CC BY
56
УДК 612.398:616.153.96-085.33
БЕТА-ЛАКТАМАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ БЕЛКОВ ЧЕЛОВЕЧЕСКОЙ КРОВИ: НОВЫЙ ВЗГЛЯД НА ПАТОГЕНЕЗ АНТИБИОТИКОУСТОЙЧИВОСТИ С ПОЗИЦИЙ ЭНДОЭКОЛОГИИ
© 2009 г. И. В. Жильцов, И. С. Веремей, В. М. Семенов, И. И. Генералов, Е. Н. Полешук
Витебский государственный медицинский университет, г. Витебск, Беларусь
Как известно, эндоэкология — наука, изучающая закономерности взаимодействия различных биотических и абиотических факторов в организме человека (в том числе взаимодействие человеческого организма с различными факторами среды обитания, проявляющееся специфическими и неспецифическими реакциями на организменном, органном, тканевом, клеточном и субклеточном уровнях).
С точки зрения эндоэкологии инфекционный процесс, клинически проявляющийся явлениями того или иного инфекционного заболевания, является процессом сложного многоуровневого взаимодействия микро-и макроорганизма. Результат этого взаимодействия может быть различен и зависит от уникального для каждого случая сочетания экзогенных и эндогенных факторов — состояния специфической и неспецифической иммунной реактивности у восприимчивого индивидуума, патогенности и вирулентности конкретного штамма микроорганизма, воздействия проводимой в данный момент или ранее медикаментозной и немедикаментозной терапии, а также благоприятных или неблагоприятных микро- и макроклиматических условий, социального положения индивидуума и даже эмоционально-психологического фона. Так, давно замечено, что в условиях стресса уровень иммунной реактивности снижается, иногда до критически низких величин, как это бывает у спортсменов во время ответственных соревнований [1]. В результате инфекционный процесс может завершиться развитием острой циклической формы инфекционного заболевания с последующим полным выздоровлением, хронической формы заболевания с различной активностью процесса (от минимальной до непрерывно прогрессирующей), латентной или субклинической формы заболевания без болезненных проявлений, «здорового» носительства возбудителя, которое многие исследователи приравнивают к хроническому заболеванию с минимальной активностью, а также «транзиторного» носительства с быстрой и полной элиминацией возбудителя из организма без развития клинической картины заболевания. Во всех этих случаях в организме-хозяине развертывается специфический иммунный ответ (преимущественно клеточный или преимущественно гуморальный в зависимости от природы возбудителя), иногда «нестерильный» (т. е. сохраняющий надлежащую напряженность только в присутствии живого возбудителя). Наличие сформированного иммунитета снижает или устраняет восприимчивость макроорганизма к данному виду микроорганизма пожизненно либо на определенный срок, продолжительность которого индивидуально варьирует в каждом конкретном случае.
Разрушать бета-лактамные антибиотики, помимо бета-лактамаз-бактерий, могут компоненты цельной крови. Наличие в крови больных факторов, разрушающих бета-лактамные антибиотики, может быть причиной низкой эффективности данных препаратов в лечении таких больных. Целью работы было выявление и оценка уровня собственной бета-лактамазной активности плазмы крови больных и здоровых лиц.
Для определения бета-лактамазной активности плазмы крови применялся модифицированный нами неокупрои-новый метод. В качестве модельных антибиотиков использованы ампициллин и бензилпенициллин. Выявлена значительная бета-лактамазная активность плазмы крови 30 больных и здоровых лиц: за время инкубации распадалась большая часть от количества обоих модельных антибиотиков, добавленных в пробы.
Во всех изученных подгруппах уровень распада модельных антибиотиков достоверно (р < 0,00001) превышал уровень их самораспада в контроле. Таким образом, не вызывает сомнения, что в крови как больных, так и здоровых лиц имеется фактор, резко усиливающий специфический гидролиз бета-лактамных антибиотиков.
Ключевые слова: «биологическая» антибиотикорезистентность, бета-лактамазная активность, белки крови, бета-лактамные антибиотики.
Сложность, многогранность и непредсказуемость исходов данного процесса давно уже не вызывает удивления исследователей и клиницистов. Тем не менее один из аспектов инфекционного процесса традиционно рассматривается только «со стороны» микроорганизма, и аспект этот — антибиотикоустой-чивость.
