CC BY
72
Биохимия, биотехнология и диагностика
УДК 619:616.995.121.56:1-07
БЕЛКОВО-АНТИГЕННЫЙ СПЕКТР ЭКСТРАКТА ИЗ ПРОТОСКО-ЛЕКСОВ Cysticercus tenuicollis И ЕГО ЭФФЕКТИВНОСТЬ В ДИАГНОСТИКЕ ТЕНУИКОЛЬНОГО ЦИСТИЦЕРКОЗА
А.А. ТХАКАХОВА аспирант В.К. БЕРЕЖКО доктор биологических наук
Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии им.
К.И. Скрябина, e-mail: [email protected]
Приведены результаты исследований белково-антигенного спектра и диагностической эффективности экстракта из протосколексов Cysticercus tenuicollis при тенуикольном цистицеркозе овец. Установлено, что из 65 белковых фракций 8 (12,3 %) содержали диагностические антигенные компоненты. Чувствительность иммуноферментной реакции с очищенным антигеном из протосколексов паразита при тенуи-кольном цистицеркозе овец составила 77,8 %, специфичность - 71,9 %.
Ключевые слова: антиген, протосколекс, Cysticercus tenuicollis, овцы, ИФР.
Белки, выполняющие одинаковые функции в организме животных различных видов, имеют сходные химические свойства, что несомненно влияет на их антигенность и, в конечном итоге, на специфичность. С этой точки зрения ряд протеинов, различных по химическому составу, приобретают одинаковую иммуноспецифичность, поскольку дают перекрестные реакции. Экспериментальными исследованиями доказано, что метаболические и, особенно, соматические белковые продукты из гельминтов не гомогенны и имеют в своем составе большое количество различных компонентов как специфических для данного вида, так и общих для представителей различных таксономических групп. Сходство части антигенных компонентов у разных видов гельминтов свидетельствует об общности некоторой части их биоструктур и является отображением их филогенетического родства. Число перекрестно-реагирующих компонентов с уменьшением степени родства значительно сокращается [9].
Между разными видами цестод установлена значительная антигенная близость [1-4, 6-8, 13, 14, 17], что, несомненно, затрудняет их дифференциацию и разработку высокоспецифичных диагностических иммунотестов.
Тем не менее, экспериментальными исследованиями показано, что наибольшую специфичность проявляют антигены цестод, полученные из протосколексов, мембраны цист, онкосфер [1, 3, 10, 12, 15].
Исходя из этого, мы исследовали белково-антигенный спектр экстракта из протосколексов С tenuicoШs с целью определения наиболее эффективных в диагностическом плане компонентов.
Материалы и методы
Материалом исследования служили протосколексы C. tenuicoШs, полученные из тенуикольных пузырей от убойных естественно инвазированных
овец. Из выделенных протосколексов готовили экстракт по методу Бережко с соавт. [5]. Белок в полученном экстракте определяли на спектрофотометре при 280 нм по методу Layne [11] с калибровочной кривой на основе бычьего сывороточного альбумина (фракция 5). Фракционирование полученного экстракта проводили хроматографией на носителе TSK Gel HW-50 (тонкий). Колонки диаметром 26 мм, высота столба геля - 1 м, объем наносимого образца
- 10 мл (25,0 мг белка), объем каждой фракции - 5 мл. Элюирование осуществляли фосфатно-солевым буферным раствором, pH - 7,2, скорость протока буфера - 10 мл/час. Регистрацию фракций проводили на Увикорде (LKB) при 280 нм, сбор фракций - в коллекторе Мультирак. Весь процесс разделения проводили при 4 оС. Оценку серологической активности полученных фракций осуществляли иммуноферментной реакцией (ИФА), используя в качестве положительного контроля сыворотку овцы, инвазированной C. tenuicollis, отрицательного - сыворотку клинически здорового животного. Специфичность выявленных активных белковых фракций устанавливали с помощью сывороток овец, естественно инвазированных Echinococcus granulosus и T. ovis. Выделенные активные антигенные фракции объединяли и оценивали их диагностическую эффективность в ИФР при тенуикольном цистицеркозе овец. Чувствительность реакции устанавливали с 36 пробами сывороток инвазированных C. tenuicollis овец, специфичность с 57 пробами, в том числе 17
- с естественной инвазий E. granulosus, 9 - с очаговыми изменениями в печени неизвестной этиологии и 28 - без видимых паразитарных изменений.
