CC BY
179
Запрошен статт
Guest Articles
почки
НИРКИ KIDNEYS
УДК 616.61-036.1-006.327:612.398 DOI: 10.22141/2307-1257.6.3.2017.109027
Мельник А.А.
Специализированный медицинский центр «Оптима-фарм», г. Киев, Украина
Белок Klotho и фактор роста фибробластов FGF23 как маркеры хронической болезни почек
For cite: Pochki. 2017;6:132-8. doi: 10.22141/2307-1257.6.3.2017.109027
Резюме. Хроническая болезнь почек (ХБП) является глобальной проблемой общественного здравоохранения в мире. Исследования ученых направлены на поиски новых биомаркеров ХБП. Такими биомаркерами являются растворимый белок a-Klotho и фактор роста фибробластов FGF23. Показано, что экспрессия белка Klotho уменьшается параллельно с прогрессированием ХБП и достигает низких или неопределяемых значений в терминальной стадии заболевания почек. В отличие от Klotho фактор роста фибробластов FGF23 повышается на ранних стадиях ХБП и служит предиктором неблагоприятного клинического исхода. Уровни белка Klotho и FGF23 являются ранними, чувствительными и специфичными биомаркерами при ХБП и имеют диагностичеакую ценность для прогнозирования осложнений при заболевании почек.
Ключевые слова: хроническая болезнь почек; белок a-Klotho; фактор роста фибробластов FGF23; метод ELISA
Неинфекционные заболевания, к которым относится хроническая болезнь почек (ХБП), являются наиболее распространенными причинами заболеваемости и преждевременной смерти. ХБП считается глобальной проблемой общественного здравоохранения в мире. Широкая распространенность ХБП среди населения (более 10 %) приводит к утрате трудоспособности, сердечно-сосудистым осложнениям и смертности из-за развития терминальной почечной недостаточности [1, 2]. В последние годы внимание исследователей привлечено к новым биомаркерам ХБП. Этими маркерами являются белок Klotho и фактор роста фибробластов (Fibroblast Growth Factor — FGF23), которые принимают участие в метаболизме фосфата, кальция и витамина D при ХБП.
Белок Klotho
Ген белка Klotho был идентифицирован Kuro-o и др. [3] в 1997 г. при изучении трансгенных мышей, экспрессирующих натрий-протонный обменник. Японскими исследователями случайно был поврежден локус соседнего гена, и мыши (Klotho —/—) показали поразительный феномен, напоминающий
старение человека, что проявлялось замедлением роста, гипогонадизмом, атрофией кожи, тимуса, кальцификацией сосудов и мягких тканей, остео-порозом, легочной эмфиземой и короткой продолжительностью жизни. Наоборот, избыточная экспрессия Klotho у мышей приводила к увеличению продолжительности жизни. Поэтому Klotho считается антивозрастным геном [4] (рис. 1).
Название гена Klotho происходит от греческой богини Клото (дочери Зевса). В греческой мифологии богини Клото, Лахесис и Атропос, контролируя нить жизни, определяли, какой будет длительность жизни каждого смертного. При этом они соответственно пряли, измеряли и обрезали нити жизни. Белок Klotho имеет молекулярный вес ~ 130 кДа и состоит из 1014 аминокислот, имеет сигнальную последовательность на N-конце и трансмембранный домен с коротким цитоплазматическим доменом на С-конце. Внеклеточный домен Klotho состоит их 2 внутренних повторов (KL1 and KL2) гомологичных последовательностей р-глюкозидазы [5] (рис. 2).
В геноме млекопитающих идентифицировали 3 члена семейства Klotho, являющихся транс мембранными белками различной длины (рис. 3). Рас-
© «Почки», 2017 © «Kidneys», 2017
© Издатель Заславский А.Ю., 2017 © Publisher Zaslavsky O.Yu., 2017
Для корреспонденции: Мельник Александр Александрович, кандидат биологических наук, руководитель проекта, специализированный медицинский центр «Оптима-фарм», г. Киев, Украина; e-mail: [email protected]
For correspondence: Oleksandr Melnyk, PhD, project manager, Specialized medical center "Optima-pharm'; Kyiv, Ukraine; e-mail: [email protected]
творимые формы а-Ыotho могут быть получены протеолитическим расщеплением трансмембранной формы р-секретазами.
