CC BY
57
УДК 630*181.324
БЕЛКИ ЦИТОПЛАЗМЫ МЕРИСТЕМ ПОЧЕК ЕЛИ: ДИНАМИКА АМИНОКИСЛОТНОГО СОСТАВА
© П.В. Миронов, Е.В. Алаудинова, Ю.С. Шимова, С.Ю. Симкина
Сибирский государственный технологический университет, пр. Мира, 82, Красноярск, 660049 (Россия) E-mail: [email protected]
Приведены результаты изучения динамики водорастворимых белков цитоплазмы клеток меристематических тканей зимующих почек ели. Дана характеристика изменения фракционного и аминокислотного состава белков цитоплазмы при изменениях устойчивости клеток к низким температурам. Отмечено аномально высокое суммарное содержание водорастворимых белков цитоплазмы в зимний период и в период весеннего максимума. В период весеннего максимума на фоне увеличения содержания воды в клетке наблюдался дополнительный рост содержания гидрофильных аминокислот в структуре водорастворимых белков цитоплазмы, что связано с необходимостью усиления криопротекции мери-стематических клеток.
Введение
Белки играют важнейшую роль в процессах роста древесных растений и их адаптации к неблагоприятным факторам внешней среды, в том числе и к действию низких зимних температур. известно, что осенняя подготовка древесных растений к зиме сопровождается усилением синтеза белков в живых тканях [1-4]. Предполагается, что низкотемпературная устойчивость обеспечивается как в результате снижения интенсивности обмена до очень низкого уровня, так и вследствие синтеза в осенний период различных соединений, в том числе белков, обладающих криозащитным действием [5-6].
Многие авторы отмечают повышенное содержание белков в зимующих органах и тканях и корреляцию этого повышения с устойчивостью, однако механизмы защитного действия белков до настоящего времени остаются невыясненными. В определенной мере это объясняется трудностями в изучении состояния и поведения белков в древесных тканях, связанных с тем, что живые клетки и ткани составляют лишь очень малую часть массы дерева, а выделение этих тканей в чистом виде не всегда возможно. исследователи, как правило, вынуждены определять содержание белков и изучать их свойства в образцах с небольшим и неопределенным количеством живых клеток и относить выявленные свойства к значительно большей массе древесных тканей. В результате это может привести к нивелированию или искажению данных. В связи с этим для выявления роли белков в низкотемпературной устойчивости весьма важным представляется изучение их свойств по отношению именно к живым клеткам и тканям, где эти белки локализованы.
Определенные возможности для этого представляются при исследовании зимующих почек, из которых можно достаточно легко выделить меристематические ткани, целиком состоящие из живых клеток. В частности, эти ткани практически в чистом виде могут быть выделены из зимующих вегетативных и генеративных почек хвойных: лиственницы сибирской, пихты, ели и сосны, характеризующихся, как известно, достаточно высокой морозостойкостью.
В работах [7-9] было показано, что способность к глубокому переохлаждению внутриклеточной воды в меристематических тканях почек со сходной морфологией - лиственницы, пихты и ели, определяется главным образом водорастворимыми белками цитоплазмы (ВрБЦ), которые накапливаются в период глубокого покоя в клетках меристем этих пород.
Методами низкотемпературного термического анализа было установлено, что в процессе охлаждения побегов с почками с постоянной скоростью регистрировались низкотемпературные экзотермы, связанные с
* Автор, с которым следует вести переписку.
кристаллизацией переохлажденной внутриклеточной воды в тканях меристем. Величина переохлаждения, определяемая как разность температур кристаллизации и плавления, составляла свыше 25 °С.
Белковая природа антинуклеационного фактора была подтверждена в ходе экспериментов по обработке белков ферментом пептидазой. Показано, что такая обработка значительно снижала антинуклеационную активность: степень переохлаждения воды в белковых гидролизатах становилась более характерной для растворов низкомолекулярных веществ [8-10].
Поскольку свойства белков определяются входящими в его структуру аминокислотами, представляет интерес изучение особенностей аминокислотного состава криозащитных белков цитоплазмы, его изменений в условиях низкотемпературной адаптации и выявление возможной связи состава и свойств этих белков.
В связи с этим целью данной работы было изучение фракционного состава ВРБЦ (на примере меристем почек ели), его сезонных изменений, а также особенностей состава аминокислот основных групп белковых фракций в состоянии низкотемпературной устойчивости и потери ее весной.
Экспериментальная часть
Меристематические ткани выделяли из почек ели, срезая их по границе с ксилемой побега после удаления почечных чешуй и коры. Общее содержание белка в тканях и в водных экстрактах определяли с помощью красителя амидо-черного 10В по методу, описанному в работе [11].
