавших фотосенсибилизатор в профилактических целях против сальмонеллеза, выше на 21,8 %, чем у птиц, получавших кормовые антибиотики;
3. Бактериальная обсемененность мяса птиц, получавших фотосенсибилизатор, на 46,7 % ниже, чем у птиц контрольной группы;
4. Продукты убоя от птиц, получавших фотосенсибилизатор, по составу и качеству не отличаются от контрольных, не подвергавшихся обработке;
5. Фотосенсибилизаторы не обладают острой и хронической токсичностью для организма птиц в рекомендуемых для применения концентрациях. При проведении опытов с лабораторными мышами так же не наблюдалось признаков интоксикации организма, а показатели панкреатической эластазы у подопытной группы крыс находятся в пределах нормы.
Список литературы
1. Бондаренко В.М., Коновалова Г.Н., Николаева Е.В. и др. Эффект фотодинамического воздействия металлокомплексов производных хлорина Е6 на условно-патогенные бактерии с использованием сверхъярких светодиодов холодного белого света. Лазерная медицина 2008 12(2): 26-30
2. Гейниц А.В., Сорокатый А.Е., Ягудаев Д.М., Трухманов Р.С. Фотодинамическая терапия. История создания метода и ее механизмы
3. ГОСТ Р ИСО 20776-1-2010 «Клинические лабораторные исследования и диагностические тест-системы in vitro»
4. ГОСТ Р 50396.0-92 «Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты птичьи. Методы отбора проб и подготовка к микробиологическим исследованиям»
5. ГОСТ 31468-2012 «Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты из мяса птицы. Метод выявления сальмонелл»
6. ГОСТ ИСО/МЭК 17025:2009 (ISO/IEC 17025:2005) «Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий»
7. ГОСТ 10444.15-94 «Продукты пищевые. Методы определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов»
8. ГОСТ 28566-90 «Продукты пищевые. Метод выявления и определения количества энтерококков»
9. ГОСТ 31746-2012 «Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества
коагулазоположительных стафилококков и Staphylococcus aureus»
10. Основные направления фотодинамической терапии в медицине / Р. М. Салмин [и др.] // Новости хирургии. - 2008. - № 3. - С. 155-162.
11. СанПиН2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов»
