CC BY
14«Эколого-генетические основы современных агротехнологий». СПб, 27-29 апреля 2016 г.
187
Straib, 1932; Коновалова и др., 1977] и степени поражения растений (шкала Петерсона) [Peterson et al., 1948] проводили в период молочно-восковой спелости зерна (фаза 79 по Zadoks, 1974).
Оценка эффективности генов устойчивости пшеницы во взрослом состоянии растений проведены на жестком инфекционном фоне. Согласно проведенной оценке, гены ранжированы следующим образом:
- высокоэффективные (типы реакции i, 0 баллов) Yr: 3a+4a+D+Dru+Dru2, 3b+4b+H46, 4+12, 5, 5 (в T. spelta album), 16, 25, Exp1+Exp2, SP, SP+25, Tye (11 линий и сортов);
- эффективные (тип 1, 1(2), 2 балла, степень поражения 1-5 %) Yr: 1, 1+3b+3c+4b+14, 2+6+HK, 2+9+Cle, 2+HVII, 2+3a+4a+Yam, 3, 3a, 3a+4a+V23, 3a+4a+ND+12, 6, 6+25, 7, 7+25, 8, 8+19, 11, 13, 17, 18, 24, 26, 27, 32, A2, A3, Da1+Da2, Pa1+Pa2+Pa3, Pr1+Pr2, SD+25, SU, Tr1+Tr2 (32 линии и сорта);
Библиографический
Коновалова Л.Ф. [и др.] Методические рекомендации по изучению расового состава возбудителей ржавчины хлебных злаков / Л.Ф. Коновалова [и др.].ВНИИФ. ВАСХНИЛ. М. 1977. 144 с. Шумилов Ю.В., Волкова Г.В., Надыкта В.Д. Структура популяции возбудителя желтой ржавчины пшеницы по вирулентности на Северном Кавказе // Микология и фитопатология. 2015. Т. 49. вып. 3. С. 194-200. Шумилов Ю.В. Изучение генетического разнообразия растения-хозяина к закавказской популяции возбудителя желтой ржавчины пшеницы (Puccinia striiformis West. f. sp. tritici Erikss. et Henn.) / Ю.В. Шумилов, Г.В. Волкова, Т.С. Иванова // Политематический сетевой электронный научный журнал Кубанского государственного аграрного универси-
Plant Protection News, 2016, 3(89), p. 186-187
- умеренноэффективные (типы 1(2), 2, 2(3) балла, степень поражения 6-20 %) гены Уг: 1 (в Сhinese 166), 3с+Мт, 4Ь, 10, 10+Мог, 15, А (7 линий и сортов);
- неэффективные (тип 2, 2,3, 3 и 4 балла, степень свыше 20 %; тип 3,4 балла, степень свыше 5 %) гены Уг: 3a+Ste+Ste2+S, 6+20, 7+22+23, 9, 21 (5 линий и сортов).
Таким образом, для селекции пшеницы на устойчивость к возбудителю желтой ржавчины на юге России рекомендуются с условием постоянной ротации высокоэффективные и эффективные гены, перечисленные выше. Однако, успех селекции на длительную устойчивость к ржавчинным грибам, обладающим значительным запасом изменчивости, может быть достигнут только на базе широкого генетического разнообразия исходного материала с учетом внутривидовой дифференциации возбудителей и тенденций происходящих изменений.
список (References)
тета (Научный журнал КубГАУ) [Электронный ресурс]. - Краснодар: КубГАУ, 2012. 77(03). Шифр Информрегистра: 0421200012\0183. Режим доступа: http://ej.kubagro.ru/2012/03/pdf/35.pdf. Gassner G. Die Bestimmung der biologischen Rasses des Weizengelbrostes (Puccinia glumarum f.sp. tritici (Schm.) Erikss. and Henn.) / G. Gassner, W. Straib // Arb. Biol. Reichsanst. 1932. V. 21. P. 141-164. Peterson, R.F. A diagrammatic scale for estimating rust intensity of leaves and stem of cereals / R.F. Peterson, A.B. Campbell, A.E. Hannah // Can. J. Res. Sect., 1948. V. 26. P.496-500. Zadoks, J.C. A decimal code of the growth stage of cereal / J.C. Zadoks, T.T. Chang, G.F. Konzak // Weed Recearch.1974. V. 14. P. 415-421.
