CC BY
78
УДК 579.873.083.13
М. Ю. Марченко (асп.)1, А. В. Барков (к.вет.н., с.н.с.)2, М. И. Шуктуева (м.н.с)2, В. А. Винокуров (д.х.н., проф.)1, Л. М. Краснопольская (д.биол.н., зав.лаб.)2
Базидиомицеты как перспективный компонент биопрепаратов для ремедиации нефтезагрязненных почв
1 Российский государственный университет нефти и газа им. И. М. Губкина, кафедра физической и коллоидной химии 119991, г. Москва, Ленинский просп., д. 65, корп. 1; тел. (499) 2339589, e-mail: guschin.p@mail.ru, vinok_ac@mail.ru 2Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе РАМН, лаборатория биологически активных соединений 119021, г. Москва, ул. Б. Пироговская, д. 11; e-mail: labbas@yandex.ru
M. U. Marchenko1, A. V. Barkov2, M. I. Shuktueva2, V. A. Vinokurov1, L. M. Krasnopolskaya2
Basidiomycetes as a promising constituent of biopreparations for remediation of oil contaminated soil
1Gubkin Russian State University of Oil and Gas Physical and colloid chemistry department 65, Leninskiy Pr, 119331, Moscow,, Russia; ph. (499) 2339589, e-mail: guschin.p@mail.ru, vinok_ac@mail.ru 2Gause Institute of New Antibiotics Russian Academy of Medical Sciences, 11, B. Pirogovskaya Str., 119021, Moscow, Russia; e-mail: labbas @yandex.ru
Показано, что метаболиты базидиомицета Trametes versicolor, образующиеся при его погруженном культивировании, тормозят развитие углеводородокисляющих микроорганизмов (УОМ) коммерческого препарата для биодеструкции нефти. В свою очередь, присутствие УОМ замедляет образование вегетативного мицелия T. versicolor. Однако сочетанный эффект от применения этих нефтеокисляющих агентов, выражающийся в снижении концентрации нефти на 53% по сравнению с контролем, практически равен сумме значений этого показателя для базидиомицета и УОМ по отдельности: 24% и 35% соответственно. Кроме того, на микроскопическом уровне выявлена склонность клеток УОМ к адгезии на поверхности гиф T. versicolor. Полученные данные подтверждают перспективность совместного использования базидиальных грибов и УОМ в составе комплексного препарата для биоремедиации нефте-загрязненных почв.
Ключевые слова: базидиомицеты; биоремеди-ация; нефтезагрязненная почва; углеводородо-кисляющие микроорганизмы.
Вопросы, связанные с ликвидаций последствий аварийных разливов нефти, будут оставаться актуальными до тех пор, пока не истощатся ее природные запасы. Следовательно, будут требоваться новые эффективные ме-
Дата поступления 26.09.11
The ability of metabolites producing during the basidiomycete Trametes versicolor submerged cultivation to thwart the growth of hydrocarbon-utilizing microorganisms (HUM) of commercial biopreparation for oil biodestruction is shown. In its turn the presence of HUM reduces the T. versicolor vegetative micellium formation. However the combine effect of both hydrocarbon-utilizing agents which reflected in the decreasing of oil concentration up to 53% with respect to control level is substantially similar to the sum of the values of these measures separately for basidiomycete and HUM: 24% and 35% respectively. Furthermore the liability of HUM cells to adhere to the surface of T. versicolor hyphas is detected microscopically. Obtained data confirm the prospectivity of basidiomycetes and HUM combined employing as parts of multiple biopreparation for remediation of oil-contaminated soil.
Key words: basidiomycetes; bioremediation; hydrocarbon-utilizing microorganisms; oil-polluted soil.
тоды удаления углеводородов нефти из почвы и восстановления ее плодородия. При ликвидации разливов нефти на почву ведущими остаются механические и физико-химические методы очистки, позволяющие удалить основное количество загрязнения. Однако именно
биологические методы позволяют снизить концентрации вредных веществ в почве до нормативных показателей, восстановить ее биоце-
1
ноз, вернуть плодородие 1.