Когда идет речь об устойчивости к бета-лактамным антибиотикам, практически всегда имеют в виду анти-биотикорезистентность бактерий, опосредованную синтезом разнообразных бета-лактамаз. При этом забывают, что макроорганизм также небезразличен к введению антибиотиков. Антибиотики являются для организма чужеродными веществами, от которых он стремится избавиться любой ценой, используя для этого разнообразные механизмы. В частности, в наших предыдущих работах [3] было показано, что в крови у 33,82 % больных шигеллезом определяются поликлональные антитела субклассов G1, 2 и 4, обладающие бета-лактамазной активностью (причем у некоторых препаратов иммуноглобулинов данная активность оказалась довольно значительной). Формирование в организме таких антител, обладающих каталитической активностью («абзимов»), объясняется исходя из теории иммунологических сетей Ерне [9].
В целом необходимо отметить, что метаболизм бета-лактамных антибиотиков в организме изучен недостаточно, причем все крупные зарубежные исследования в этом направлении были свернуты к началу 90-х годов прошлого века, сменившись узкоприкладными, сугубо специализированными научными работами. Так, известно, что введенные парентерально бета-лактамы (от 19 до 96 % введенного препарата в зависимости от его химических особенностей) связываются с различными белками крови, преимущественно с альбуминами [5]. В дальнейшем антибиотик взаимодействует с пенициллинсвязываю-щими белками (ПСБ) бактерий, из которых наиболее известна D-аланин-карбоксипептидаза (всего число известных ПСБ у различных бактерий достигает 12). Бета-лактамные препараты являются аналогами переходного состояния основного субстрата для данного фермента — ацил^-аланил^-аланиновых окончаний главной составляющей бактериальной стенки — мурамилпептида (пептидогликана); они вступают в конкуренцию с D-аланил-D-аланиновыми остатками за активный центр D-аланин-карбоксипептидазы; в процессе взаимодействия бета-лактамная связь антибиотика разрывается ферментом и ковалентно связывается с остатком цистеина (по другим данным, с остатком серина [10]), образуя тиоэфир. Получившийся в результате комплекс «фермент — пенициллоиловая кислота» стабилен (в отличие от комплекса «фермент — субстрат»), вследствие чего происходит необратимое ингибирование фермента (т. е. бета-лактам — это так называемый «субстрат-убийца» — killing substrate) [8]. При этом нарушается формирование перекрестных связей молекул пепти-
догликана между собой, клеточная стенка бактерий получается рыхлой и перестает предохранять бактерии от осмотического лизиса. Показано, в частности, что в гиперосмолярной среде лизиса бактерий, подвергшихся действию пенициллина, не происходит; кроме того, бета-лактамы эффективно воздействуют только на активно размножающиеся бактерии, не влияя на покоящиеся [8]. Остатки антибиотика, не связавшиеся бактериальной клеткой, достаточно быстро выводятся почками (так, период полувыведения бензилпеницил-лина — 0,5—1 час с момента введения) [4].
При внешней убедительности приведенные данные неполны. В частности, доподлинно неизвестно, с какими белками в плазме крови связываются бета-лактамы, насколько прочна данная связь, происходят ли химические либо конформационные изменения молекул антибиотика в процессе транспортировки, какая именно фракция антибиотика (связанная либо несвязанная) имеет большее бактерицидное значение. В частности, имеются косвенные данные о том, что лишь малая часть введенных извне бета-лактамов достигает ПСБ бактерий. Так, по данным различных исследователей, грампозитивные микроорганизмы связывают от 4 до 15 нмоль пенициллина на 1 г сухого веса бактерий (от 100 до 10 000 молекул пенициллина на бактерию, в среднем 1 000—4 000 молекул); грамотрицательные микроорганизмы связывают в среднем в 5—10 раз меньше [8]. Таким образом, бета-лактамы вводятся в организм с огромным избытком, вероятно необходимым для покрытия естественной убыли антибиотиков в процессе транспортировки и распределения в тканях.
