CC BY
11
МФ в масштабируемых количествах. В докладе обсуждаются принципы получения иМФ, наиболее перспективные направления их использования, вопросы безопасности клинического применения, а также суммируются результаты собственных исследований иМФ.
В результате собственных исследований отработана модель и различные протоколы получения иМФ, показано, что иМФ имеют характерную для МФ морфологию и фенотип (CD14+CD45+CD11b+), экспрессируют маркеры характерные для «наивных» неполяризованных МФ (фенотип CD163+/lowCD206+/lowHLA-DR+/lowCD86+/lowCD80low), ко-продуцируют про- и противо-воспалительные цитокины/хе-мокины (IL-6, CCL2, CXCL1, CXCL8, CXCL10, IL-10, IL-1RA, CCL22 и др.), отвечают на воспалительные сигналы (LPS/ IFN-y), обладают высокой фагоцитарной активностью, способны эффективно подавлять бактериальную инфекцию в модели in vitro. Сравнительный анализ иМФ, полученных с использованием различных протоколов, показал, что все иМФ имеют сходные морфологические и фенотипи-ческие характеристики, однако различаются по деталям транскриптомного профиля (экспрессии генов, ассоциированных с воспалительным ответом, липидным обменом, презентацией антигена) и траекториям дифференцировки. С использованием системы CRISPR/Cas9 разработана модель и показана возможность получения генетически модифицированных иМФ человека с индуцибельной экспрессией генов, участвующих в регуляции воспалительного и противоинфекционного иммунитета.
В целом, разработана модель получения иМФ и генетически модифицированных иМФ человека, которая может быть использована для изучения механизмов и разработки методов коррекции воспалительного и про-тивоинфекционного иммунитета, а в перспективе — для коррекции нарушенных функций макрофагов в клинике. Работа поддержана грантом РНФ № 19-075-1076. Работа проводилась с использованием оборудования ЦКП ИБР им Н.К. Кольцова РАН.
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКАЯ
ОЦЕНКА МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ
И АУТОФАГОЦИТАРНЫХ МАРКЕРОВ ПРИ
СТАРЕНИИ ГОЛОВНОГО МОЗГА ЧЕЛОВЕКА
А.С. Магнаева1, Т.И. Баранин1' 2, А.А. Гофман2,
Д.Н. Воронков1, В.С. Сухоруков1
1 ФГБНУ Научный центр неврологии, Москва, Россия
2 РНИМУ им. Н.И. Пирогова, Москва, Россия
e-mail: alinamagnaeva03@gmail.com
Ключевые слова: митохондрия, аутофагия, старение головного мозга, нейродегенерация.
За последние десятилетия было показано, что при старении головного мозга поддержание функционального пула нейронов тесно связано с постоянным обновлением цитоплазмы и окислительным фосфорилированием, что определяет актуальность изучения аутофагии и митохондрий для разработки таргетной терапии возраст-ассоци-ированных нейродегенеративных заболеваний [1].
Цель исследования — определение уровней экспрессии маркеров шаперон-опосредованной аутофагии HSP70, LAMP2A, макроаутофагии LC3B, V ферментного комплекса митохондрий ATP5A, контроля качества митохондрий DJ1 в нейронах различных зон головного мозга человека при старении.
Аутопсийный материал был получен от 30 умерших старческого возраста, причиной смерти которых
явилась тромбоэмболия легочной артерии. Для сравнительного анализа был использован аутопсийный материал лиц 35-45 лет (n=10), умерших от внезапной сердечной смерти. В анамнезе больных отсутствовали указания на когнитивные и двигательные нарушения. Иммуногистохимическое исследование было проведено с использованием антител к LC3B, HSP70, LAMP2, ATP5A и DJ1. Оптическая плотность оценивалась в пе-рикарионе 150 крупных нейронов V слоя коры пре-центральной извилины, стриатума, пирамидного слоя гиппокампа. Для выявления различий между группами использовали критерий Краскела-Уоллиса.
Результаты иммуногистохимического исследования выявили увеличение экспрессии HSP70 в примерно 2 раза, а LAMP2A и LC3B в 1,5 раза в старческой возрастной группе по сравнению с контролем. Экспрессия ATP5A в нейронах коры, стриатума, гиппокампа в группе старческого возраста по сравнению группой молодого возраста была выше на 42%, 26% и 41%, соответственно. Во всех изученных зонах при старении отмечалась тенденция к снижению значений DJ1, однако статистически значимых различий между группами выявлено не было.