Традиционно биологические способы ре-медиации основаны на внесении в почву живых культур бактерий — нефтедеструкторов 2. В последнее время все большее внимание исследователей привлекают новые, с точки зрения биоремедиации почвы, организмы — грибы. Широко исследуется способность плесневых грибов утилизировать углеводороды нефти, успешно применяются биопрепараты, содержащие дрожжевые грибы, но практически не изучается такая обширная группа грибов, как базидиомицеты. Последние исследования подтверждают способность базидиоми-цетов утилизировать углеводороды нефти 3. При этом есть все основания полагать, что биодеструкции подвергаются не только легкие, но и тяжелые фракции нефти, представляющие главную сложность при биоремедиации. Полупродукты биотрансформации тяжелых фракций нефти доступны для утилизации углеводо-родокисляющими микроорганизмами (УОМ), присутствующими в почве в качестве естественных обитателей или внесенными в нее искусственно в составе биопрепаратов 4.
Идея совместного использования базиди-альных грибов и УОМ в составе комплексного биопрепарата открывает перспективы нового подхода к технологии очистки и восстановления плодородия почвы после аварийных разливов нефти и нефтепродуктов.
Целью работы являлось изучение возможности совместного применения базидиальных грибов и УОМ для повышения эффективности рекультивации нефтезагрязненных почв.
Известно, что многие базидиомицеты способны продуцировать антибиотики и другие вещества, угнетающие рост бактерий 5. В связи с этим возникает вопрос: насколько критичным является этот показатель с точки зрения использования конкретного штамма базидио-мицета в составе комплексного биопрепарата. Очевидно, что наиболее адекватной имитацией условий почвы, загрязненной нефтью, является модель с культивированием нефтеокисляю-щих агентов на твердом субстрате. Однако длительность процессов твердофазного культивирования, необходимость поддержания определенной влажности почвы и угроза ее контаминации быстрорастущими плесневыми грибами обусловили необходимость разработки упрощенной модели для экспресс-оценки эффективности различных нефтеокисляющих
агентов при их совместном использовании. Культивирование базидиомицетов и УОМ в жидкой питательной среде позволяет оперативно оценивать как эффективность утилизации нефти, так и интенсивность накопления биомассы.
Материалы и методы исследования
В качестве ассоциации УОМ с доказанной эффективностью был выбран коммерческий биопрепарат «Деворойл», предназначенный для биодеградации нефти и нефтепродуктов при загрязнении почв, представляющий собой искусственное сообщество углеводородокисля-ющих бактерий и дрожжей, успешно работающих в различных естественных и антропогенных экосистемах.
В работе использовали культуры ксилот-рофных базидиальных грибов из коллекции лаборатории биосинтеза биологически активных соединений НИИНА им. Г. Ф. Гаузе РАМН, относящихся к видам Fomitopsis pinícola и Trametes versicolor.
Наличие в культуральной жидкости бази-диомицетов таких веществ определяли методом диффузии в агар. Для получения погруженных культур базидиомицетов F. pinicola и T. versicolor использовали жидкую питательную среду следующего состава, г/л: MgSO4-7H2O — 0.5; КН2РО4 — 1; глюкоза — 20; мука пшеничная — 10; вода водопроводная — до 1000 мл. Среду разливали по 100 мл в колбы Эрленмей-ера и стерилизовали в автоклаве при 120 оС в течение 1 ч. Колбы засевали фрагментами музейных культур грибов на агаризованной среде и культивировали 5 сут на ротационной качалке (200 об/мин) при 27 оС. Для отделения вегетативного мицелия культуральную жидкость фильтровали через лавсановую ткань. Стерилизацию осуществляли методом вакуум-фильтрации культуральной жидкости через целлюлозные фильтры «Millipore» с диаметром пор 0.2 цм.
