CC BY
13
УДК 596.5(08)
DOI: 10.24412/1728-323X-2023-3-10-13
БАРКОДИНГОВЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ЛЕТУЧИХ МЫШЕЙ (СИМОРТЕМА, УЕБРЕМШЮМЮЛЕ) В СРЕДНЕМ ПОВОЛЖЬЕ
Е. А. Артемьева, доктор биологических наук, доцент, Ульяновский государственный педагогический университет им. И. Н. Ульянова, hart5590@gmail.com, г. Ульяновск, Россия,
A. В. Мищенко, кандидат биологических наук, доцент, Ульяновский государственный педагогический университет им. И. Н. Ульянова, a.misch@mail.ru, г. Ульяновск, Россия,
B. А. Кривошеев, кандидат биологических наук, доцент, Ульяновский государственный педагогический университет им. И. Н. Ульянова, krivosh@list.ru, г. Ульяновск, Россия
Аннотация. В статье рассматриваются молекулярно-генетические особенности рукокрылых Среднего Поволжья (Ульяновской области). В течение полевого сезона 2021—2022 гг. проводились баркодинговые молекулярно-генетические исследования рукокрылых в Ульяновской области (Среднее Поволжье). В результате молекулярно-генетических исследований впервые проведено штрих-кодирование пяти видов рукокрылых в Ульяновской области (Среднее Поволжье): ночница прудовая Myotis dasycneme, ночница водяная Myotis daubentonii, ночница Давида Myotis davidii, нетопырь лесной Pipistrellus nathusii, кожан двухцветный Vespertilio murinus. Все исследованные виды рукокрылых показали высокую генетическую обособленность друг от друга: уровни генетических дистанций составляют от 10 до 100. Данные генетического анализа выборки лесного нетопыря Pipistrellus nathusius указывают на генетическую неоднородность его левобережной популяции.
Изученные экземпляры усатых ночниц однозначно отделены от остальных клад дендрита и принадлежат к одноименной группе. По предварительному исследованию морфологических признаков они должны быть отнесены в форме aurescens, которая сейчас обозначается как davidii [11]. Однако имеющиеся последовательности из GenBank показали, что davidii — это восточно-азиатская форма. Все формы davidii описаны из Восточного Китая и наверняка являются самостоятельным видом, который к нашей выборке не имеет отношения. Изучаемые нами усатые ночницы оказались ближе к Myotis aurascens, чем к Myotis davidii. Поэтому материал из региональной популяции должен относиться к европейской группе, а не к азиатской. Самые высокие значения показывает внешняя группа из GenBank (100).
Abstract. The article examines the molecular-genetic features of bats in the Middle Volga Region (the Ulyanovsk Region). During the 2021—2022 field season barcoding molecular genetic studies of bats were carried out in the Ulyanovsk Region (the Middle Volga Region). As a result of molecular genetic studies, for the first time, barcoding of 5 species of bats in the Ulyanovsk Region (the Middle Volga Region) was carried out: Myotis dasycneme,Myotis daubentonii, Myotis davidii, Pipistrellus nathusii, Vespertilio murinus. As a result of molecular genetic studies, for the first time, bar-coding of colonies of 5 species of bats in the Ulyanovsk Region (the Middle Volga Region) has been carried out. All studied species of bats showed high genetic isolation from each other: the levels of genetic distances range from 10 to 100. The data from a genetic analysis of the sample of Pipistrellus nathusius indicate the genetic heterogeneity of its left-bank population. The studied specimens of baleen bats are unambiguously separated from the rest of the dendrite clades and belong to the group of the same name. According to a preliminary study of morphological characters, they should be classified in the form aurescens, which is now designated as davidii [11]. However, the available sequences from GenBank showed that davidii is the East Asian form. All forms of davidii are described from Eastern China and are probably an independent species, which is not related to our sample. The bats we studied turned out to be closer to Myotis aurascens than to Myotis davidii. Therefore, the material from the regional population should belong to the European group, and not to the Asian one. The highest value is shown by the outgroup from GenBank (100).
Ключевые слова: летучие мыши, популяция, молекулярно-генетический подход, Ульяновская область, Среднее Поволжье.
Keywords: bats; population; molecular genetic approach; the Ulyanovsk Region; the Middle Volga Region.