EVALUATION OF GENES EFFICIENCY FOR RESISTANCE TO YELLOW RUST
IN ADULT WHEAT PLANT Yu.V. Shumilov, G.V. Volkova, I.P. Matveeva
All-Russian Institute of Biological Plant Protection, oper263@mail.ru, galvol@bk.ru The aim of the work was to study the effectiveness of the known Yr-resistance genes of the host plant to the North Caucasian population P.striiformis in adult plants. The research was carried out using classical phytopathological methods. The evaluation of 16 near isogenic lines of Avocet cultivar, 39-differentiator cultivars of international, European, American, and an additional set of cultivars was carried out in the period of milk-wax ripeness according to conventional techniques. Eleven highly effective and 32 effective resistance genes Yr, providing reliable wheat protection, were detected. They are recommended for use in breeding to develop rust-resistant cultivars.
УДК 581.1
БЕЗБАКТЕРИАЛЬНОЕ ПОЛУЧЕНИЕ КОСМАТЫХ КОРНЕЙ Г.Р. Ясыбаева, З.Р. Вершинина, Б.Р. Кулуев, А.В. Чемерис
Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН, Уфа, Россия, gulnar.yas@mail.ru Целью данного исследования стала разработка нового подхода безбактериального получения косматых корней и изучение их морфофизиологических особенностей. В работе были использованы молекулярно-биологические методы. Результатами данного исследования стали: 1) амплификация rol-генов с Ri- плазмиды Agrobacterium rhizogenes штамма А4, которые специфически модифицировались с целью дальнейшей рекомбинации с геномом растений; 2) подбор и оптимизация условий для проведения биобаллистической трансформации; 3) получение двух линий косматых корней, в результате трансформации листовых эксплантов табака ампликоном rol-генов с помощью биобаллистического метода. Полученные корни имели характерный для косматых корней фенотип. Морфофизиологические показатели регенирировавших in vitro растений соответствовали фенотипам растений табака, полученных из косматых корней, образованных штаммами A. rhizogenes. Тем самым показана возможность получения косматых корней без использования A. rhizogenes, что имеет перспективы для трансформации растений не подверженных агробактериальной инфекции.
Ключевые слова: косматые корни, rol-гены, биобаллистика, трансгенные растения, табак. Грамотрицательная почвенная фитопатогенная бакте- у различных растений, относящихся к классу двудольных. рия Agrobacterium rhizogenes вызывает неопластический Данная бактерия содержит Ri-плазмиду, Т-ДНК которой плагиотропный рост косматых (англ. «hairy roots») корней способна интегрироваться в растительный геном. Экспрес-
188
Вестник защиты растений 3(89) - 2016. Материалы международной конференции
сия rol-генов (root focus) - rolA, rolB, rolC и rolD, содержащихся в Т-ДНК, нарушает нормальное функционирование растительного организма (в частности, влияет на гормональный баланс), что приводит к определенным морфологическим изменениям трансформированных растительных тканей, в частности появлению косматых (бородатых) корней. Инфицированные растения продуцируют различные вторичные метаболиты - алкалоиды, терпеноиды, фенолы, гликозиды и др., часть из которых служит сырьем для получения лекарственных препаратов или относятся к другим хозяйственно-ценным соединениям, включая инулин, полиизопрен и др.
В природных условиях почвенные бактерии A. rhizogenes инфицируют здоровые растения, проникая через повреждения корней. В связи с этим довольно простым и распространенным способом является сокультивирование надрезанных скальпелем или проколотых иглой растительных эксплантов с суспензией агробактерий [Van de Velde et al., 2003]. Для изучения особенностей взаимодействия A. rhizogenes с растениями, процесса образования косматых корней и возможностей их практического использования в качестве продуцентов биологически активных веществ разрабатываются все новые подходы получения бородатых корней у различных растений [Кулуев и др., 2015]. Одним из недостатков описанной выше методики является достаточно трудоемкий и долгий процесс избавления от агро-бактерий и большая зависимость эффективности трансформации от штамма A. rhizogenes и вида инфицируемого растения. Более того, данный метод подходит в основном только для трансфомации двудольных растений, так как у однодольных и голосеменных растений таким способом получить косматые корни весьма трудно.
Для преодоления этих трудностей в нашей лаборатории был предложен новый метод безбактериального получения косматых корней. Сущность данного подхода заключается в биобаллистической трансформации стерильных растительных эксплантов микрочастицами золота, покрытых ампликоном, содержащим все 4 rol-гена и ограниченного с двух сторон Т-границами Т-ДНК A. rhizogenes.
