CC BY
16
Клшшна nefliaipifl
УДК 616.33:616.98:579.882-036:612.398-053.2 ЗАВГОРОАНЯ Н.Ю.
Комунальний заклад «Мська дитяча клнчна л1карня № 1 Анпропетровсько'/ обласноi ради»
БЕТА-ДЕФЕНЗИНИ У ЛОКАЛЬНОМУ АНТИХЕЛкОБАКТЕРНОМУ ЗАХИСТ СЛИ3ОВО1 ОБОЛОНКИ ШЛУНКА В Д|ТЕЙ
Резюме. У cmammi наведет дат до^дження продукцн м^цевих факторiвуродженого мукозального за-хисту — бета-дефензитв при хротчних НР-асощйованих гастритах у дтей. Ключовi слова: хротчний гастрит, НР-шфекщя, бета-дефензини, дти.
Хелшобактерна шфекщя е одшею з найпоширеш-ших 6aKTepi^bHrn iнфекцiй людини, майже 50 % на-селення земно! Kyni е iнфiкованими Helicobacter pylori (HP) [1, 4]. Загальновизнаною е провщна роль НР у розвитку гастриту та виразково! хвороби [4, 5], а Мiж-народною агенцiею з вивчення раку Всесвгтньо! орга-нiзацii охорони здоров'я цей збудник визначений як канцероген I порядку на mдставi даних його зв'язку з розвитком аденокарциноми та МАЬТ^мфоми шлун-ка [3].
Колошзащя НР слизово! оболонки шлунку (СОШ) людини може вiдбуватися вже в ранньому дитячому вщ i, найiмовiрнiше, пов'язана iз внутршньородин-ною передачею збудника [12, 13, 15, 17, 19].
1нфшування штамами, що мютять у геномi ци-тотоксин-асоцiйований ген А (CagA — cytotoxin-associated gene А), за даними багатьох дослщжень, характеризуеться бшьш агресивним переб^ом захво-рювання, що е наслщком реалiзацii цитопатичних ефектiв транслокацп iмунодомiнантного протешу CagA HP в ештелюцити СОШ — перебудови цито-скелету, порушення щiльних мiжклiтинних сполу-чень, змш пролiферативного потенцiалу й полярнос-тi епiтелiоцитiв шлунка, активацп транскрипцшних факторiв та iндукцii синтезу прозапальних цитокiнiв [2, 6, 9, 10, 13, 14, 18, 21].
Ключовими компонентами системи вроджено-го захисту СОШ, що активуються негайно тсля контакту з патоген-асоцшованими молекулярними структурами HP i забезпечують безпосередню анти-бактерiальну дiю, е бета-дефензини — представники шмейства амфiфiльних, катiонних пептидiв iз молеку-лярною вагою 3—4 kDa, що мiстять багато цисте!но-вих залишкiв, стабiлiзованих трьома дисульфщними зв'язками в певну просторову структуру — антипа-ралельний бета-складчастий лист [1, 20]. Даш багатьох дослщжень свщчать, що бета-дефензини е також важливими елементами клiтинно-опосередкованого
адаптивного ÍMymTeTy, тобто мають здатнiсть залуча-ти до вогнища запалення ÍMyHHÍ клiтини, регулювати процеси вiдновлення [8, 16].
Дослщження на тваринних моделях та у кшшчних експериментах подтвердили значення НР-шдуковано! експресп бета-дефензину-2 (hBD2) у патогенезi за-пальних уражень шлунка та продемонстрували безпо-середню участь hBD2 в ефективному кшнгу НР [6, 7, 10, 22].
Метою нашого дослiдження було визначення ролi бета-дефензину-2 у механiзмах локального антихе-лiкобактерного захисту шляхом оцшки концентраций hBD2 у шлунковому вмюл залежно вiд CagA-статусу.