Таким образом можно предположить, что обнаруженные нами изменения уровней маркеров различных типов аутофагии, АТФ-синтетазы и маркера качества митохондрий, вероятно, способствуют выживаемости нейронов при возрастной инволюции за счет поддержания проте-остаза и адекватного уровня энергии в клетках, а дальнейшее изучение вышеуказанных белков с помощью различных методов клеточной и молекулярной биологии может внести вклад в понимание механизмов старения.
Литература:
1. Mattson M.P., Arumugam T.V. Cell Metab. 2018 Jun
5;27(6):1176-1199.
БЕЗАНТИТЕЛЬНЫЙ ХИМЕРНЫЙ РЕЦЕПТОР FLT3-CAR ДЛЯ ТАРГЕТИРОВАНИЯ ТИРОЗИНКИНАЗНОГО РЕЦЕПТОРА FLT3 — МАРКЕРА ПЛОХОГО ПРОГНОЗА ПРИ ОСТРОМ МИЕЛОИДНОМ ЛЕЙКОЗЕ
В.Е. Майорова, М.Д. Моллаев, П.Н. Вихрева,
Е.А. Кулаковская, Д.Е. Першин,
А.В. Кибардин, М.А. Масчан, С.С. Ларин
ФГБУ НМИЦ детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дм. Рогачева МЗ РФ, Москва, Россия
Ключевые слова: химерные рецепторы CAR, лейкоз, FLT3.
Химерные рецепторы CAR — трансмембранные рецепторы, последовательность которых методами генной инженерии собрана из двух функциональных частей: внеклеточная часть химерного рецептора, узнающая опухолевый антиген на поверхности клетки-мишени, и внутриклеточная часть, состоящая из последовательности активирующего домена Т-клеточного рецептора CD3Z, а также одного или нескольких ко-стимулирующих доменов. В результате узнавания внеклеточной частью химерного рецептора CAR опухолевого антигена происходит активация CAR Т-клетки с последующим специфическим элиминированием опухолевой клетки.
Традиционно дизайн внеклеточной части рецептора CAR включает создание генетической конструкции, кодирующей одноцепочечный фрагмент вариабельной части (scFv) известного моноклонального антитела против
конкретной молекулярной мишени. Известно, что scFv части отдельных химерных рецепторов CAR часто стремятся к агрегации, в частности посредством «обмена доменами» (domain-swapping). Агрегация химерных рецепторов CAR приводит к тонической активации CAR Т-клеток, снижая специфичность цитотоксической активности CAR Т-клеток, а также приводя к более быстрому истощению пролиферативного потенциала (снижению персистенции) CAR T-клеток. Тенденция к агрегации является характеристикой каждой конкретной последовательности scFv. Подбор оптимальной последовательности внеклеточной части рецептора CAR является трудоемкой и времязатратной процедурой.
В данной работе в качестве внеклеточной части химерного рецептора использовалась полноразмерная последовательность Flt3-лиганда — естественного агониста тирозикиназного рецептора Flt3. Flt3-лиганд с высокой аффинностью взаимодействует с рецептором Flt3. Рецептор Flt3 представлен в повышенном количестве на поверхности бластных клеток в большинстве случаев острого миелоидного лейкоза. В примерно трети случаев рецептор Flt3 несет активирующую мутацию, что связывают с плохим прогнозом. Таким образом, безантительные Flt3-CAR Т-клетки могут более специфично элиминировать бластные клетки при остром миелоидном лейкозе.
В ходе работы была получена генетическая конструкция, кодирующая безантительный химерный рецептор Flt3-CAR, содержащая полноразмерную последовательность неизмененного Flt3-лиганда. С помощью лентиви-русной трансдукции донорских CD3-позитивных клеток были получены Flt3-CAR T-клетки. Было показано, что Flt3-CAR T-клетки специфически элиминируют Flt3-позитивные клетки THP-1 и не мешают пролиферации Flt3-негативным клеткам U937. Используя клетки Flt3-CAR Jurkat как модель Flt3-CAR T-клеток, неспособную к Т-клеточной активации, было показано, что химерный белок Flt3-CAR не цитотоксичен по отношению к Flt3-позитивным клеткам THP-1. Киллинг Flt3-позитивных клеток THP-1 дозозависимо ингибировался растворенным рекомбинантным Flt3-лигандом.