Навеску коммерческого препарата «Дево-ройл» массой 1 г растворяли в 100 мл воды, добавляли 0.015 г нитроаммофоска и культивировали 24 ч на ротационной качалке (200 об/мин) при 27 оС.
В стерильные чашки Петри разливали глюкозо-картофельный агар. На остывшую среду наносили 0.5 мл суточной культуры УОМ препарата «Деворойл» и равномерно распределяли ее по поверхности агара стерильным шпателем. С помощью стерильного пробойника проделывали в слое среды лунки,
в которые заливали по 0.15 мл стерильной культуральной жидкости грибов F. pinicola и T. versicolor. В качестве положительного кон-тро ля использовали 0.15 мл водного раствора, содержащего 0.3% гентамицина сульфата. Чашки культивировали 48 ч при 27 °С. О бак-териостатическом эффекте судили по зоне задержки роста УОМ вокруг лунок.
С целью более подробного изучения меж-популяционных взаимоотношений между ба-зидиальными грибами и УОМ в условиях, моделирующих разлив нефтепродуктов, проводили их совместное культивирование в жидкой питательной среде с нефтью. Использовали сырую туркменскую нефть, имеющую следующую характеристику: содержание углеводородов во фракциях НК-200 оС: парафиновых — 50—60 %, нафтеновых — 26—33 %, ароматических — 11—20 %. Во фракциях, выкипающих при температуре выше 200 оС, содержание аро-матики было несколько выше. Относительная плотность нефти при 20 оС с 420=0.864 г/мл 6. Для инактивирования контаминирующей микрофлоры нефть разливали по 200 мл в стеклянные банки объемом 1 л и герметично укупоривали металлическими крышками. Банки с нефтью стерилизовали автоклавированием при 120 оС в течение 1 ч. Контроль стерильности осуществляли путем посева нефти на плотные питательные среды: глюкозо-картофельный агар и сусло-агар.
Культивирование проводили в описанной выше питательной среде. В качестве посевного материала использовали 10 мл культуры УОМ препарата «Деворойл» со сроком культивирования 24 ч и 10 мл культуры T. versicolor со
сроком культивирования 72 ч. Были реализованы следующие варианты опыта:
— чистая культура T. versicolor;
— культура УОМ препарата «Деворойл»;
— комбинация культур T. versicolor и УОМ препарата «Деворойл».
В колбы вносили по 1 г (1.16 мл) стерильной нефти. В качестве контроля естественной убыли нефти в процессе эксперимента ее вносили в питательную среду без добавления углево-дородокисляющих агентов. В качестве контроля динамики накопления биомассы T. versicolor использовали чистую культуру базидиомицета без добавления нефти. Колбы культивировали на ротационной качалке (200 об/мин) при 27 оС. С целью сравнительной оценки естественной убыли нефти при культивировании на качалке и в стационарных условиях дополнительные колбы с питательной средой и нефтью оставляли без перемешивания. Каждый из вариантов эксперимента был выполнен в 3-х повторнос-тях. Отбор проб производили на 3, 6 и 9 сутки культивирования.
Вегетативный мицелий отделяли от куль-туральной жидкости методом фильтрации через лавсановую ткань и сушили до постоянного веса при температуре 40 оС. Массу воздушно-сухого мицелия с остаточной влажностью 6—8 % определяли весовым методом.
Содержание нефтепродуктов в образцах определяли с помощью концентратомера КН-2м фотометрическим методом 7. В качестве растворителя использовали четыреххлористый углерод. Измерения проводили в инфракрасной области спектра при длине волны 3.42 мт 8.
Рис. 1. Выявление веществ, тормозящих рост УОМ препарата «Деворойл», методом диффузии в агар:
А — опыт с фильтратом культуры T. versicolor (1) и F. pinicola (2). Б — положительный контроль с гентамицином.