Результаты и обсуждение
Концентрация белка в экстракте из протосколексов C. tenuicollis составляла 2,5 мг/мл, для фракционирования использовали 10 мл экстракта с содержанием белка-антигена 25 мг. В процессе фракционирования было получено 65 фракций с различным содержанием белка (от 0,008 до 1,23 мг/мл). Анализ антигенной активности полученных фракций, проведенный ИФР с заведомо положительными и отрицательными контрольными сыворотками, показал, что значительное число белковых фракций в экстракте протосколек-сов паразита не способно выявлять противопаразитарные антитела. Из числа исследованных фракций только 8 (27-34; 12,3 %) имели в своем составе антигенные компоненты, позволяющие по разнице оптической плотности (ОП) между контрольными сыворотками животных и сыворотками с гетерологич-ной инвазией судить об их специфичности. Остальные 57 (87,7 %) белковых фракций в составе исследуемого экстракта, содержащие антигены паразита, оказались неспецифическими. Они не только не позволяли по разнице ОП дифференцировать сыворотки зараженных от клинически здоровых овец, но значительная часть из них проявила очень слабую антигенную активность.
Уровень ОП при исследовании сывороток заведомо зараженных животных с этим фракциями (50-60) не превышая 0,15-0,21, что в большинстве случаев было ниже показателей, полученных с сыворотками овец без видимых паразитарных изменений внутренних органов и отнесенных в контрольную группу.
Выбранные 8 белковых фракций, показавшие в предварительных испытаниях наилучшие диагностические качества, были объединены и использованы в диагностике тенуикольного цистицеркоза овец. Полученные данные приведены в таблице, из которой видно, что 8 проб сывороток из группы овец с естественной инвазией C. tenuicollis дали ложноотрицательный ответ. Таким образом, чувствительность теста с очищенным антигеном составила 77,8 %.
Специфичность ИФР, судя по результатам, была в пределах 71,9 %. Наибольшее число (7 проб) ложноположительных ответов регистрировали в группе животных, инвазированных E. granulosus.
Оценка чувствительности и специфичности ИФА с очищенным экстрактом протосколексов C. tenuicoШs при тенуикольном цистицеркозе овец
Сыворотки Число Результаты реакции Чувстви- Специ-
животных проб + ± - тель- фичность,
полож. сомн. отриц. ность, % %
Цистицеркоз 36 28 - 8 77,8 71,9
тенуикольныи
Эхинококкоз 17 7 1 9
Очаговые из- 9 3 1 5
менения в пе-
чени
Без видимых 31 4 2 25
паразитарных
изменении
Всего 93 42 4 47
Анализ полученных данных показал, что диагностический антиген из протосколексов C. tenuicollis не обладал строгой специфичностью и в определенной степени давал положительную реакцию с сыворотками овец, инва-зированных как E. granulosus, так и без видимых паразитарных поражений внутренних органов. Тем не менее, наибольший процент положительных ответов при эхинококкозе дает основание склоняться к тому, что на определенном этапе инвазионного процесса при ларвальных цестодозах вырабатываются антитела на идентичные иммуногены, что не позволяет проводить в этот период строгую дифференциацию этих гельминтозов.
Независимо от этого, на наш взгляд, очищенный антиген из протоско-лексов C. tenuicollis можно использовать для проведения сероэпизоотологи-ческих исследований и изучения иммунного статуса животных в различных регионах. Причем для большей объективности такие исследования лучше проводить одновременно с эхинококковым антигеном, что позволит конкретизировать ситуацию по этим гельминтозам. О перекрестной реактивности синтезируемых при ларвальных цестодозах антител имеется достаточно большое количество публикаций.