Известно, что за разрушение бета-лактамных антибиотиков отвечают бактериальные ферменты из группы бета-лактамаз, причем в человеческом организме аналоги данного фермента отсутствуют
[6]. Тем не менее имеются публикации, утверждающие, что гемолизированная кровь может разрушать 3-ацетоксиметил-цефалоспорины (це-фалотин, цефотаксим) посредством деацетиляции 3-ацетоксиметильной группы; при этом плазма и сыворотка крови, не содержащие продуктов лизиса эритроцитов, такой активностью не обладают. Следует отметить, что в данном случае бета-лактамная связь не разрушается, из-за чего цефалоспорины, не содержащие 3-ацетоксиметильной группы (цефалоридин, цефалексин, цефамандол, цефазолин), не утрачивают активности в присутствии гемолизированной крови
[7]. Данное наблюдение показывает, что антибиотики бета-лактамного ряда в принципе могут разрушаться какими-либо компонентами цельной крови и, возможно, плазмы или сыворотки крови, кроме бета-лактамаз (в частности, каталитическими антителами, о чем говорилось выше) [3]. Обнаружение в крови больных факторов (возможно, нескольких), эффективно разрушающих бета-лактамные антибиотики, может прямо указывать на одну из причин низкой эффективности указанных антибиотиков в лечении
таких больных. Возможно, именно инактивация антибиотиков макроорганизмом лежит в основе феномена появления антибиотикорезистентности in vivo при ее отсутствии или незначительной выраженности in vitro, неоднократно наблюдавшегося клиницистами. Ранее механизмы и проявления «биологической» антибиотикорезистентности не изучались.
Соответственно целью нашей работы было выявление и оценка уровня собственной бета-лактамазной активности плазмы крови как больных, так и здоровых лиц, а также, по возможности, установление белковых (или иной природы) субстратов, ответственных за проявление данной активности (если таковая обнаружится).
Материал и методы
Для изучения бета-лактамазной реактивности макроорганизма оказалась наиболее применимой спектрофотометрическая методика на основе реакции комплексообразования ионов меди, неокупроина и гидролизованной бета-лактамной связи различных производных 6-аминопенициллановой кислоты, образующей окрашенный продукт желтого цвета (так называемый неокупроиновый метод). Применение неокупроинового метода представляется достаточно перспективным, поскольку с его помощью избирательно выявляется гидролизованная бета-лактамная связь различных антибиотиков бета-лактамного ряда [111]. Ранее нами производилась сравнительная оценка различных методов выявления бета-лактамазной активности, в результате которой неокупроиновый метод был признан оптимальным [2].
Все используемые реагенты имели квалификацию не ниже ч. д. а. Измерение спектров поглощения и оптических плотностей проводилось на спектрофлуо-риметре SOLAR-СМ2203 (гос. рег. № РБ 03 11 2864 06) в режиме спектрофотометрии. В эксперименте в качестве субстратов использовали бензилпенициллина натриевую соль и ампициллин.
Модельный раствор антибиотика смешивали с исследуемой сывороткой крови в соотношении 1:1 и помещали в термостат (t = 37 °С) на 20 минут. Спустя указанное время к тест-объектам прибавляли раствор хлорной кислоты для осаждения белковой матрицы. В качестве контроля использовали модельные растворы бензилпенициллина и ампициллина, разведенные дистиллированной водой в соотношении 1:1 с добавлением хлорной кислоты. Все тест-объекты встряхивали на вортексе в течение 2 минут и центрифугировали при 3 000 об./мин 10 минут, после чего отбирали надосадочную жидкость. Учитывая вероятность потерь антибиотика с белковым осадком, был введен дополнительный контроль. Для этого предварительно полностью гидролизованные кипячением с гидроокисью натрия антибиотики вносили в эквивалентных количествах в испытуемые сыворотки и далее проводили депротеинизацию, как указано выше. Далее к исследуемым растворам прибавляли ацетатный буфер (pH = 4,75), неокупроиновый реагент и выдерживали при комнатной температуре в течение 30 минут до
развития стабильной желтой окраски. Спустя вышеуказанное время измеряли оптическую плотность образовавшихся комплексов при 454,5 нм.