Для микроскопического изучения взаимодействия клеток УОМ и гиф базидиомицетов использовали 3 суточные погруженные культуры базидиомицетов. Навеску в 1 г коммерческого нефтеокисляющего биопрепарата «Де-воройл» суспензировали в 100 мл стерильной водопроводной воды и культивировали 3 ч при 37 °С. В стерильной колбе смешивали по 10 мл взвеси базидиомицетов и бактерий, выдерживали 1 сут при 28 оС без перемешивания. После экспозиции мицелий трехкратно промывали физиологическим раствором и готовили из него препарат «раздавленная капля». В качестве контроля использовали препараты чистых культур базидиомицетов и культуры УОМ. Неокрашенные препараты исследовали методом фазово-контрастной световой микроскопии на микроскопе Olympus CX 41 при инструментальном увеличении в 1000 раз.
Результаты и их обсуждение
Совместное использование базидиомице-тов и УОМ в технологиях биоремедиации неф-тезагрязненных почв предполагает, что даже в условиях конкуренции за питательный субстрат эти компоненты биопрепаратов не должны оказывать друг на друга выраженное негативное воздействие. Так, в опыте с базидиоми-цетом F. pinícola не было выявлено влияния фильтрата его культуральной жидкости на рост УОМ препарата «Деворойл», как видно на рис. 1А. В то же время вокруг лунки с фильтратом культуральной жидкости T. versicolor образовалась зона задержки роста УОМ, сопоставимая с положительным контролем, приведенным на рис. 1Б.
По логике исследования, культуру T. versicolor, продуцирующую вещества, угнетающие развитие других компонентов биопрепарата, следовало исключить из дальнейшей работы. Однако высокий потенциал, выявленный у этого базидиомицета в опытах по колонизации нефтезагрязненного субстрата и утилизации углеводородов нефти 4, определил необходимость более подробного изучения взаимодействия T. versicolor с УОМ. При их совместном культивировании в жидкой среде, содержащей углеводороды нефти, был получен парадоксальный результат: наиболее интенсивную утилизацию углеводородов нефти обеспечивает именно комбинация УОМ с бази-диомицетом T. versicolor, как показано на рис. 2. Естественная убыль нефти в контрольном опыте составила 36% от начальной концентрации. При этом не было выявлено
достоверных различий в естественной убыли нефти в стационарных условиях и при перемешивании.
Рис. 2. Сравнительная оценка нефтеокисляющей активности T. versicolor, УОМ и их комбинации по отношению к контрольному опыту
- -
_____ _____
УГ- - - ■
0 1 2 i 4 5 б 7 К 9 10 И |1 м ч.сутки
■Т, Versicolor - нефть ш Г versicolor —Т. Versicolor + У' М 1 нефть
Рис. 3. Накопление биомассы T. versicolor в погруженной культуре
Каждый углеводородокисляющий агент в отдельности — T. versicolor и УОМ — проявили среднюю активность по биодеструкции нефти: соответственно 24% и 35% по отношению к контролю. Сочетанное действие этих двух агентов снизило содержание углеводородов на 53% по сравнению с контролем. При этом наблюдалось выраженное снижение интенсивности накопления биомассы базидиомицета в присутствии УОМ, что продемонстрировано на рис. 3. Не испытывая конкуренции со стороны УОМ, базидиомицет активно растет, утилизируя углеводороды нефти. Биомасса T. versicolor на 9-е сутки культивирования на среде с нефтью достигает значения 7.5 г/л против 5.2 г/л в контрольном опыте без не-
фти. Однако конкуренция за питательный субстрат со стороны УОМ сдерживает этот показатель на уровне 1.4 г/л. Взаимоотношения между базидиомицетом и УОМ имели выраженный антагонистический характер. При этом нельзя с уверенностью утверждать, что единственным механизмом контроля численности популяции базидиомицета со стороны УОМ является более эффективное использование питательного субстрата. Не исключена возможность синтеза отдельными компонентами ассоциации УОМ веществ, тормозящих рост мицелия T. versicolor.