Так, при экспериментальном цистицеркозе (C. bovis) телят установлено, что в процессе инвазии у большинства животных и наиболее часто антитела регистрировали к компоненту, который был зарегистрирован у C. tenuicollis [2]. По мнению автора, очистка антигена C. bovis от общего с C. tenuicollis антигенного компонента может отрицательно сказаться на его диагностических качествах.
По данным Мунтяна [6], один из антигенных компонентов E. granulosus, вызывающий синтез антител у инвазированных овец, проявляет общность с антигеном C. tenuicollis.
Значительное антигенное родство E. granulosus и T. hydatigena установили Varela-Diaz et al. [16], которые продемонстрировали наличие специфичного для E. granulosus антигена «Arc-5» в жидкости тенуикольного пузыря. Убедительным подтверждением перекрестной реактивности антител, синтезируемых при эхинококкозе и тенуикольном цистицеркозе, явились результаты иммунодиагностического исследования с сыворотками свиней, естественно инвазированных этими гельминтами [4]. В отдельных случаях, более 30 % зараженных эхинококками животных положительно реагировали с антигеном C. tenuicollis, причем уровень оптической плотности в ИФР иногда превышал показатели в гомологичной системе реакции. Очевидно, что синтезируемые у животных в процессе заражения тенуикольными цистицерками типы антител являются отражением количественных и качественных изменений антигенного состава развивающегося паразита, что необходимо учитывать при разработке иммунотестов. Основным препятствием проведения дифференциально-
го диагноза при ларвальных цестодозах является перекрестная реактивность антител, синтезируемых на антигены цестод и особенно при тенуикольном цистицеркозе и эхинококкозе, что существенно отражается на специфичности иммунореакций. Дальнейшие исследования с очищенным антигенным препаратом из протосколексов C. tenuicollis фактически подтвердили это. Хотя гель-хроматография позволила выделить из экстракта протосколексов паразита 8 активных диагностических фракций, она не освободила их от компонентов, положительно реагирующих с сыворотками зараженных эхинококками овец.
Эти данные свидетельствуют об идентичности антител, синтезируемых на определенном этапе инвазионного процесса при тенуикольном цистицер-козе и эхинококкозе, что не исключает закономерности такого положения при всех ларвальных цестодозах.
С этих позиций целесообразнее проводить серологические мониторинговые исследования многоцелевого характера с использованием антигенов из разных видов цестод. Такой подход даст возможность более объективно оценить ситуацию по этим гельминтозам в регионе, где проводят исследования.
Литература
1. Баллад Н.Е. Изучение антигенных компонентов цистицерков Cysticercus bovis // Тр. Всес. ин-та гельминол. - 1971. - Т. 17. - С. 269-270.
2. Баллад Н.Е. Иммунохимическая характеристика антигенов, выделенных из личиночных стадий Taeniarhynchus saginatus // Мед. паразитол. и па-разитарн. бол. - 1973. - № 2. - С. 131-136.
3. Бережко В.К. Сравнительная иммунохимическая характеристика и серологическая активность антигенов Cysticercus tenuicollis и Taenia hydatigena // Паразитология. - 1989. - Т. 23, № 5. - С. 399-406.
4. Бережко В.К. Иммунологическая реактивность, иммунодиагностика и иммунопрофилактика при гельминтозах животных (Теоретические основы и экспериментальные исследования): Дис. ... д-ра биол. наук. - 1994. - 305 с
5. Бережко В.К., Хайдаров К.А., Дахно И.С. и др. Иммунохимический анализ соматического экстракта из половозрелых Dirofilaria immitis // Матер. докл. науч. конф. Всерос. о-ва гельминтол. «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями». - М., 2008. - Вып. 9. - С. 69-73.