Погрешность при определении содержания белка в экстрактах и гомогенатах составляла 3-5% от измеряемой величины. Надосадочную жидкость, полученную после центрифугирования гомогенатов тканей в течение 30 мин при 22000 g, использовали для определения содержания водорастворимых белков цитоплазмы.
Электрофоретическое фракционирование белков проводили в 7,5%-ном полиакриламидном геле (ПААГ) при рН 8,0 с использованием стандартного прибора для электрофореза ПЭФА-1.
Величины молекулярных масс белковых фракций определяли методом электрофореза в ПААГ с доде-цилсульфатом натрия и р-меркаптоэтанолом [12].
Приблизительное содержание белка в отдельных фракциях в столбиках геля оценивали по денситограммам с погрешностью ~15%.
Препаративное выделение групп фракций белков для последующего аминокислотного анализа проводили методом гель-фильтрации на сефадексе G-150 [13].
Аминокислотный состав белков определяли на автоматическом анализаторе аминокислот ААА 339 М (MIKROTECHNA, Чехия). Гидролиз белков и подготовка образцов для аминокислотного анализа проводилась по методике, описанной в работе [14].
Электронные микрофотографии срезов побегов и почек получены на растровом электронном микроскопе РЭМ-100У. Образцы были предварительно заморожены при -20 °С и лиофильно высушены; на срезы в вакууме произведено напыление серебром.
Обсуждение результатов
На рисунке приведены электронные микрофотографии среза почки ели. Показаны меристематические ткани (1), которые выделяли из вегетативных почек для изучения сезонной динамики белка.
Видно, что меристемы составляют лишь небольшую часть почки. Масса живой ткани, выделяемой из вегетативной почки, составляла 0,5-1 мг при средней массе почек около 10 мг.
На фотографии видна полость в основании почки, где первоначально начинается кристаллизация воды и которая по мере снижения температуры постепенно заполняется льдом, образующимся в процессе обезвоживания переохлажденных тканей меристем.
Фракционный состав водорастворимых белков цитоплазмы меристематических тканей почек ели, исследованный ранее, представлен в зимнее время тридцать одной фракцией [15].
Весь спектр обнаруживаемых методом электрофореза белков был условно разделен на четыре группы фракций. Первая группа представлена белками с молекулярными массами (ММ) выше 100 кД и состоит из семи фракций с массовой долей около 18% от суммарного содержания ВРБЦ. Вторая группа, содержащая 12 фракций, представлена белками с ММ от 15 до 100 кД с массовой долей около 40% от суммы ВРБЦ. Третья группа, составляющая около 22% от суммарного белка, содержала семь фракций с ММ в пределах 15-3 кД. Кроме того, обнаружено пять фракций белков с ММ ниже 3 кД (около 18% от суммы ВРБЦ).
РЭМ-микрофотография среза кончика побега ели с почкой: 1 - меристематические ткани (зачатки хвои и побега); 2 - полость в основании почки - зона льдовыделения при обезвоживании переохлажденных тканей меристем; 3 - почечные чешуи; 4 - ткани побега
Среди индивидуальных белков наибольшую долю в спектре занимают белки с ММ около 37 и 100 кД, которые составляет соответственно 6 и 5%.
В момент максимального весеннего содержания белка (весеннего максимума), при содержании ВРБЦ около 33% от а.с.м. ткани, фракционный состав водорастворимых белков резко изменялся, количество фракций уменьшалось до 20, из белкового спектра практически исчезали высокомолекулярные фракции с ММ выше 100 кД. В момент весеннего подъема содержания водорастворимых белков цитоплазмы преобладали белки со средними и низкими значениями молекулярных масс. Содержание белков с ММ ниже 3 кД значительно возрастало и составляло около 30%, что, вероятно, связано с распадом высокомолекулярных белков, присутствующих в спектрах в период низкотемпературной устойчивости.
Происходило увеличение содержания белка во фракциях с ММ 2,2 и 1,6 кД до 14% от ВРБЦ; другие белки с ММ ниже 3 кД, присутствующие в образцах зимующих почек, во время весеннего максимума исчезали. Увеличение содержания белка в этот период сопровождалось также увеличением количества белковых фракций с ММ от 3 до 100 кД. Содержание белков с ММ 4,5 кД увеличивалось незначительно, наблюдалось появление новой фракции с ММ 4 кД, содержание которой составило около 7% от суммы водорастворимых белков. При этом наблюдалось незначительное увеличение содержания белков с ММ 65 и 35 кД. Содержание белка с ММ 24 кД увеличивалось почти в два раза, с ММ 19 кД - в четыре раза, появлялся белок с ММ 85 кД
Перед распусканием почек, на фоне общего уменьшения содержания водорастворимого белка до 3% от
а.с.м. ткани, наблюдалось также уменьшение числа фракций до 14. Заметно увеличивалась доля белков с ММ ниже 15 кД (низкомолекулярные белки), содержание которых в этот период составляло около 60% от суммарного содержания водорастворимых белков.