При микроскопическом изучении УОМ препарата «Деворойл» были выявлены два основных морфологических типа микроорганизмов в его составе. Первый тип представлял собой палочковидные бактерии с терминально расположенными эндоспорами. Второй морфологический тип представляли дрожжепо-добные микроорганизмы. В результате исследования адгезии клеток УОМ обнаружено, что микроорганизмы, принадлежащие к обоим морфологическим типам, фиксируются на поверхности гиф мицелия T. versicolor. Большинство клеток располагалось вдоль гиф, увеличивая поверхность контакта. Вместе с тем отдельные клетки обоих морфологических типов фиксировались на мицелии полюсами, располагаясь перпендикулярно гифам. При этом палочковидные бактерии были зафиксированы на поверхности гиф концом, противоположным от эндоспоры. Эти факты свидетельствуют о возможности наличия у клеток УОМ активных центров, обеспечивающих специфическое взаимодействие с поверхностными структурами гиф базидиомицета. Описанное явление позволяет предположить, что при росте мицелия базидиомицета в почве будет осуществляться транспорт фиксированных на поверхности гиф УОМ в более глубокие слои и обеспечиваться доступ воды и воздуха.
Таким образом, в ходе исследования были выявлены сложные межпопуляционные отношения базидиомицета T. versicolor и УОМ препарата «Деворойл», характеризуемые как положительными, так и отрицательными эффектами.
К положительным эффектам можно отнести факт сочетанного воздействия базидиоми-цета и УОМ при утилизации нефти. Значение
показателя интенсивности биодеструкции нефти при использовании обоих углеводород-окисляющих агентов приближается к значению суммы этих показателей при раздельном применении базидиомицета и УОМ. За 9 сут эксперимента содержание нефти уменьшилось на 86% от начальной концентрации.
К отрицательным эффектам можно отнести синтез T. versicolor веществ, тормозящих развитие всех компонентов ассоциации УОМ препарата. В свою очередь, присутствие УОМ снижает показатели накопления биомассы ба-зидиомицета более чем в 5 раз вследствие конкуренции за доступный питательный субстрат.
Однако, с точки зрения практического применения биопрепаратов на основе базидио-мицетов и УОМ для ремедиации почвы, эти факты могут иметь большое положительное значение. Численность популяций двух компонентов биопрепарата будет поддерживаться на уровне, достаточном для активной утилизации углеводородов в загрязненной нефтью почве. В то же время, за счет действия описанных механизмов, чрезмерный рост их популяций не будет представлять угрозы для естественного микробиоценоза почвы, сохраняя его видовое разнообразие.
Литература
1. Парамонова И. Е., Кравченко Н. Л., Суюнова А. Б. и др. // Биотехнология. Теория и практика.-2010.- №4.- С.54.
2. Рогозина Е. А., Андреева О. А., Жаркова С. И. и др. // Нефтегазовая геология. Теория и практика.- 2010.- Т.5, №3.- С.37.
3. Позднякова Н. Н., Никитина В. Е., Турковс-кая О. В. // Прикладная биохимия и микробиология.- 2008.- Т.44, №1.- С.69.
4. Ильчибакиева Э. У. Автономова А. В. Марченко М. Ю. и др. // Иммунопатология, аллергология, инфектология.- 2009.- №2.- С.179.
5. Белова Н. В., Яковлева Н. С. // Успехи медицинской микологии.- 2005.- Т.5.- Г.6.-С. 181.
6. Нефти СССР. Справочник. Т IV. Нефти средней Азии, Казахстана, Сибири и о. Сахалин.-М.: Химия, 1974.- 792 с.
7. ГОСТ Р 51797-2001 Вода питьевая. Метод определения содержания нефтепродуктов- М.: Госстандарт, 2001.- 17 с.
8. ФР.1.31.2010.07432 (ПНД Ф 14.1:2:4.168-2000) Методика выполнения измерений массовой концентрации нефтепродуктов в питьевых, природных и очищенных сточных водах методом ИК-спектрофотометрии на концентратомере КН-2м.
Исследование проводится в рамках Федеральных целевых программ «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009—2013 годы» и «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007—2013 годы».