Белок Klotho экспрессируется во многих тканях, но особенно в больших количествах в почках. Выраженная экспрессия Klotho обнаружена в дистальных и проксимальных канальцах почек, а также в эпителиальных клетках паращитовидных желез [6]. Мембранная форма является корецептором для FGF23, индуцирует отрицательный фосфатный баланс путем стимулирования экскреции почечного фосфата и снижения уровня сывороточного дигидроксиви-тамина D3 (1,25(ОН),^03). Кроме мембранной формы, существует экстрацеллюлярная форма белка Klotho, которая образуется посредством секретазы, а также сплайсинга и высвобождается во внеклеточное пространство, где функционирует как эндокринный фактор. Растворимая форма белка Klotho
и
Рисунок 1. Мыши Klotho (-/-) и Klotho (+/+)
Рисунок 2. Схема структуры белка Klotho
играет важную роль в различных процессах организма, включая транспорт ионов, трансдукции сигнала, участвует в регуляции метаболизма кальция, паратиреоидного гормона (РТН) и др. Растворимая форма белка Klotho находится в крови, моче и спинномозговой жидкости [7] (рис. 4).
Функции, физиологические процессы и заболевания, связанные с белком Klotho в организме человека, представлены в табл. 1.
На снижение экспрессии белка Klotho при ХБП/ терминальной стадии почечной недостаточности влияют многие потенциальные факторы, в том числе снижение массы почек, сверхпродуцирование провоспалительных цитокинов, таких как фактор некроза опухолей (TNF) и интерферона (INF), дис-липидемия и гипергликемия, повышение уремического токсина (индоксил сульфата), окислительный стресс. Дефицит Klotho стимулирует синтез FGF23, уровень которого повышается с увеличением фосфата крови. Высокий уровень FGF23 в крови подавляет синтез 1,25(ОН)2VD3, что еще больше способствует ингибированию Klotho. Снижение уровня 1,25(ОН)2VD3 не только уменьшает экспрессию Klotho, но и стимулирует ренин-ангиотензиновую систему, которая подавляет продуцирование Klotho, что приводит к уменьшению экскреции фосфата с мочой (рис. 5).
Факторы роста фибробластов
Факторы роста фибробластов представляют собой большое суперсемейство пептидов, которые оказывают плейотропное воздействие на широкий диапазон биологических процессов, включая эмбриональное развитие, органогенез и метаболизм веществ через связывание и активацию FGF-рецептора (FGFR) [9, 10]. Факторы роста фибробластов продуцируются фибробластами, хон-
Рисунок 3. Семейство белков Klotho (a-Klotho, ß-Klotho и y-Klotho)
Рисунок 4. Мембраносвязанный КШЬо (тКЦ может быть расщеплен на поверхности клетки
секретазами с образованием растворимого Klotho (сКЦ. Другая форма растворимого КШЬо (эКЦ образуется посредством альтернативного сплайсинга экзоном 3
дроцитами, кератиноцитами, эндотелиальными, гладкомышечными, тучными, глиальными клетками и стимулируют их пролиферацию. У человека идентифицировано 22 члена фактора роста фибро-бластов, состоящие из 7 субсемейств (рис. 6).
Субсемейство БОР19 состоит из БОР19, БОР21 и БОР23 [10]. Эти факторы роста фибробластов оказывают свою специфическую физиологическую активность в регуляции энергии и минерального обмена как эндокринные факторы или гормоны [11]. РОБ15/19, РОБ21 и РОБ23 экспрессируются в основном в тонком кишечнике, печени и костях (рис. 7).