Сравнение полученных данных с динамикой фракционного состава водорастворимых белков лиственницы [7] обнаруживает определенное сходство в изменениях фракционного состава и молекулярных масс отдельных фракций. Особенности изменений фракционного состава, происходящих в период потери низкотемпературной устойчивости и при переходе к активной вегетации, позволяют предполагать, что в низкотемпературной адаптации меристем ели и лиственницы высокомолекулярные фракции белков, обнаруживаемые в зимний период и полностью исчезающие из спектров весной, играют важную роль.
Известно, что физико-химические и биологические свойства белков во многом определяются составом аминокислот. Результаты анализа гидролизатов ВРБЦ меристем почек ели представлены в таблице 1.
В составе исследованных белков обнаружено 17 аминокислот. В наибольшем количестве обнаруживаются глутаминовая кислота и пролин. Следует отметить, что по сравнению со средней «встречаемостью» в белках содержание этих аминокислот превышено в разные месяцы от 3 до 5 раз [16]. Обращает на себя внимание противоположный характер изменений их содержания: содержание пролина увеличивается на фоне снижения содержания глутаминовой кислоты и наоборот.
В исследуемый период в значительных количествах определяются аспарагиновая кислота, аланин и глицин. Необходимо отметить сходство динамики содержания аспарагиновой кислоты, глицина и аланина, содержание которых в зимнее время снижалось и составляло около 7,5 и 9% от суммы аминокислот, что не согласуется с данными А.П. Стаценко [17], отмечавшим накопление этих аминокислот при закаливании. Свободный пролин и пролин в составе белковых молекул - обязательные компоненты растительных клеток. Высокое содержание пролина коррелирует с зимостойкостью, поэтому он заслуживает особого внимания. Необычно высокую криозащитную активность этой аминокислоты связывают с ее специфическими физико-химическими свойствами. В частности, пролин хорошо растворим в воде (162 мг/100 мл), и в таких растворах проявляет нетипичные для низкомолекулярных соединений свойства образовывать коллоиды [18]. Считается, что местом накопления пролина в условиях криостресса является цитоплазма клетки [19]. В составе ВРБЦ меристем почек ели содержание пролина в течение исследуемого периода увеличивалось, в зимний период составляло около 23%, а в феврале достигало максимума (около 31%), затем его содержание снижалось и в апреле составляло уже около 11%. Динамика содержания аргинина имеет сходный характер, однако его содержание значительно ниже и даже в максимуме составляет около 5%. А.П. Каргапольцев [20], исследуя водорастворимые белки хвои ели, отмечал, что для них характерно высокое содержание лейцина (около 16%), однако в составе ВРБЦ меристем почек ели содержание лейцина было в два раза ниже (не более 8-9%).
Как и большинство растительных белков, ВРБЦ меристем почек ели бедны серосодержащими аминокислотами - метионином и цистином. Содержание метионина ниже 1%, а цистин обнаружен лишь в следовых количествах.
Следует отметить, что в составе аминокислот в течение всего исследуемого периода преобладали гидрофильные аминокислоты, содержание которых при потере низкотемпературной устойчивости весной снижалось, а в момент весеннего максимума содержания ВРБЦ увеличивалось и даже превышало среднезимнее значение на 10%. Это можно объяснить тем, что в момент достижения весеннего максимума (конец апреля -начало мая) еще имеют место отрицательные температуры, особенно ночью; возможны заморозки. В это же время содержание воды в почках в процессе их набухания существенно увеличивается, что повышает вероятность внутриклеточного льдообразования и гибели клеток. Поэтому клеткам требуется дополнительная защита, что и реализуется дополнительным синтезом криозащитных соединений.