Дизайн собственно исследования — срезовое (cross-sectional; изучаемый признак оценивался одновременно и однократно во всех исследуемых подгруппах), основанное на наблюдении (observational, т. е. никаких тестовых медицинских вмешательств, в том числе смены и модификации проводимой терапии, не производилось). Одномоментно были получены и проанализированы сыворотки крови 30 человек: 10 больных рецидивирующей рожей, 10 больных пневмонией и 10 здоровых военнослужащих срочной службы. На момент выполнения исследования все больные находились на стационарном лечении в различных отделениях Витебской областной инфекционной клинической больницы, а военнослужащие проходили плановое обследование на предмет носи-тельства C. trachomatis на базе того же стационара. Средний возраст больных составил 49,6 года (95 % CI: 33,14—62,28; min 10, max 80), средний возраст военнослужащих — 18,5 года (95 % CI: 17,53—19,47; min 17, max 21). Во всех трех подгруппах было по 5 женщин и 5 мужчин, т. е. общее соотношение женщин и мужчин как во всей анализируемой группе, так и в подгруппах составило 1:1.
Статистический анализ результатов исследования был выполнен с использованием аналитического пакета Statistica 6.0 (для проверки нормальности распределения изучаемых признаков применялся тест Колмогорова — Смирнова, для выявления корреляционных взаимосвязей — ранговый анализ Спирмена (Spearman), для проверки достоверности различий изучаемых признаков в независимых выборках — U-тест Манна — Уитни (Mann-Whitney).
Результаты исследования
При проверке нормальности распределения выяснилось, что распределение всех изучаемых признаков нормальным не являлось; преобладали смещенные типы распределения. Соответственно для дальнейшего статистического анализа полученных результатов использовались только непараметрические методы анализа (см. выше).
В ходе исследования была выявлена значительная бета-лактамазная активность плазмы крови как больных, так и здоровых лиц: за время инкубации (20 минут) распадалась большая часть от количества обоих модельных антибиотиков (бензилпенициллин и ампициллин), добавленных в пробы. Следует отметить, что анализировались образцы плазмы крови без малейших внешних признаков гемолиза.
Средний уровень распада антибиотиков через 20 минут инкубации при 37 °С составил:
1. Во всей группе: 60,67 % от общего количества добавленного к плазме крови ампициллина (95 % CI: 54,59—66,77) и 79,69 % от общего количества добавленного к плазме крови бензилпенициллина (95 % CI: 74,53-84,84).
2. В подгруппе больных рецидивирующей рожей: 58,51 % от общего количества добавленного к плазме крови ампициллина (95 % С1: 45,40—71,63) и 76,22 % от общего количества добавленного к плазме крови бензилпенициллина (95 % С1: 63,68—88,75).
3. В подгруппе больных пневмонией: 54,65 % от общего количества добавленного к плазме крови ампициллина (95 % С1: 42,76—66,54) и 76,73 % от общего количества добавленного к плазме крови бензилпенициллина (95 % С1: 69,62—83,85).
4. В подгруппе здоровых военнослужащих: 68,86 % от общего количества добавленного к плазме крови ампициллина (95 % С1: 60,86—76,87) и 86,10 % от общего количества добавленного к плазме крови бензилпенициллина (95 % С1: 77,66—94,55).
Во всех изученных подгруппах уровень распада модельных антибиотиков достоверно превышал уровень их самораспада в контрольных пробах (M—W U-test, р < 0,000001).
Уровень распада бензилпенициллина во всех подгруппах оказался достоверно выше уровня распада ампициллина (M—W U-test, р < 0,000001).
При анализе достоверности межгрупповых различий было показано, что уровень распада ампициллина был достоверно выше в подгруппе военнослужащих (М—W U-test, р = 0,039); уровень распада бензилпенициллина в группе военнослужащих также оказался выше, чем у больных рецидивирующей рожей и пневмонией, но достоверность выявленных различий была существенно ниже (M—W U-test, р = 0,10).
В подгруппах больных рецидивирующей рожей и пневмонией уровни распада как ампициллина, так и бензилпенициллина достоверно не различались (М—W U-test, р = 0,50 и 0,62 соответственно).
Значимых корреляционных взаимосвязей между наблюдаемым уровнем пенициллиназной активности крови, возрастом и полом больных выявлено не было.