Уникальной структурной особенностью данных эндокринных БОБ является отсутствие гепарин -связывающего домена, который присутствует во всех паракринных/аутокринных БОБ. Этот гепа-рин-связывающий домен является важным для функционирования БОБ по двум причинам. Во-первых, при связывании гепарин-сульфата (НБ) во внеклеточном матриксе он уменьшает секрецию БОБ и увеличивает их локальную концентрацию. Во-вторых, НБ активирует рецептор ОБО для образования комплекса НБ : ОБО : ОБОЯ (2 : 2 : 2). В эндокринных ОБО вместо гепарин-сульфата функционирует белок К1оШо.
Р0Р23
Ген БОР23 расположен на 12-й хромосоме и состоит из 3 экзонов, кодирующих белок, состоящий из 251 аминокислоты (рис. 8). БОР23 имеет молекулярный вес 32 кДа и продуцируется остеоцитами и остеобластами кости.
Белок БОР23 содержит сигнальный пептид, состоящий из 24 аминокислот, 154-аминокислотный М-терминальный пептид и С-терминальный рецептор, состоящий из 73 аминокислот. После отщепления 24-аминокислотной сигнальной последовательности белок 2ТОР23251 секретируется в кровь. В кровотоке белок ОБО23 циркулирует в двух разных формах: полноразмерной зрелой форме—2ТОР23251 и более короткой — 2ТОР23179, не обладающей уникальной 73-аминокислотной последовательностью. Активной является только полная форма БОР23, так как С-терминальный домен необходим для вза-
Рисунок 5. Механизм и патофизиология дефицита белка Klotho при ХБП
Рисунок 6. Филогенетическое дерево человеческого FGF. Длины ветвей представляют собой эволюционное расстояние между каждым геном (серый цвет — паракрин-/аутокринные субсемейства, голубой цвет — субсемейство FGF11 внутриклеточных медиаторов, которые
работают независимо от рецепторов FGF, розовый цвет представляет собой эндокринное субсемейство)
Таблица 1. Функции, физиологические процессы и заболевания, связанные с белком Klotho
Функции Физиологические процессы Заболевания
Адипогенез Контроль артериального давления Атеросклероз
Ангиогенез Регулирование минеральной плотности костей Рак молочной железы
Эффект антистарения Метаболизм глюкозы Болезнь коронарных артерий
Антиоксидантный эффект Регулирование уровней общего холестерина, холестерина липопро-теинов высокой и низкой плотности Ишемический инсульт
Кальциевый обмен Почечнокаменная болезнь
Кофактор FGF23 Смертность пациентов на гемодиализе
Метаболизм глюкозы Остеоартрит
Инсулиновая сигнальная система Рахит
Метаболизм фосфата Серповидноклеточная анемия
Метаболизм калия Опухолевый кальциноз
имодействия с кофактором а-Klotho и последующей активацией рецептора FGF [12] (рис. 9).
Рецепторы GFGR (синий цвет) имеют три им-муноглобулиноподобных домена (D1, D2, D3), которые стабилизированы внутренними дисульфид-ными мостиками. Гепаринсвязывающая область показана фиолетовым цветом. Для эндокринных FGF-лигандов корецептор гепарин-сульфата заменен на Klotho. а-Klotho формирует комплексы с FGFR1c, FGFR3c, FGFR4 и служит в качестве высокоаффинного рецептора для FGF23. Лигандсвя-зывающая область (зеленый цвет) взаимодействует с С-терминальным концом FGF23. Белок Klotho имеет небольшую внутриклеточную область, тогда как FGFR обладает двумя киназными доменами, которые поддерживают передачу сигнала.