Таблица 1. Аминокислотный состав гидролизатов ВРБЦ меристем почек ели, % от суммы аминокислот
Наименование
Время отбора проб, дата
аминокислоты 05.11.05 05.12.05 04.02.06 12.03.06 24.04.06
Аспарагиновая кислота 11,39 9,80 7,04 6,22 8,48
Треонин 4,09 3,66 3,86 4,08 7,38
Серин 6,24 5,51 4,92 5,37 6,18
Глутаминовая кислота 19,42 16,47 16,21 15,51 20,42
Пролин 4,40 12,14 25,56 30,50 10,66
Глицин 14,35 9,67 9,27 9,65 16,48
Аланин 19,10 9,91 5,32 4,63 6,38
Валин 1,97 2,01 2,61 2,95 4,34
Метионин 0,58 0,76 0,34 0,46 0,00
Изолейцин 1,37 2,14 1,27 1,30 1,54
Лейцин 4,91 8,47 7,03 6,13 4,93
Тирозин 4,46 5,88 2,55 1,27 1,09
Фенилаланин 3,16 1,83 1,52 1,56 1,09
Гистидин 0,68 6,51 1,30 1,02 0,81
Лизин 3,10 4,37 5,43 4,28 5,97
Аргинин 0,80 0,87 4,62 5,07 4,24
Цистин следы следы следы следы следы
Значительные изменения аминокислотного состава ВРБЦ меристем почек ели наблюдались в моменты изменения физиологического состояния дерева. Одновременно с ростом содержания ВРБЦ в апреле отмечался значительный рост суммарного содержания гидрофильных аминокислот, поэтому исследование аминокислотного состава ВРБЦ в этот период представляло особый интерес.
Результаты анализа ВРБЦ, разделенных методом гель-хроматографии на четыре группы фракций в состоянии высокой низкотемпературной устойчивости (февраль), приведены в таблице 2.
Максимальное содержание пролина (около 63%) обнаружено в составе пептидов с ММ менее 3 кД, в остальных фракциях содержание пролина составляло около 20%. Увеличение содержания метионина в этот период в ВРБЦ происходило, вероятно, в основном за счет включения его в структуру пептидов.
В период весеннего максимума (конец апреля) отмечались значительные изменения в аминокислотном составе ВРБЦ различных фракций (табл. 3).
Таблица 2. Аминокислотный состав фракций ВРБЦ меристем почек ели (февраль), % от суммы аминокислот
Наименование аминокислоты Молекулярная масса, кД
выше 100 100-15 15-3 менее 3
Аспарагиновая кислота 8,02 5,13 8,10 3,41
Треонин 5,02 2,82 2,64 5,03
Серин 8,30 5,28 4,55 0,84
Глутаминовая кислота 21,31 10,97 20,39 8,52
Пролин 21,63 23,02 19,87 62,93
Глицин 11,81 8,27 14,08 5,03
Аланин 3,13 9,36 4,78 0,67
Валин 2,27 5,10 3,77 0,69
Метионин 0,00 0,08 0,12 2,02
Изолейцин 1,27 2,23 0,85 0,35
Лейцин 5,74 9,01 9,84 0,51
Тирозин 1,18 2,19 1,01 0,34
Фенилаланин 2,08 1,61 2,06 0,28
Гистидин 1,21 1,13 1,04 0,54
Лизин 5,44 4,83 5,07 1,00
Аргинин 1,59 8,97 1,83 7,84
Цистин следы следы следы следы
Таблица 3. Аминокислотный состав фракций ВРБЦ меристем почек ели (апрель), % от суммы аминокислот
Наименование
Молекулярная масса, кД
аминокислоты 100-15 15-3 менее 3
Аспарагиновая кислота 8,42 10,81 7,79
Треонин 7,25 4,94 7,96
Серин 5,31 5,12 7,36
Глютаминовая кислота 21,48 19,67 19,65
Пролин 11,56 8,74 9,85
Глицин 14,28 17,32 19,07
Аланин 5,11 2,49 8,24
Валин 4,84 3,87 3,94
Метионин 0,00 0,00 0,00
Изолейцин 2,28 0,71 0,81
Лейцин 5,44 2,98 4,67
Тирозин 1,16 1,04 0,93
Фенилаланин 1,32 0,76 0,78
Гистидин 1,01 1,28 0,48
Лизин 8,39 5,32 3,38
Аргинин 2,15 14,95 5,09
Цистин следы следы следы
Доля фракций в спектре ВРБЦ 57 5 38
Содержание пролина в структуре пептидов снижалось почти в семь раз, а глутаминовой кислоты возрастало вдвое. Одновременно в составе пептидов наблюдался рост содержания серина, глицина, аланина, лейцина, валина и лизина.
В составе белков низкомолекулярной фракции содержание пролина также снижалось в два раза, лейцина - в четыре раза, фенилаланина - в два раза, а аргинина, напротив, возрастало почти в семь раз.