Матер1али
та методи досл1дження
Пiд спостереженням перебувало 79 пацieнтiв вь ком вщ 9 до 17 рокiв, хворих на хрошчний гастрит, якi лiкувалися в гастроентеролопчному вiддiленнi КЗ «Мюька дитяча ктшчна лiкарня № 1 ДОР» про-тягом 2009—2010 рр. Ушм пацieнтам була проведена фiброезофагогастродуоденоскопiя (Pentax FG15W, Япошя) зi швидким уреазним тестом (Хелпш-тест, ООО «АМА», Рошя, Санкт-Петербург). За наявностi H.pylori вс дослiджуванi пацieнти були роздiленi на 2 групи: НР-позитивш та НР-негативш. У свою чергу, НР-позитивнi пащенти за виявленням у сироватцi су-марних антитiл до цитотоксин-асоцiйованого гену А (CagA) НР були подшеш на CagA-позитивш та CagA-негативш. Таким чином, сукупнiсть НР-негативних спостережень склала контрольну групу. Данi розподшу пацieнтiв наведенi в табл. 1.
Визначення hBD2 у шлунковому вмюп проводили за методикою вестерн-блоту. Для видшення hBD2 зi зразтв шлункового соку використовували метод зво-ротнофазово'1 хроматограф^ iз застосуванням як рух-ливо'1 фази ацетонiтрилу (CH3CN), тдкисленого 0,05% трифтороцтовою кислотою до pH 2,5. Отримаш фрак-
f^zaoaoSiье ^ЛГ/рвМши
4(39) • 2012
Кл1'т'чна пед1'атр!я
Таблиця 1
Характеристика кшшчних даних Кiлькiсть випадкiв (n = 79) Вщсотки
Стать:
— хлопчики 48 60,8
— дiвчатка 31 39,2
Виявлення Н.руОп
НР-позитивш 51 64,6
CagA-позитивнi 32 40,5
CagA-негативнi 19 24,1
НР-негативнi
(контрольна група) 28 35,4
ци збирали, люфшьно висушували та розчиняли в мшь мальному об'eмi деюшзованоГ води (50 мкл) з наступ-ним проведенням електрофорезу отриманих зразюв у полiакриламiдному гелi з пiдготуванням проб за Лемль Пiсля електрофоретичного розд1лення та вщмивання проводили електроперенос б1лк1в на ттроцелюлозну мембрану протягом 18 год при напруженост поля 60 В. Для блокування сайтiв неспецифiчного зв'язування антитш нiтроцелюлозну мембрану iнкубували з розчи-ном 1% ембрюнально'Г сироватки протягом 1 години, тсля чого вщмивали РВ8-Т-буфером та iнкубували з моноклональними антит1лами (1нститут онкологи АМН, Украша), специфiчними до бета-дефензину-2 людини протягом 2,5 години [11]. Для вiзуалiзацil за допомогою реакци фотолюмшесценци в системi 1СЬ додавали антит1ла (кон'югат), мiченi пероксидазою хрону, та шкубували протягом 1 години. Для прояв-лення нiтроцелюлози використовували концентрат ЕСЬ. Проявляли блот, використовуючи рентгенiвську плiвку та стандартнi реактиви для проявлення рентге-нiвських плiвок (ОНИКО, Украша) (рис. 1).
Рисунок 1. Визначення hBD2 у вестерн-блот'г.
А) hBD2-позитивнi зразки; В) кал'брування рекомб1нантним hBD2
Статистична обробка отриманих даних проводи-лася в програмi SPSS Statistica 17.0. Для встановлення статистично значущих зв'язюв у випадку нормального розподшу даних використовувався параметричний t-критерш Стьюдента, у випадку в1дхилення вщ нормального розподшу — непараметричний U-критерш Манна — Уiтнi. Значущим вважався зв'язок при р t < 0,05.
-Tu.t. '
Результати та Ух обговорення
Середнiй вж пaцieнтiв основноi групи становив 13,47 ± 2,56 року, контрольноi — 14,32 ± 2,09 року. Вiрогiдну вiдмiннiсть за показником середнього вку мали лише CagA-негaтивнi пaцieнти (12,74 ± 2,51 року, pt = 0,032) (табл. 2).