Физиологическая роль РЭР23
Основная физиологическая функция FGF23 заключается в регуляции метаболизма фосфата, витамина D и паратиреоидного гормона (PTH). Последствиями избыточного содержания FGF23 являются гипофосфатемия, изменение метаболизма витамина D, нарушение роста и остеомаляция [13]. И наоборот, снижение уровня FGF23 приводит к гипер-фосфатемии, избытку 1,25^^^ и кальцификации мягких тканей [14]. В физиологических условиях FGF23 контролирует экскрецию фосфатов почками
в соответствии с потребностями организма. Кроме того, FGF23 влияет на витамин D путем ингиби-рования 1-а-гидроксилазы, которая превращает 25(ОН^ в активную форму 1,25(ОН)^. Увеличение 1,25(ОН)2D способствует поглощению кальция и фосфата в желудочно-кишечном тракте. Прирост концентрации кальция вместе с 1,25(ОН)2D влияет на паращитовидную железу. При этом подавляется действие РТН и увеличивается экскреция кальция с мочой.
Белок К!о№о как корецептор РЭР23
В отличие от большинства факторов роста фиб-робластов у FGF23 отсутствует гепарин-сульфат -связывающий центр, поэтому FGF23 имеет низкую аффинность к рецепторам FGF. В 2006 г. группа ученых из Японии идентифицировала mKL как особый кофактор для сигнализации FGF23, позволяющий высокоаффинно связываться с рецепторами FGF1c, -3^ -4с с последующим активированием пути MAПK (митогенактивированные протеинки-назы) [18] (рис. 10).
Сигналымй Ы-тармимальиый пеглца. ВШИ"' С ■ <.■-.■■■ ттс..:
пентод гомопогичяаи область ■■ юща 061
" П1 I вв I с
1 24 25 175100 251
Рисунок 8. Структура ГйГ23
Рисунок 7. Экспрессия ГйГ15/19, ГйГ21 и ГйГ23 из различных органов
Белок Klotho и FGF23 при ХБП
Изменения концентрации белка Klotho (снижение) и FGF23 (повышение) начинаются уже со II—III стадии ХБП и являются более ранними маркерами прогрессирования данного заболевания в отличие от уровней PTH и фосфата [20] (рис. 11).
Определение растворимого белка Klotho и FGF23 применяют для диагностики ХБП. Y. Shima-mura и др. показали, что Klotho постепенно снижается на ранних стадиях ХБП с уменьшением скорости клубочковой фильтрации [21]. При этом одновременно происходит увеличение FGF23 [22], а при достижении конечной стадии почечной недостаточности концентрация FGF23 в несколько десятков раз превышает норму [23] (рис. 12).
Методы определения белка Klotho и FGF23
1. Белок Klotho
Коммерчески доступным набором для определения концентрации растворимого белка Klotho является Human soluble a-Klotho Assay Kit от компании IBL International GmbH (Германия). В наборе применяется твердофазный сэндвич-метод ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) с использованием двух видов высокоспецифических антител. Определение растворимого a-Klotho осуществляется в сыворотке или плазме, область определения — 93,75—6000 пг/мл, чувствительность — 6,15 пг/мл.
Пример стандартной кривой показан на рис. 13.
Рисунок 9. Комплекс «<белок a-Klotho — GFG»
2. FGF23
Для определения концентрации FGF23 используется набор Human FGF23 ELISA Kit от компании LifeSpan Biosciences (США). В качестве образцов могут использоваться сыворотка, моча, суперна-тант культуры клеток, гомогенат клеток. Область
FGF23 mKL
Рисунок 10. Интактный FGF23 связывает рецепторный комплекс, состоящий из белка Klotho и димерного рецептора FGF
* 1 2 3 4 5
Стадии ХБП
Рисунок 11. Изменение концентрации Klotho и FGF23 при различных стадиях ХБП
Рисунок 12. Временной профиль изменений в крови белка Klotho и ГйГ23 при ХБП в зависимости от скорости клубочковой фильтрации
Рисунок 13. Стандартная кривая зависимости концентрации белка К^^ от оптической плотности
Рисунок 14. График кривой для определения ГйГ23 в сыворотке крови человека
определения — 3,12—200 пг/мл, чувствительность — 0,78 пг/мл. Типичный график кривой представлен на рис. 14.
Выводы
1. При хронической болезни почек происходят снижение белка Klotho и повышение GFG23.
2. Уровни белка Klotho и FGF23 являются ранними, чувствительными и специфичными диагностическими биомаркерами при хронической болезни почек.