6. Мунтян Н.А. Антигенный состав гидатидозной жидкости, экстрактов из сколексов и герминативных оболочек ларвоцисты эхинококка // Мед. пара-зитол. и паразитарн. бол. - 1971. - № 5. - С. 558-665.
7. Раззаков Ш.А. Выявление видоспецифических и перекрестно реагирующих антигенных компонентов эхинококка и альвеококка // Мед. парази-тол. и паразитарн. бол. - 1975. - Т. 44, № 4. - С. 448-455.
8. Свириденко-Степанковская Л.П., Коновалова Л.П., Полетаева О.Г. и др. Выявление группоподобных антигенов в эхинококковой жидкости и экстрактах лиофилизатов Cysticercus cellulosae, C. bovis, Taeniarhynchus sagina-tus, Ascaris suum // Мед. паразитол. и паразитарн. бол. - 1972. - № 2. - С. 131135.
9. Capron A., Brygoo E., Afchain D. Apport de l'etude de la structure antige-nique a la phylogenic des Helminthes // Bull. Mus. nat. hist. natur. zool. - 1972. -V. 55. - P. 877-885.
10. Jenkins D.J., Richard M.D. Specific antibody responses to Taenia hyda-tigena, Tenia pisiformis and Echinococcus granulosus infection in dogs // Austral. Vet. J. - 1985. - V. 62. - N 3. - P. 72-78.
11. Layne Е. Spectrophotometry and turbidometric methods for mеаsuring proteins // Methods Enzymol. - 1957. - V. 3. - P. 447-454.
12. Nascimento E., Arauio F.G. Estudos imunoquimicosem extratos de larvas l'adultos de Taenia solium // Rev. Inst. Med. Trop. (S. Paulo). - 1982. - V. 24. - N 6. - P. 359-363.
13. Rhoads M.L. Murrell K.D., Dilling G.W. Apotencial diagnostic reagent for bovine cysticercosis // J. Parasitol. - 1985. - V. 71, N 6. - P. 779-787.
14. Rickard M.D. Jenkins D.J. Studies on the serological diagnosis of infection with Taenia spp. and Echinococcus granulosus in dogs. // 2th Inter. Symp. Taeniasis/Cysticercosis and Hydatidosis/Echinococcosis, Ceske Budejovice. -1986. - P. 78-86.
15. Ris D.R., Hamel K.L., Mackle Z.M. Use of two polysaccharide antigens In ELISA for the detection of antibodies to Echinococcus granulosus in sheep sera. // Res. Vet. Sc. - 1987. - V. 43, N 2. - P. 257-269.
16. Varela-Diaz V.M., Coltorti E. A., RickardM.D., Torres J.M. Comparative antigenic characterization of Echinococcus granulosus and Taenia hydatigena cyst fluids by Immunoelectrophoresis // Res. Vet. SC. - 1977. - V. 23, N 2. - P. 213216.
17. Yong W.K., Heath D.D., Parmeter S.N. Echinococcus granulosus, Taenia hydatigena, Taenia ovis: evaluation of cyst fluids as antigen for serodiagnosis of larval cestodes in sheep // New. Zealand. Vet. J. - 1978. - V. 26, N 9. - P. 231234.
Protein-antigene spectrum of extract from protoscolexes Cysticercus tenuicollis and its efficiency in diagnostics of cysticercosis
A.A. Thakahova, V.K. Berezhko
The results of researches protein-antigene spectrum and diagnostic efficiency of extract from protoscolexes Cysticercus tenuicollis at cysticercosis of sheep are given. It is established that from 65 albuminous fractions 8 (12,3 %) contained diagnostic antigenic components. Sensitivity of immunoenzyme reactions with the cleared antigene from parasite's protoscolexes at cysticercosis of sheep has made 77,8 %, specificity - 71,9 %.
Keywords: antigene, protoscolex, Cysticercus tenuicollis, sheep, IER.