Анaлiз вiковоi структури продемонстрував зрос-тання юлькосй випадк1в НР-aсоцiйовaноi пaтологГi шлунка з вжом за рахунок зб1льшення частки CagA-позитивних пaцieнтiв (рис. 2).
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
---- ------
42,3 38,9
¡23,1^
34,6
47,2
9—11 poKiB 12—14 poKiB 15-18роюв
□ HP- ■ CagA- ■ CagA+
Рисунок2. Вкова структура досл'1Джуванихгруп
У клшчнШ картинi хворих на хротчний НР-асоцiйований гастрит стутнь вираженостi больового й диспептичного синдромiв був вищим у груш Са£Л-позитивних пацieнтiв (табл. 3).
Продукц1я hBD2 епiтелiоцитами шлунка спостериа-лась як серед НР-позитивних, так i серед НР-негативних пацieнтiв, але частота зустрiчальностi ознаки була вiро-г1дно вищою в основнiй грут (ри < 0,05), що збиаеться з даними iнших авторiв та свщчить про iндуцибельнiсть продукци hBD2 та зв'язок Г! з НР-статусом [1, 9, 22]. Частота зус^чальносл виявлення hBD2 серед пащен-йв основноГ та контрольно! груп наведена на рис. 3.
Аналiзуючи середш рiвнi концентраци hBD2 у шлунковому вмiстi досл1джуваних пацiентiв, сл1д звер-нути увагу на значущi вщмшносй цього показника м1ж основною та контрольною групами (ри = 0,018). Крiм того, пацiенти, iнфiкованi Са£Л-позитивними шта-мами НР, характеризуються вiрогiдно вищими рiв-нями hBD2 порiвняно з НР-негативними пацiентами (ри = 0,017), тобто штами НР, що мютять Са£Л-ген, е б1льш потужними iндукторами синтезу hBD2, що шд-тверджуеться даними iнших досл1дник1в [10, 21]. Даш, що характеризують рiвнi hBD2, наведенi в табл. 4.
Таблиця 2. Середнй вiк па^ен^в дослджуваних груп
Дослщжуваш групи Кiлькiсть пацieнтiв Середнш BiK Вiрогiднiсть вiдмiнностей t-критер^ pt
НР-позитивы 51 13,47 ± 2,56 0,137
CagA+ 32 13,91 ± 2,53 0,5
CagA- 19 12,74 ± 2,51 0,023
НР-негативнi 28 14,32 ± 2,09
Клтт'чна педтатр!я
4(39) • 2012
Аналiзуючи BiKOBi особливостi продукцп hBD2, слщ вiдзначити зниження концентраций hBD2 у шлун-ковому BMicTi пацieнтiв 12—14 роыв незалежно вiд на-явност CagA-гену, що може свiдчити про певш BiKOBi особливостi реагування iмунноl системи у цьому вiцi (рис. 4).
Гендерш особливостi дослiджуваних груп характе-ризувалися вищими рiвнями hBD2 у хлопчикiв, шфь кованих CagA-позитивними штамами НР, але вщмш-ност не мали вiрогiдноl значущостi (pu = 0,194) (рис. 5).
Проведений аналiз зв'язку концентраций hBD2 з титрами специфiчних сумарних антиСagA-антитiл у си-роватцi CagA-позитивних пащенлв продемонстрував наявнiсть прямо пропорцшно! залежност мiж цими показниками, що зображена на рис. 6.
