CC BY
68
Серия «Биология. Экология»
2008. Т. 1, № 1. С. 29-33 Онлайн-доступ к журналу: http://isu. ru/izvestia
И З В Е С Т И Я
Иркутского
государственного
университета
УДК 579.873.13:579.234
Белковый и аминокислотный состав клеточной стенки Bifidobacterium bifidum I
12 2 Г. В. Юринова , С. В. Осипова , А. В. Пермяков , А. М. Собенин2, С. М. Попкова3, С. И. Лещук3
1 Иркутский государственный университет, Иркутск
2 Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН, Иркутск
3 Институт эпидемиологии и микробиологии ГУ НЦМЭ ВСНЦ СО РАМН E-mail: yurinova@yandex.ru
Аннотация. Изучен белковый и аминокислотный состав клеточной стенки бифидобактерий (штамм Bifidobacterium bifidum I). Показано, что клеточная поверхность представлена обширной группой гетерогенных белков, которые могут участвовать в процессе специфической адгезии. Аминокислоты образца клеточной стенки бифидобактерий могут участвовать как в структурообразовании белковых и гликопептидных единиц клеточной стенки, так и в формировании зон гидрофобности и заряда бактериальной поверхности, ответственной за адгезию.
Ключевые слова: клеточная стенка бифидобактерий, аминокислоты, белки, гидрофобность и заряд клеточной поверхности.
Бифидобактериии являются наиболее значимыми представителями нормальной микрофлоры человека всех возрастов - как по удельному весу в составе микробиоценозов, так и по их многофункциональной роли в поддержании гомеостаза макроорганизма.
По данным литературы биологическая активность бифидобактерий во многом определяется компонентами клеточной стенки - пеп-тидогликаном и связанными с ним гликопротеинами, внеклеточными полисахаридами, фосфо- и гликолипидами, поверхностными антигенами - комплексами липотейхоевых кислот и белков [3]. Обеспечение такой важной биологической функции, как поддержание колонизационной резистентности, обеспечивающей эубиоз кишечника, связывают с адгезивной активностью бифидобактерий, изучению которой посвящено немало работ. Однако структурные компоненты клеточной поверхности, участвующие в процессе адгезии, исследованы недостаточно.
В связи с этим целью настоящей работы явилось изучение белкового и аминокислотного состава структурных компонентов клеточной стенки бифидобактерий штамма Bifi-dumbacterium bifidum I и оценка вклада отдельных аминокислот в гидрофобность и заряд клеточной поверхности.
Материалы и методы
В работе использовали штамм Bifidobacterium bifidum I, выделенный из коммерческого препарата Bifidobacterinum siccum, производства «Ланафарм», г. Москва.
Культуру бифидобактерий выращивали в течение 72 час при 37 °С на тиогликолевой среде в анаэробных условиях. Клетки бифидобактерий трехкратно осаждали на рефрижераторной центрифуге К70Б при 1500 об/мин в течение 10 мин. Пастообразный осадок клеток суспендировали в 40 мл предварительно охлажденного до 4 °С фосфатного буфера, рН 7,2. Дезинтеграцию клеток бифидобактерий проводили на ультразвуковом дезинтеграторе типа UD-20 двукратно в течение 2 мин.
Полученный дезинтеграт суспендировали в 100 мл фосфатного буфера, рН 7,2 и центрифугировали в течение 10 мин при 2 000 об/мин (центрифуга ^0D) для осаждения неразрушенных клеток бифидобактерий. Осадок клеточных стенок бифидобактерий получали центрифугированием полученного супернатанта в течение 10 мин при 8000 об/мин на лабораторной медицинской центрифуге ОПн-8, суспендировали в 30 мл фосфатного буфера, рН 7,2. Надосадочную жидкость отбрасывали. Все операции по осаждению и дезинтеграции клеток бифидобактерий проводили при 4 °С.
Выделение белков клеточной стенки бифидобактерий, проводили путем осаждения сульфатом аммония до 85 % насыщения. Полученный белковый осадок ресуспендировали в
0,125 М Трис-НС1 буфере рН 6,8, содержащем 4 % ДДС-Na, 20 % глицерина, 10 % 2-мер-каптоэтанола и 0,004 % бромфенолового синего и анализировали с помощью электрофореза в 10 % ПААГ, рН 6,8 в присутствии 0,1 % ДДС-Na по методу Лэммли [7]. Образец белков наносили в слоту на концентрирующий гель в количестве 20-30 мкл. Электрофорез проводили в течение 8 ч при силе тока 10 мА - вначале и 50 мА - в дальнейшем при комнатной температуре. Для проявления белков электрофоре-граммы окрашивали в водном растворе, содержащем 0,1 % Кумасси G-250 (Sigma, США), 25 % этанола и 10 % ТХУ. Для обесцвечивания фона пластинку геля помещали в раствор 7 %-ной уксусной кислоты.