В работе использованы бактерии Agrobacterium rhizogenes штамма A4. Тотальную ДНК бактерий выделяли с помощью набора ДНК-Сорб (ИнтерЛабСервис, Россия). Фрагмент ДНК агробактерии размером 5401 п.н., содержащий гены rolA, rolB, rolC и rolD, был амплифицирован из плазмидной ДНК A. rhizogenes при помощи LR Plus поли-
меразы (Силекс, Россия). Для добавления в ампликон последовательностей правой и левой границ Т-ДНК A.rhizogenes проводили реамплификацию при помощи модифицированных прямого и обратного праймеров. Биобаллистическая трансформация проводилась с использованием "генной пушки" Biolistic PDS-1000/He (Bio-Rad, США), где в качестве микроносителя были использованы микрочастицы золота Bio-Rad, средний размер которых составлял 0.6 мкм. Преципитацию ДНК проводили кальций-спермидино-вым способом, по Файнер. Для повышения выживаемости трансформируемой ткани проводили осмотическую предобработку (культивация листовых пластинок табака в среде с содержанием сахарозы 90 г/л). Для биобаллистики было использовано расстояние от источника частиц до ткани мишени 6 см. После выстрела листовые экспланты помещали на агаризованную безгормональную среду Мурасиге-Ску-га. Чашки выдерживались при 25 °C в темноте.
Через 10-15 дней культивирования на отдельных листовых эксплантах появились косматые корни. Эффективность трансформации листовых пластинок табака с использованием оптимизированных параметров составила 4 %. Полученные корни имели характерный для косматых корней фенотип: активное образование боковых корней, быстрый и агравитропный рост. Через 20-30 дней на бородатых корнях появились точки регенерации, которые дали начало нескольким побегам. Фенотипы этих in vitro растений соответствовали фенотипам растений табака, зараженных A. rhizogenes в природе (низкорослые, кустистые растения с темно-зелеными морщинистыми листьями). Для подтверждения косматости корней проводили ПЦР-анализ с праймерами к фрагменту rolB-гена, так как это ген является ключевым в корнеобразовании [Nilsson, Olsson, 1997]. Основным преимуществом разработанного de novo биобаллистического метода получения косматых корней является то, что нет необходимости удалять агробактерии при дальнейшей культивации культуры корней (в частности в биореакторах), поскольку они уже изначально не присутствуют в процессе трансформации. Также этот метод (в перспективе) позволит получать бородатые корни у некоторых растений, трудно или совершенно не поддающихся агробактериаль-ной трансформации (например, у однодольных растений и голосеменных растений).
Исследования проводились при финансовой поддержке грантов РФФИ-Поволжье - № 14-04-97005 р_поволжье_а; РФФИ-Инициативный - № 16-04-00902 А.
Библиографический список (References)
Кулуев Б.Р., Вершинина З.Р., Князев А.В., Чемерис Д.А., Баймиев Ан.Х., Чумаков М.И., Баймиев Ал.Х., Чемерис А.В. «Косматые» корни растений - важный инструментарий для исследователей и мощная фи-тохимбиофабрика для производстенников // Биомика, 2015. Т. 7, N 2, 70-120;
Nilsson O., Olssen O. Getting to the root: The role of the Agrobacterium rhizogenes rol genes in the formation of hairy roots // Physiol. Plant. 1997.V. 100. P. 463-473;
Van de Velde W., Karimi M., Den Herder G.,Van Montagu M., Holsters M., Goormachtig S. Agrobacterium rhizogenes - mediated transformation of plants. In: Jackson J.F., Linskens H.F. (eds.) Genetic Transformation of Plants. Springer Berlin Heidelberg. 2003. P. 23-44.
Plant Protection News, 2016, 3(89), p. 187-188
INDUCTION OF HAIRY ROOTS WITHOUT AGROBACTERIUM TRANSFORMATION G.R. Yasybaeva, Z.R. Vershinina, B.R. Kuluev, A.V. Chemeris
Institute of Biochemistry and Genetics Ufa Scientific Centre RAS, gulnar.yas@mail.ru
The Ri-plasmid A4 of Agrobacterium rhizogenes contains within its T-DNA genetic information which able to trigger the hairy root syndrome in infected plants. We proposed a new method of induction of hairy roots without agrobacterium transformation. The possibility of development of hairy roots on tobacco leaves through bioballistic transformation was shown.