Таким чином, при дослщженш концентраций hBD2 у шлунковому вмiстi дiтей з НР-асоцшованою патологieю шлунка та ДПК з урахуванням наявнос-тi НР (НР-статуса) та CagA (CagA-статуса) було ви-
^Г 25,3
ш
■ L
Частота виявлення hBD2,%
■ CagA+ BCagA- ШИР-
9-11 рок1в
12-14 poKiB
15-18 poKiB
□ CagA+ ■ CagA- ■ HP-
Рисунок 3. Частота зустр'чальност; виявлення Рисунок 4. Шкот особтюсп рюню hBD2
hBD2 в дослджуваних групах залежно вд Нр- та садА-статус,в
Таблиця 3. Кл1н1чн1 особливост НР-асоцйованих гастритв удтей
Кл^чш прояви CagA+ (n = 32) CagA- (n = 19) НР- (n = 28)
Бть у животк
помфний 52,5 ± 1,5 54,0 ± 2,4 60,0 ± 1,3
виражений 36,5 ± 2,6* 22,0 ± 2,7 20,0 ± 1,5
Болючють при пальпацп живота:
помфна 72,1 ± 1,4 63,2 ± 3,3 70,0 ± 1,6
виражена 25,3 ± 2,2* 14,2 ± 2,6 10,0 ± 1,2
Нудота, блювота 67,4 ± 2,6* 49,3 ± 2,4 49,2 ± 1,3
Печт 74,9 ± 3,2 69,9 ± 1,2 45,3 ± 1,8
Вщрижка:
кислим 54,6 ± 1,9* 38,8 ± 2,8 32,2 ± 1,5
прким 32,2 ± 4,5 29,7 ± 3,2 30,0 ± 2,1
пов^рям 6,5 ± 1,2 8,3 ± 2,1 6,1 ± 1,2
Пщвищена стомлюванють, млявють 75,2 ± 2,7 64,7 ± 2,7 70,0 ± 1,6
Головний бiль, запаморочення 67,5 ± 2,5 56,7 ± 1,4 60,3 ± 1,8
Примтка: * — ри < 0,05.
Таблиця 4. Характеристика продукцИ' бета-дефензину-2 при НР-асоцйованй патологи шлунка
залежно вд НР- та СадА-статуЫв
Характеристика кл^чних даних пацieнтiв Кiлькiсть випадкiв Концентращя hBD2, мкг/мл Вiрогiднiсть вiдмiнностей за критерieм Манна — Уíтнi, pu
НР-позитивнi 31 0,37 ± 0,07* 0,0181,
CagA-позитивнi 20 0,41 ± 0,09* 0,0171, 0,7412
CagA-негативнi 11 0,30 ± 0,08 0,062
НР-негативнi 5 0,06 ± 0,01
Примтки: * — статистично в1рогщним зв'язок вважався при ри < 0,05, ри1 — пор1вняно з групою НР-негативних пац1ент1в, ри2 — пор1вняно з групою СадА-негативних НР-асоцйованих пац1ент1в.
32
(^¿^рвИши
4(39) • 2012
Клтт'чна пед!атр!я
%
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
0,06
А
0,31
0,229
^0,055
0,283
0,529
Дщчата
Хлопчики
■ HP- BCagA- mCagA+
Рисунок 5. Гэндерн особливост piBHiB hBD2 в залежност вд НР- та CagA-CTarydB
явлено статистично значущi вщмшносл CagA+НР-позитивних та НР-негативних пащенлв стосовно частоти виявлення hBD2 (pu < 0,05 ), а також порiвня-но 3i значеннями середшх рiвнiв концентрацп hBD2 основно! та контрольно! груп (ри = 0,018), анало-гiчна тенденцiя спостерiгалась при порiвняннi CagA-позитивних пацiентiв i3 контрольною групою (рп = 0,017). Вiрогiднiсть зниження концентрацп hBD2 у шлунковому вмiстi пацiентiв 12—14 рокiв по-рiвняно з пацiентами iнших втэвих груп також була пiдтверджена статистично. Була виявлена залежшсть мiж рiвнями hBD2 у шлунковому вмiстi та титром су-марних антиСagA-антитiл у сироватщ.
Висновки
1. Стан локального мукозального захисту СОШ при хрошчних НР-асоцiйованих гастритах у дiтей характеризуемся розвитком iмунозапальних реакцiй як на не-специфiчному, так i на специфiчному рiвнях.
2. Характерною особливютю змiн локального iмунi-тету СОШ е продукщя антимiкробних проте'!шв hBD2, що е максимально вираженою у CagA+НР-позитивних пацiентiв.