Для повышения чувствительности окрашивания гелевый блок обрабатывали нитратом серебра по модифицированной методике [6].
Для определения молекулярной массы полипептидов использовали стандартный набор белков (Sigma, США), содержащий глицеральдегид-3 фосфатдегидрогеназу (36 кДа), овальбумин (45 кДа), глутаматдегидрогеназу (55 кДа), БСА (66 кДа), фруктозо-6-фосфаткиназу(84 кДа), фосфо-рилазу Б (97,4 кДа), ß-галактозидазу (116 кДа) и миозин (205 кДа). Смесь стандартных белков растворяли в 100 мкл деионизированной воды и наносили в слоту в количестве 5 мкл. Молекулярную массу исследуемых полипептидов определяли по калибровочной кривой, построенной по методике, прилагаемой к набору. Концентрацию белков клеточной стенки бифидобактерий определяли по Лоури [8]. Аминокислотный анализ белковых и общих аминокислот фракции клеточных стенок бифидобактерий осуществляли на аминокислотном анализаторе ААА-881 в №+-цикле. Для получения аминокислот проводили гидролиз белков в 6N HCl при температуре 110 °С в течение 24 часов. Использовали стандарты аминокислот Sigma (США).
Результаты и обсуждение
Клеточная стенка штамма Bifidobacterium bifidum I, представлена обширной группой гетерогенных белков, которые могут участвовать в процессе адгезии. Эти белки представлены тридцатью отдельными субъединицами с молекулярными массами от 44,2 кДа до 125 кДа (рис.).
Рис. ДДС-Na электрофорез клеточных стенок Bifidobacterium bifidum I
Аминокислотный состав образца клеточной стенки бифидобактерий представлен в таблице, из которой видно, что на долю гидрофобных белковых аминокислот (А-аланин, У-валин, Ь-лейцин, 1-изолейцин, Б-фенилаланин, М-ме-тионин, Р-пролин) приходится 44 мол.%, в сухом остатке - 35 мол.%; доля заряженных белковых аминокислот (Б-асп. к-та, Е-глут. кислота, Я-аргинин, К-лизин, Н-гистидин) составляет 34 мол.%, в сухом остатке - 41 мол.%; на полярные незаряженные белковые аминокислоты (У-ти-розин, 8-серин, Т-треонин, О-глицин) приходится 22 мол. % и 24 мол. % соответственно. Четыре аминокислоты (А-аланин, Б-аспарагиновая кислота, Е-глутаминовая кислота и О-глицин) составляют более 50 % общего аминокислотного состава белков клеточной стенки бифидобактерий; пять аминокислот (А-аланин, Б-аспарагино-вая кислота, Е-глутаминовая кислота, К-лизин и О-глицин) составляют более 60 % общего аминокислотного состава структурных компонентов клеточной стенки.
Значительное содержание неполярных аминокислот в белках (44 мол.%) говорит в пользу их участия в формировании адгезинов, характеризующихся повышенной гидрофобностью. Наибольший молярный процент аланина (17 мол.%) среди гидрофобных аминокислот образца клеточной стенки указывает на важную роль этой аминокислоты в структурообразовании пепти-догликана - основного компонента клеточной стенки грамположительных бактерий [4], к которым относятся бифидобактерии.
Обнаружено почти полное отсутствие серосодержащих аминокислот.
Из гидрофильных аминокислот на долю аспарагиновой и глутаминовой кислоты в белках приходится 29 мол.%, в сухом остатке - 25 мол.%, что свидетельствует о большем вкладе отрицательно заряженных аминокислот в заряд белков и всей клеточной поверхности бифидобактерий. В то же время глутаминовая кислота может входить в состав пептидогликана в виде амида по а-карбоксильной группе, осуществляя пептидную связь за счет у-карбоксила [9], и в этом случае она не будет обладать кислотными свойствами, что будет способствовать уменьшению отрицательного заряда бактериальной поверхности.
Взаимодействие белков клеточной стенки бифидобактерий с другими структурными компонентами, в частности с К-ацетил глюкозами-ном пептидогликана может осуществляться посредством ковалентной связи через аспарагиновую кислоту [4], значительное количество которой (12, 99 мол.%) обнаружено в белках образца клеточной стенки (табл.).