3. Белок Klotho и FGF23 имеют диагностическую ценность для прогнозирования прогрессиро-вания осложнений при заболевании почек.
Конфликт интересов. Автор заявляет об отсутствии какого-либо конфликта интересов при подготовке данной статьи.
References
1. Levey AS, Atkins R, Coresh J, et al. Chronic kidney disease as a global public health problem: approaches and initiatives - a position statement from Kidney Disease Improving Global Outcomes. Kidney Int. 2007;72:247-59. doi:10.1038/ sj.ki.5002343.
2. Couser WG, Remuzzi G, Mendis S, Tonelli M. The contribution of chronic kidney disease to the global burden of major noncommunicable diseases. Kidney Int. 2011 Dec;80(12):1258-70. doi: 10.1038/ki.2011.368.
3. Kuro-o M, Matsumura Y, Aizawa H, et al. Mutation of the mouse klotho gene leads to a synd-rome resembling ageing. Nature 1997;390(6555):45-51. doi:10.1038/36285.
4. Kurosu H, Yamamoto M, Clark JD, et al. Suppression of aging in mice by the hormone Klotho. Science. 2005;309:1829-33. doi:10.1126/science.1112766.
5. Nabeshima Y. The discovery of a-Klotho and FGF23 unveiled new insight into calcium and phosphate homeostasis. Cell Mol Life Sci. 2008 0ct;65(20):3218-30. doi: 10.1007/s00018-008-8177-0.
6. Forster RE, Jurutka PW, Hsieh JC, et al. Vitamin D receptor controls expression of the anti-aging klotho gene in mouse and human renal cells. Biochem Biophys Res Commun. 2011 Oct 28;414(3):557-62. doi: 10.1016/j.bbrc.2011.09.117.
7. Hu MC, Shi M, Zhang J, et al. Klotho: a novelphosphatu-ric substance acting as an autocrine enzyme in the renal proximal tubule. FASEB J. 2010 Sep;24(9):3438-50. doi: 10.1096/fj.10-154765.
8. Eswarakumar VP, Lax I, Schlessinger J. Cellular signaling by fibroblast growth factor receptors. Cytokine Growth Factor Rev. 2005;16:139-49. doi: 10.1016/j.cytogfr.2005.01.001.
9. Mohammadi M, Olsen SK, Ibrahimi OA. Structural basis for fibroblast growth factor receptor activation. Cytokine Growth Factor Rev. 2005;16(2):107—37. doi: 10.1016/j.cytogfr.2005.01.008.
10. Beenken A, Mohammadi M. The structural biology of the FGF19 subfamily. Adv Exp Med Biol. 2012;728:1-24. doi: 10.1007/978-1-4614-0887-1 1.
11. Kuro-o M. Endocrine FGFs and Klothos. Austin, TX/New York: Landes Biosci./Springer. 2012. 233pp.
12. Goetz R, Beenken A, Ibrahimi OA, et al. Molecular insights into the klotho depen-dent, endocrine mode of action of
fibroblast growth factor 19 subfamily members. Mol Cell Biol. 2007;27:3417-28. doi: 10.1128/MCB.02249-06.
13. Fukumoto S, Yamashita T. Fibroblast growth factor-23 is the phosphaturic factor in tumor-induced osteomalacia and may bephosphatonin. CurrOpin Nephrol Hypertens. 2002;11(4):385-9. PMID: 12105387.
14. Shimada T, Kakitani M, Yamazaki Y, et al. Targeted ablation of Fgf23 demonstrates an essential physiological role of FGF23 in phosphate and vitamin D metabolism. J Clin Invest. 2004;113(4):561-8. doi: 10.1172/JCI19081.
15. Komaba H, Fukagawa M. FGF23: a key player in mineral and bone disorder in CKD Nefrologia. 2009;29(5):392-396. doi:10.3265/Nefrologia.2009.29.5.5400.en.full.