3. Наявшсть зв'язку мiж рiвнями hBD2 та антиСagA-антитiл у сироватцi е шдтвердженням ролi hBD2 у ме-ханiзмах взаемодп неспецифiчно! та адаптивно! ланок iмунiтету.
Подяка
Автор висловлюе щиру вдячнiсть д.м.н, професору П.В. По^бному (1нститут експериментально! патоло-ril, онкологи та радiобiологi! iм. Р.Е. Кавецького Нащ-онально! академп наук Укра!ни) за квалiфiковану до-помогу у проведенш вестерн-блот-аналiзу.
Список л1тератури
1. Дефензины и дефензин-зависимые заболевания [Текст] / А.Е. Абатуров, О.Н. Герасименко И.Л. Высочина и др. — Одесса: Издательство ВМВ, 2011. — 265 с.
2. A global overview of the genetic and functional diversity in the Helicobacter pylori cag pathogenicity island [Text] / P. Olbermann, C. Josenhans, Y. Moodley [et al.] // PLoS Genet. — 2010. — Vol. 16, № 8.
Рисунок 6. Залежшсть концентраци hBD2 вд титру антиСадА-антитт у rpyni CagA-позитивних пащенлв
3. Amieva M.R. Helicobacter pylori. Взаимодействие хозяина и инфекции [Text] / Amieva M.R., El-Omar E.M.//Клиническая гастроэнтерология и гепатология. Украинское издание. — 2008. — Т. 1, № 2. — С. 91-107.
4. Atherton J.C. Coadaptation of Helicobacter pylori and humans: ancient history, modern implications [Text] / Atherton J.C., Blaser M.J. // J. Clin. Invest. — 2009. — Vol. 119, № 9. — P. 2475-87.
5. Consequences of Helicobacter pylori infection in children [Text] / Pacifico L., Anania C, Osborn J.F. [et al.] // World J. Gastroenterol. — 2010. — Vol. 16, № 41. — P. 5181-5194.
6. Douraghi M. Immune responses to Helicobacter pylori infection in children with intellectual disabilities [Text] / Douraghi M., Goudarzi H., Nateghi Rostami M. [et al.] // Res. Dev. Disabil. — 2012. — Vol. 33, № 2. — P. 663-9.
7. Grubman A. The innate immune molecule, NOD1, regulates direct killing of Helicobacter pylori by antimicrobial peptides [Text]/ Grubman A., Kaparakis M, Viala J. [et al.] // Cell. Microbiol. — 2010. — Vol. 12, № 5. — P. 626-39.
8. Helicobacter pylori dampens gut epithelial self-renewal by inhibiting apoptosis, a bacterial strategy to enhance colonization of the stomach [Text]/H. Mimuro, T. Suzuki, S. Nagai[et al.]// Cell. Host Microbe. — 2007. — Vol. 2, № 4. — P. 250-263.
9. Helicobacter pylori induces an antimicrobial response in rhesus macaques in a cag pathogenicity island-dependent manner [Text] / Hornsby M.J., Huff J.L., Kays R.J. [et al.] // Gastroenterology. —
2008. — Vol. 134, № 4. — P. 1049-1057.
10. James R. Rick In situ expression of cagA and risk of gastroduodenal disease in Helicobacter pylori infected children [Text] / James R. Rick, Matthew Goldman, Cristina Semino-Mora [et al.]// J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. — 2010. — Vol. 50, № 2. — P. 167-172.
11. Markeeva N. Expression of beta-defensin-2 in human gastric tumors: a pilot study [Text]/Markeeva N., Lisovskiy I., Lyzogubov V. [et al.]//Exp. Oncol. — 2005. — Vol. 27, № 2. — P. 130-5.
12. McMillan M. Intrafamilial Genotyping of Helicobacter pylori from Faecal DNA [Text] / McMillan M., Mackay W.G., Williams C.L. [et al.] // Gastroenterol. Res. Pract. — 2011. — Vol. 17, № 1.