Значительную роль в структурообразова-нии пептидогликана клеточной стенки бифидобактерий принадлежит аминокислотам лизину и глицину, молярные проценты которых в образце клеточных стенок составляют 11, 0 и 14, 86 соответственно.
Таблица
Аминокислотный состав образца клеточной стенки бифидобактерий
Аминокислота Моля] рные проценты
Белковые аминокислоты Аминокислоты сухого остатка
Аланин (А) 17,70 13,85
Валин (У) 6,86 7,72
Лейцин(Ь) 7,33 6,91
Изолейцин (I) 4,99 3,23
Феннилаланин (Б) 1,50 2,27
Тирозин (У) 0,17 1,34
Серин (8) 6,46 4,49
Треонин (Т) 5,29 3,20
Метионин (М) 1,10 -
Аспарагиновая кислота (Б) 12,99 9,87
Глутаминовая кислота (Е) 16,20 14,86
Аргинин (Я) 1,01 3,48
Лизин (К) 2,90 11,00
Пролин(Р) 4,55 1,15
Гистидин (Н) 0,68 1,77
Глицин (в) 10,27 14,86
Е 100 100
По данным проведенного электрофореза клеточная поверхность штамма Bifidobacterium bifidum I, представлена обширной группой гетерогенных белков, которые могут участвовать в процессе адгезии. Эти белки представлены тридцатью отдельными субъединицами с молекулярными массами от 44,2 кДа до 125 кДа (рис.).
Таким образом, наши исследования показали, что аминокислоты образца клеточной стенки бифидобактерий могут участвовать как в структурообразовании белковых и гликопеп-тидных единиц клеточной стенки, так и в формировании зон гидрофобности и заряда бактериальной поверхности, ответственной за адгезию. Положительно заряженная поверхность бактерий может образовывать специфические комплексы с кислыми полисахаридами (глико-замингликанами) и тем самым проявлять ЛН-подобные свойства. Клеточная поверхность штамма Bifidobacterium bifidum I представлена обширной группой гетерогенных белков, которые могут участвовать в процессе адгезии.
В заключение хотелось бы отметить, что перспективы изучения адгезинов бифидобактерий в медицинской биотехнологии связаны с усилением адгезивных свойств штаммов генноинженерным путем.
Литература
1. Бевз Н. И. Адгезивные свойства бифидобактерий / Н. И. Бевз, А. М. Лянная, Э. П. Козлов и др. // Всесоюз. семинар «Колонизационная резистентность и химиотерапевтические антибактериальные препараты», 28-29 июня 1988 г. - М., 1988. - Ч. 2. - С. 161-162.
2. Лахтин В. М Лектины, адгезины и лектино-подобные белки лактобацилл и бифидобактерий. Обзор литературы за последние 10 лет / В. М. Лах-тин, М. В. Лахтин, В. В. Поспелова // Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания : материалы Межд. конф., 2-4 июня, 2004 г.- М., 2004. - С. 7-8.
3. Новик Г. И. Выделение и характеристика белково-полисахаридного комплекса, секретируе-мого Б1АёитЬа&егшш adolescentis / Г. И. Новик, Н. И. Астапович, А. А. Самарцев, Н. Е. Рябая // Микробиология. - 1997. - Т. 66, № 5. - С. 621-627.
4. Савельев Е. П. Выделение и характеристика поверхностных белков стрептококка группы А / Е. П. Савельев, Е. И. Блинникова, С. А. Битко, О. П. Дег-терева // Биохимия. - 1987. - Т. 52, вып. 11. -
С. 1875-1880.
5. Сибирякова Н. И. Биологическая активность пептидогликана бифидобактерий : автореф. дис. ... канд. биол. наук / Н. И. Сибирякова. - М., 1992. - 22 с.
6. Gorg A. Sciensi Tools / A. Gorg, W. Postel, J. Wesir et al. - 1985. - Vol. 32. - P. 5-9.
7. Laemmli U. K. Cleavage of proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / U. K. Laemmli // Nature. - 1970. - Vol. 227. - P. 680 - 685.
8. Lowry O. H. Protein measurement with the Folin phenol reagent / O. H. Lowry, N. J. Rosenbrough, A. L. Farr, R. J. Randell // Biol. Chem. - 1951. - Vol. 193. - P. 265-275.
9. Schleifer K. M. Peptidoglycan types of bacterial cell walls and their taxonomic implications / K. M. Schleifer, O. Kander // Bact. Rev. - 1972. - Vol. 36 (4). - P. 428-430.