К сожалению, малый размер группы и ограниченная реагентная база данного эксперимента не позволили провести анализ кинетики реакции, оценить влияние ингибиторов бактериальных пенициллиназ на уровень каталитической активности, а также уточнить зависимость уровня бета-лактамазной активности крови от возраста и пола исследуемых лиц. Таким образом, полученные нами результаты носят сугубо предварительный характер.
Выводы
Не вызывает сомнения, что в крови как больных, так и здоровых лиц имеется некий фактор (или несколько факторов), резко усиливающий специфический (по бета-лактамной связи) гидролиз бета-лактамных антибиотиков. Данный фактор, вероятнее всего, не имеет отношения к продуктам распада гемоглобина, так как в исследуемых образцах плазмы крови не было признаков гемолиза.
Вполне допустимо предположение, что наблюдаемая значительная бета-лактамазная активность плазмы крови объясняется побочным (неспецифическим) действием каких-либо ферментов крови с основной протеолитической или эстеразной активностью (например, компонентов системы фибринолиза либо комплемента).
Выявленный феномен имеет большое клиническое значение, так как, будучи подтвержденным, может объяснить многие из наблюдаемых случаев неэффективности антибактериального препарата in vivo при его доказанной микробиологической эффективности in vitro. Кроме того, распознав фактор (или факторы), ответственный за аномально высокий распад бета-лактамов в крови, и разработав эффективную методику его ингибирования, можно резко повысить «относительную» эффективность бета-лактамов и соответственно многократно снизить их терапевтические дозировки, что приведет в итоге к существенной экономии средств, выделяемых на этиотропную терапию. В случае же выявления высокой бета-лактамазной активности крови возможно изменение проводимой конкретному больному эмпирической терапии — назначение какого-либо из ингибиторзащищенных бета-лактамов либо антибактериального препарата из других фармакологических групп; своевременная коррекция проводимой этио-тропной терапии позволит ускорить выздоровление и сократить продолжительность госпитализации больного.
Несомненно, необходимы дальнейшие углубленные лабораторные и клинические исследования обнаруженного феномена, который представляет существенный интерес для клиники инфекционных болезней. Тем не менее уже сейчас понятно, что общие принципы эндоэкологии актуальны и в рассмотренном случае: антибиотикоустойчивость является не только свойством микроорганизма, природным или приобретенным, но скорее суммарной функцией сложного взаимодействия микро- и макроорганизма; при этом микроорганизм стремится разрушить антибактериальный препарат как непосредственную угрозу своему существованию, в то время как макроорганизм стремится разрушить или вывести лекарство, полагая его чужеродным веществом. Все это в целом приводит к тому, что уровень «совокупной» антибиотикоустойчивости оказывается выше уровня, который проявляет чистая культура микроорганизма in vitro, т. е. в процессе взаимодействия двух сложных систем образуется новое качество, не проявляемое по отдельности ни одной из них; это лишний раз подчеркивает важность системного подхода при анализе сложных биологических явлений.
Список литературы
1. Иммунологические аспекты спортивной деятельности человека / Р С. Суздальницкий, В. А. Левандо // Теория и практика физической культуры: научно-
теоретический журнал. — 1998. — № 10. — С. 43—46.
2. О возможности использования некоторых Р-лактамных антибиотиков в качестве тест-объектов для определения Р-лактамазной реактивности макроорганизма / И. С. Веремей, И. В. Жильцов, В. М. Семенов и др. // Материалы Евро-Азиатского конгресса по инфекционным болезням. — Витебск, 2008. — Т. 1. — С.179—180.
3. Особенности «биологической» антибиотикоустой-чивости при шигеллезах: выявление in vivo поликлональных IgG, обладающих пенициллиназной активностью / И. В. Жильцов, В. М. Семенов, Т. И. Дмитраченко, И. И. Генералов // Медицинская панорама. — 2006. — № 5(62). — С. 46—48.
4. Современная антимикробная химиотерапия : руководство для врачей / под ред. Страчунского Л. С., Козлова С. Н. — М. : Боргес, 2002. — 432 с.
5. Bactericidal Killing Activities of Cefepime, Ceftazidime, Cefotaxime, and Ceftriaxone against Staphylococcus aureus and p-Lactamase-Producing Strains of Enterobacter aerogenes and Klebsiella pneumoniae in an In Vitro Infection Model / Sh. M. Palmer, L. S. Kang, D. M. Cappelletty, M. J. Rybak // Antimicrobial Agents and Chemotherapy. — 1995. — Vol. 39, N 8. — P. 1764—1771.