В составе фракций белков со средними величинами молекулярных масс возрастало содержание аспарагиновой кислоты, треонина и глицина почти в два раза, и, напротив, снижалось содержание пролина и изолейцина в два раза.
Выводы
В период изменений физиологического состояния наблюдались значительные изменения в составе водорастворимых белков цитоплазмы меристематических тканей почек ели. Особенностью аминокислотного состава ВРБЦ в зимний период являлось высокое содержание глутаминовой, аспарагиновой кислот, аланина, глицина и пролина, что обеспечивало высокое суммарное содержание гидрофильных аминокислот. При этом необходимо отметить также аномально высокое суммарное содержание водорастворимых белков цитоплазмы в зимний период и в период весеннего максимума (примерно 30 и 24% соответственно). В период весеннего максимума на фоне увеличения содержания воды в клетке наблюдался дополнительный рост содержания гидрофильных аминокислот в структуре ВРБЦ, что связано с необходимостью усиления их крио-протекторных свойств.
Список литературы
1. Сезонные структурные метаболические ритмы и адаптация древесных растений / Под ред. Э.Н. Адлера и др. Уфа, 1977. 151 с.
2. Новицкая Ю.Е., Чикина П. Д. Азотный обмен сосны на Севере. Л., 1980. 165 с.
3. Судачкова Н.Е. Метаболизм хвойных и формирование древесины. Новосибирск, 1977. 165 с.
4. Sakai A., Larcher W. Frost survival of plants. Berlin-Heidelberg, 1987. 304 р.
5. Алексеев В.Г., Беленкова Т.Д., Щербакова Т.М. Криобелки и адаптация растений Севера к низким температу-
рам // Физиология растений. 1987. Т. 34. Вып. 6. С. 1140-1148.
6. Volger H.G., Heber V. Cryopnotective leafрroteins // Biochem. et biophys acta. 1975. V. 412. №2. P. 335-340.
7. Миронов П.В., Алаудинова Е.В., Репях С.М. Низкотемпературная устойчивость живых тканей хвойных: монография. Красноярск, 2001. 221 с.
8. Миронов П.В., Левин Э. Д. Переохлаждение и обезвоживание хвойных зачатков в зимующих почках лиственницы сибирской // Физиология растений. 1985. Вып. 4. С. 695-701.
9. Миронов П.В., Лоскутов С.Р. Роль белков-криопротекторов в переохлаждении внутриклеточной воды в тканях лиственницы сибирской // Известия вузов. Лесной журнал. 1999. №6. С. 24-29.
10. Миронов П.В., Алаудинова Е.В., Шимова Ю.С., Репях С.М. Физико-химические свойства криозащитных белков меристем зимующих почек ели и пихты // Известия вузов. Лесной журнал. 2003. №6. С. 75-82.
11. Бузун Г.А., Джемухадзе К.Н., Милешко Л.Д. Определение белка в растениях с помощью амидо-черного // Физиология растений. 1982. Т. 29. Вып. 1. С. 198-204.
12. Практикум по физико-химическим методам в биологии. М., 1976. 300 с.
13. Филиппович Ю.Б., Егорова Т.А., Севастьянова Г.А. Практикум по общей биохимии. М., 1982. 311 с.
14. Плешков Б.П. Практикум по биохимии растений. М., 1985. 255 с.
15. Миронов П.В., Алаудинова Е.В., Шимова Ю.С. Фракционный состав водорастворимых цитоплазматических белков меристем зимующих почек ели и пихты // Химия растительного сырья. 2006. №2. C. 33-36.
16. Финкельштейн А.В., Птицын О.Б. Физика белка: курс лекций с цветными и стереоскопическими иллюстрациями и задачами. 3-е изд., испр. и доп. М., 2005. 456 с.
17. Стаценко А.П. О криозащитной роли аминокислот в растениях // Физиология и биохимия культурных растений. 1992. Т. 24. №6. С. 560-564.
18. Кузнецов В.В., Шевякова Н.И. Пролин при стрессе: биологическая роль, метаболизм, регуляция // Физиология растений. 1999. Т. 46. №2. С. 321-336.
19. Goring H., Dreier W., Heinke F. Zytoplasmatische Osmoregulation durch Proline bei warzeln von Zea Mays // Biol. Rundshou. 1977. №6. P. 377-380.
20. Каргопольцев А.П. Состав белков древесной зелени хвойных пород лесов Сибири: автореф. дисс. ... канд. техн. наук. Красноярск, 1987. 17 с.
Поступило в редакцию 21 апреля 2007 г.