Protein and amino acid composition of bifidus bakteria cell wall
G. V. Yurinova1, S. V. Osipova2, A. V. Permyakov2,
A. M. Sobenin2, S. M. Popkova3, S. I. Leschyuk3
1 Irkutsk State University, Irkutsk
2 Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry SB RAS, Irkutsk
3 Research Institute for Epidemiology and Microbiology, SC ME ESSC SB RAMS
Abstract. Protein and amino acid composition of bifidus bakteria cell wall is researched (strain Bifidobakterium bifidum I). Cell surface is shown to be a broad group of heterogeneous proteins, which can participate in the process of specific adhesion. Amino acids of a cell wall model can participate as in structure formation of protein and glyco-peptide units of cell wall, as in the formation of hydrophobic property areas and charge of bacterial surface, that is responsible for adhesion.
Key words: microbiocenosis, bifidobacteria, amino acid, cell wall.
Юринова Галина Валерьевна
Иркутский государственный университет
663003, г. Иркутск, ул. Сухэ-Батора, 5
кандидат биологических наук, доцент кафедры
физико-химической биологии
тел. (3952) 24-18-70, факс (3952) 24-18-55
Е-таіІ: yurinova@yandex.ru
Осипова Светлана Владимировна Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН
664033, Иркутск, ул. Лермонтова, 132 кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, зав. лабораторией технической биохимии белка
тел. (3952) 42-50-09, факс. (3952) 51-07-54
Yurinova Galina Valeryevna Irkutsk State University 664003, Irkutsk, 5, Sukhe-Batora St.
Ph.D. in Biology, ass. prof
phone: (3952) 24-18-70, fax: (3952) 24-18-55
Е-mail: yurinova@yandex.ru
Osipova Svetlana Vladimirovna Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry SB RAS 664033, Irkutsk, 132, Lermontova St.
Ph.D. in Biology, senior research scientist, Head of Laboratory of Technical Biochemistry of Proteine phone: (3952) 42-50-09, fax: (3952) 51-07-54
Пермяков Алексей Викторович
Сибирский институт физиологии и биохимии
растений СО РАН
664033, Иркутск, ул. Лермонтова, 132
Permyakov Aleksey Viktorovitch Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry SB RAS 664033, Irkutsk, 132, Lermontova St.
кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории технической биохимии белка тел. (3952) 42-50-09, факс. (3952) 51-07-54
Собенин Александр Михайлович
Сибирский институт физиологии и биохимии
растений СО РАН, 664033
Иркутск, ул. Лермонтова, 132
ведущий технолог, лаборатории физических
методов анализа
тел. (3952) 42-50-09, факс. (3952) 51-07-54
Попкова Софья Марковна
Институт эпидемиологии и микробиологии
СО РАМН
664003, г. Иркутск, ул. К. Маркса, 3
доктор биологических наук, зав. лабораторией
микроэкологии человека
тел. (3952) 33-34-45, факс. (3952) 33-34-45
Е-таіІ: popkov_smaf@mail.ru
Лещук Светлана Ивановна
Институт эпидемиологии и микробиологии
СО РАМН,
664003, г. Иркутск, ул. К. Маркса, 3, доктор биологических наук, ведущий сотрудник лаборатории микроэкологии человека тел. (3952) 33-34-45, факс. (3952) 33-34-45
Ph.D. in Biology, research scientist,
Laboratory of Technical Biochemistry of Proteine phone: (3952) 42-50-09, fax: (3952) 51-07-54
Sobenin Aleksandr Mikhailovitch
Siberian Institute of Plant Physiology
and Biochemistry SB RAS
664033, Irkutsk, 132, Lermontova St.
senior technologist, Laboratory of Physic-chemical
Research Methods
phone: (3952) 42-50-09, fax: (3952) 51-07-54 Popkova Sophya Markovna
Research Institute for Epidemiology and Microbiology, 664000, Irkutsk, 3, K. Marks St.
D.Sc. in Biology, Head of Laboratory of Human Microecology
phone: (3952) 33-34-45, fax:(3952) 33-34-45 Е-mail: popkov_smaf@mail.ru
Leschuk Svetlana Ivanovna
Research Institute for Epidemiology and Microbiology, 664000, Irkutsk, 3, K. Marks St.
D.Sc. in Biology, leading research scientist, Laboratory of Human Microecology phone: (3952) 33-34-45, fax:(3952) 33-34-45