Таким образом, полученные Flt3-CAR T-клетки специфически убивают Flt3-позитивные клетки in vitro. Для элиминирования клеток-мишеней безантительным Flt3-CAR T-клеткам необходим функциональный механизм Т-клеточной активации. Безантительные Flt3-CAR T-клетки взаимодействуют с клетками-мишенями через сайт связывания Flt3-ligand:Flt3 рецептора Flt3 на поверхности THP-1.
БИОСОВМЕСТИМОЕ УСТРОЙСТВО ДЛЯ
УКРЫТИЯ ДЕФЕКТА ФИБРОЗНОГО КОЛЬЦА
В ПОЯСНИЧНОМ ОТДЕЛЕ ПОЗВОНОЧНИКА
ПОСЛЕ СЕКВЕСТРЭКТОМИИ
С.А. Макаров1, А.Г. Аганесов1, М.М. Алексанян1,
В.А. Демина2, О.А. Спирин1
1 ФГБНУ Российский научный центр хирургии им. акад. Б.В. Петровского, Москва, Россия
2 НИЦ Курчатовский институт, Москва, Россия
e-mail: makarov.spine@gmail.com
Ключевые слова: грыжа межпозвонкового диска, дискэкто-
мия, секвестрэктомия, дефект фиброзного кольца.
Дегенеративно-дистрофические изменения поясничного отдела позвоночника занимают 5 место среди
причин госпитализации и 3 место среди причин хирургического лечения. В настоящее время золотым стандартом хирургического лечения при грыжах межпозвонкового диска в поясничном отделе позвоночника является микрохирургическая или эндоскопическая секвестр- или дискэктомия. При этом риск развития рецидива заболевания при эндоскопическом методе достигает 30%, а при микрохирургическом — 10%. Рецидивы грыж межпозвонковых дисков часты, так как при классическом исполнении операции остаётся дефект в фиброзном кольце и задней продольной связке. Для снижения риска развития рецидива на мировом рынке в настоящее время существует единственный импортный (США) биосовместимый имплант, который не получил распространения в связи с высокой стоимостью, а также остаточным высоким риском рецидива. На отечественном рынке аналогов не существует. При использовании меж-теловых кейджей после дискэктомии с последующей фиксацией позвонков с целью создания спондилодеза после операции возникают следующие осложнения: синдром смежного уровня, миграция фиксаторов, что требует проведения повторных оперативных вмешательств. Кроме того, при проведении таких операций многократно возрастает её продолжительность, объём кровопотери, увеличивается срок пребывания на постельном режиме. При использовании нашего устройства в позвоночно-двигательном сегменте сохранится полная амплитуда движений, что, в свою очередь, является профилактикой и синдрома смежного уровня.
Нами планируется создание биосовместимого устройства для укрытия дефекта фиброзного кольца для предотвращения рецидивов после поясничной се-вестрэктомии. Разработка биосовместимого устройства для укрытия дефекта фиброзного кольца при малоинва-зивных операциях на поясничном отделе позвоночника позволит улучшить результаты хирургического лечения дегенеративных заболеваний поясничного отдела позвоночника и улучшить качество жизни данной группы пациентов, которые в основном являются людьми трудоспособного возраста.
В настоящее время разработан эскиз устройства; совместно с НИЦ «Курчатовский институт» проводятся комплексные испытания для изучения свойств материалов для выбора наиболее подходящего.
ВКЛАД РЕГЕНЕРАТИВНОЙ МЕДИЦИНЫ
В ТЕРАПИЮ АУТОИММУННЫХ
ЗАБОЛЕВАНИЙ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ
С.В. Макаров1, Н.Х. Муселимян2
1 Институт интегративной медицины, Москва, Россия
2 The George Washington University, Washington, DC, USA
e-mail: iimmsv@yandex.ru
Ключевые слова: стволовые клетки, рассеянный склероз,
миастения.
Памяти нашего учителя, одного из основоположников регенеративной медицины в Поволжье, профессора СамГМУ М.В. Угловой посвящается
В последнее десятилетие отмечается рост заболеваемости аутоиммунной патологией во всем мире. Это касается также хронических прогрессирующих аутоиммунных заболеваний нервной системы: рассеянного