13. Mourad-Baars P. Helicobacter pylori infection and childhood [Text]/Mourad-Baars P., Hussey S., Jones N.L. //Helicobacter. — 2010. — Vol. 15, S. 1. — P. 53-59.
14. Murata-Kamiya N. Pathophysiological functions of the CagA oncoprotein during infection by Helicobacter pylori [Text]// Microbes Infect. — 2011. — Vol. 13, № 10. — P. 799-807.
15. Okuda M. Helicobacter pylori infection in childhood [Text] / Okuda M., Fukuda Y.//Nihon Rinsho. — 2009. — Vol. 67, № 12. — P. 2239-44.
16. Pediatric Helicobacter pylori isolates display distinct gene coding capacities and virulence gene marker profiles [Text] / Talarico S., Gold B.D., Fero J. [et al.] // J. Clin. Microbiol. —
2009. — Vol. 47, № 6. — P. 1680-1688.
17. Queiroz D.M. Natural History of Helicobacter pylori infection in childhood: eight-year follow-up cohort study in an urban community
Кл1'т'чна пед!'атр!'я
4(39) • 2012
in northeast of Brazil [Text] / Queiroz D.M., Carneiro J.G., Braga-Neto M.B. [et al.] // Helicobacter. - 2012. - Vol. 17, № 1. -P. 23-9.
18. Tan S. Helicobacter pylori usurps cell polarity to turn the cell surface into a replicative niche [Text]/ Tan S., Tompkins L.S., Amieva M.R.. // PLoS Pathog. - 2009. - Vol. 5, № 5.
19. Tutar E. Endoscopic and histopathologic findings associated with H. pylori infection in very young children [Text] // Dig. Dis. Sci. - 2009. - Vol. 54, № 1. - P. 111-7.
20. Underwood M.A. Defensin-barbed innate immunity: clinical associations in the pediatric population [Text] / Underwood M.A., Bevins C.L. //Pediatrics. - 2010. - Vol. 125, № 6. -P. 1237-1247.
21. Vitoriano I. Ulcerogenic Helicobacter pylori strains isolated from children: a contribution to get insight into the virulence of the bacteria [Text] / Vitoriano I., Saraiva-Pava K.D., Rocha-Gongalves A [et al.] // PLoS One. - 2011. - Vol. 6, № 10. -P. 262-65.
22. Vordenbäumen S. Defensin-mRNA expression in the upper gastrointestinal tract is modulated in children with celiac disease and Helicobacter pylori-positive gastritis [Text]/ Vordenbäumen S., Pilic D., Otte [et al.] // J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. — 2010. — Vol. 50, № 6. — P. 596-600.
Отримано 02.04.11 □
Зaвгoрoдняя Н.Ю.
Koммyнaльнoe yчрeждeниe «Гoрoдcкaя дeтcкaя клини-чecкaя бoльницa № 1 Aнeпрoпeтрoвcкoгo oблacтнoгo coвeтa»
БETA-ДEФEHЗИHЫ В ЛOKAЛЬHOЙ AHTИXEЛИKOБAKTEPHOЙ ЗAЩИTE СЛИЗИСТОЙ OБOЛOЧKИ ЖEЛУДKA Y ДETEЙ
Резюме. В статье пpедстaвлены дaнные исследовa-ния ^одущии местный неспецифическж зaщитныx фaктоpов — бетa-дефензинов щи xpоническиx HP-aссоцииpовaнныx гaстpитax у детей.
Ключевые слова: xpонический гaстpит, HP-инфекция, бетa-дефензины, дети.
Zavgorodnya N.Yu.
Municipal Institution «City Children's Clinical Hospital № 1 of Dnipropetrovsk Regional Council», Dnipropetrovsk, Ukraine
BETA-DEFENSINS IN LOCAL ANTIHELICOBACTER DEFENSE OF GASTRIC MUCOSA IN CHILDREN
Summary. In the article there are presented the findings of investigation of production of local non-specific protective factors — beta-defensins in chronic Hp-associated gastritis in children.
Key words: chronic gastritis, HP-infection, beta-defensins, children.
з4