16. Martin A, David V, Quarles LD. Regulation and function of the FGF23/Klotho endocrine pathways. Physiol Rev. 2012;92:131-55. doi: 10.1152/physrev.00002.2011.
17. Memon F, El-Abbadi M, Nakatani T. Does Fgf23- klotho activity influence vascular and soft tissue calcification through regulating mineral ion metabolism? Kidney Int. 2008 Sep;74(5):566-70. doi: 10.1038/ki.2008.218.
18. Urakawa I, Yamazaki Y, Shimada T, et al. Klotho converts canonical FGF receptor into a specific receptor for FGF23. Nature 2006;444:770-4. doi: 10.1038/nature05315.
19. Ichikawa S, Imel EA, Kreiter ML, et al. A homozygous missense mutation in human KLOTHO causes severe tumoral calcinosis. J Clin Invest 2007;117:2684-91. doi: 10.1172/JCI31330.
20. Hu MC, Kuro-o M, Moe OW. Klotho and Chronic Kidney Disease. Contrib Nephrol. 2013;180:47-63. doi: 10.1159/000346778.
21. Shimamura Y, Hamada K, Inoue K, et al. Serum levels of soluble secreted a-Klotho are decreased in the early stages of chronic kidney disease, making it a probable novel biomarker for early diagnosis. Clin Exp Nephrol. 2012 Oct;16(5):722-9. doi: 10.1007/s10157-012-0621-7.
22. Kuro-o M. Klotho in chronic kidney disease — What's new? Nephrol Dial Transplant. 2009 Jun;24(6):1705-8. doi: 10.1093/ndt/gfp069.
23. WolfM. Update onfibroblast growthfactor 23in chronic kidney disease. Kidney Int. 2012;82(7):737-47. doi: 10.1038/ki.2012.176.
Получено 12.06.2017 ■
Мельник О.О.
Спецiалiзований медичний центр «Оптима-фарм», м. КИв, Украна
BiAOK Klotho i фактор росту фiбробластiв Резюме. Хрошчна хвороба нирок (ХХН) е глобальною проблемою громадсько! охорони здоров'я у свт. Досль дження вчених спрямоваш на пошуки нових бiомаркерiв ХХН. Такими бюмаркерами е розчинний бшок a-Klotho i фактор росту фiбробластiв FGF23. Показано, що екс-прес1я бшка Klotho зменшуеться паралельно з прогресу-ванням ХХН i досягае низьких або невизначених значень у термшальнш стади захворювання нирок. На вщмшу вщ
FGF23 як маркери хрошчноТ хвороби нирок
Klotho фактор росту фiбробластiв FGF23 пщвищуеться на ранн1х стад1ях ХХН i служить предиктором несприятливо-го клшчного результату. Pîbhî бшка Klotho i FGF23 е ран-шми, чутливими i специфiчними бюмаркерами при ХХН i мають дiагностичну цшнють для прогнозування усклад-нень при захворюванш нирок.
K™40BÎ слова: хрошчна хвороба нирок; бшок a-Klotho; фактор росту фiбробластiв FGF23; метод ELISA
A.A. Melnik
Specialized Medical Center "Optima-Pharm", Kyiv, Ukraine
Protein Klotho and FGF23 fibroblasts growth
Abstract. Chronic kidney disease (CKD) is a global public health problem in the world. Research scientists are aimed at finding new biomarkers for CKD. Such biomarkers are a-Klotho soluble protein and fibroblast growth factor (FGF23). It was shown that the expression of Klotho protein decreases progressively as the progression of CKD and reaches low or undetectable values at the terminal stage of kidney disease. Un-
factor as markers of chronic renal disease
like Klotho, FGF23 fibroblast growth factor increases in the early stages of CKD and serves as a predictor of an unfavorable clinical outcome. Klotho and FGF23 protein levels are early, sensitive and specific diagnostic biomarkers in CKD and are of diagnostic value for predicting complications of kidney disease. Keywords: chronic kidney disease; a-Klotho protein; FGF23 fibroblast growth factor; ELISA