6. Catalytic mechanism of an abzyme displaying a beta-lactamase-like activity / B. Avalle, H. Debat, A. Friboulet, D. Thomas // Appl. Biochem. Biotechnol. — 2000. — Vol. 83 (1—3). — P. 163—169.
7. Hydrolysis of 3-Acetoxymethyl Cephalosporins by Lysed WholeBlood / W E. Wright, Ju. A. Frogge // Antimicrobial Agents and Chemotherapy. — 1980. — Vol. 17, N 1. — P. 99—100.
8. Interaction of Penicillin with the Bacterial Cell: Penicillin-Binding Proteins and Penicillin-Sensitive Enzymes / P. M. Blumberg, J. L. Strominger // Bacteriological Reviews. — 1974. — Vol. 38, N 3. — P. 291—335.
9. Jerne N. K. Towards a network theory of the immune system / N. K. Jerne // Ann. Immunol. (Inst.Pasteur). — 1974. — Vol. 125, N 1—2. — P. 373—389.
10. Mechanism of penicillin action: Penicillin and substrate bind covalently to the same active site serine in two bacterial D-alanine carboxypeptidases (B-lactam/ peptidoglycan/ membrane enzyme/ penicillinase/ acyl enzyme) / R. R. Yocum, D. J. Waxman, J. R. Rasmussent, J. L. Stromincser // Biochemistry. — 1979. — Vol. 76, N 6. — P. 2730—2734.
11. Menashi A. C. A colometric procedure for measuring P-lactamase activity / A. C. Menashi, J. Abraham, A. M. Antone // Analitycal Biochemistry. — 1988. — Vol. 168. — P. 252—258.
BETA-LACTAMASE-LIKE ACTIVITY OF HUMAN BLOOD PROTEINS: NEW INSIGHT INTO PATHOGENESIS OF ANTIBIOTIC RESISTANCE FROM THE STANDPOINT OF ENDOECOLOGY
I. V. Zhyltsov, I. S. Veremei, V. M. Semenov,
I. I. Generalov, E. N. Poleshuk
Vitebsk State Medical University, Vitebsk, Belarus
The antibiotics of beta-lactam group can in theory be cleaved by some components of the whole blood, and, perhaps, plasma and blood serum besides bacterial beta-lactamases. Determination of factors capable of efficient cleavage of beta-lactams within patient’s blood could directly indicate one of the possible reasons of low efficacy of the above antibacterials in treatment of the such patients. Thus, the aim of our work was identification of proper beta-lactamase-like activity of blood plasma of both ill and healthy persons and evaluation of its level. We used self-modified neocuproine technique for determination of beta-lactamase-like activity of blood plasma. Ampicillin and benzylpenicillin were used as model antibiotics. We examined 30 persons - 10 patients with recurrent erysipelas, 10 - with pneumonia, and 10 healthy conscripts (ratio of men to women was 1:1 in each subgroup). Finally, significant beta-lactamase-like activity was revealed in blood plasma of both ill and healthy persons: both model antibiotics what have been added to plasma samples were mostly hydrolyzed for the time of incubation (20 minutes, 37 °C) - up to 69 % of total amount of ampicillin and up to 86 % of total amount of benzylpenicillin. The level of destruction of model antibiotics in all subgroups was reliably higher than the level of self-destruction of the same antibiotics in control samples (p < 0,00001). Thus, there is no doubts that some factor (or several factors) exists in blood of both patients and healthy persons what can dramatically increase the specific (on beta-lactam bond) hydrolysis of beta-lactam antibiotics.
Key words: «biological» antibiotics resistance, beta-lactamase activity, blood proteins, antibiotics of beta-lactam group.
Контактная информация:
Жильцов Иван Викторович - кандидат медицинских наук, доцент кафедры инфекционных болезней Витебского государственного медицинского университета
Адрес: 210023, Беларусь, г. Витебск, пр. Фрунзе, д. 73
Тел./факс +375 (212) 24-33-46
E-mail: [email protected]; [email protected]
Статья поступила 22.10.2008 г.