Введение
Рукокрылые (Chiroptera, Vespertilionidae) являются индикаторной группой, которая отражает состояние природных биотопов и их сохранность. В условиях обитания в населенных пунктах часть видов рукокрылых становятся синантропными, являясь перелетными или оседлыми видами. Практически все известные виды рукокрылых региона являются уязвимыми и редкими, занесены в Красную книгу Ульяновской области [4] и нуждаются в охране. Изучение фауны рукокрылых региона остается по-прежнему актуальной, несмотря на проводившиеся ранее исследования многих авторов [1—3, 5—8].
Цель работы: выявление молекулярно-генети-ческих особенностей рукокрылых в Ульяновской области (Среднее Поволжье) с помощью методов молекулярной биологии.
Материал и методы
В течение полевого сезона 2021—2022 гг. проводились баркодинговые исследования рукокрылых в Ульяновской области (Среднее Поволжье).
Объектами исследования и проведения моле-кулярно-генетического анализа являются образцы крови, тканей, шерсти и помета пяти видов рукокрылых (Chiroptera, Vespertilionidae): ночница прудовая Myotis dasycneme Бо1е, 1825; ночница
10
№ 3, 2023
водяная Myotis daubentonii Kuhl, 1817; ночница Давида Myotis davidii (Peters, 1869); нетопырь лесной Pipistrellus nathusii Keiserling et Blasius, 1839; кожан двухцветный Vespertilio murinus Linnaeus, 1758.
Всего исследовано пять видов летучих мышей (Vespertilionidae), 20 особей, 20 проб для молеку-лярно-генетического анализа (семь проб прудовой ночницы и три пробы водяной ночницы; две пробы ночницы Давида; семь проб лесного нетопыря; одна проба двухцветного кожана); определение видов проводилось по стандартной методике [9]. Также определялись пол и возраст летучих мышей [9]. После всех манипуляций зверьки были возвращены в свои биотопы и колонии.
Выделение ДНК проводили с помощью набора Genomic DNA Purification Mini Kit. Качество выделенной ДНК проверяли с использованием спектрофотометра [10].
Амплификацию участка гена цитохром окси-дазы I проводили с использованием праймеров C_VF 1 LFt 1 /C_VR 1 LRt 1 [22]. При проведении ПЦР применялся следующий состав реакционной смеси (на 20 мкл): буфер (1X), праймеры (по 0,5 мкМ каждого), dNTPs (250 мкМ), taq-поли-мераза (5 ед.), ДНК-матрица (1 мкл), деионизи-рованная вода (до финального объема). Параметры полимеразной цепной реакции (ПЦР) были следующими: 6 мин при +95 °C, 30 сек при +95 °C, 30 секунд при +52 °C и 45 сек при +72 °C (всего 35 циклов). Качество продукта ПЦР определяли путем аналитического гель-электрофореза.
Полученные ПЦР-продукты очищали и проводили сиквенсную реакцию с флюоресцентно-меченными дезоксирибонуклеотидами (ddNTP) с последующей очисткой набора терминированных фрагментов. В результате секвенирования полученного фрагмента гена цитохром оксидазы I получали последовательности нуклеотидов, которые подвергали биоинформационной обработке. Последовательности выровнены с помощью программ ClustalW2 и JalView построено первичное филогенетическое дерево для исследуемых видов с указанием генетических дистанций. Для сравнения из GenBank выбраны последовательности Myotis daubentonii MT407292.1 длиной 492 п. о.; Myotis brandtii JF442928.1 длиной 491 п. о.; Myotis aurascens JF 442863.1 длиной 491 п. о.; Myotis mystacinus MT 407305.1 длиной 499 п. о., а также из Bold Systems (https://www.boldsystems.org/) — Myotis davidii GBMNF2216-22 длиной 488 п. о., которые представляют внешнюю группу.
Построение итогового филогенетического дерева и определение генетических дистанций проводили с использованием пакета программ MEGA и бидструп-поддержки (bootstrap test).
Результаты
Выявлено пребывание колоний следующих видов рукокрылых в Ульяновской области: ночница прудовая Myotis dasycneme Boie, 1825 (обычный вид); ночница водяная Myotis daubentonii Kuhl, 1817 (обычный вид); ночница степная, или Давида Myotis davidii (Peters, 1869) (редкий вид). Нетопырь лесной Pipistrellus nathusii Keiserling et Blasius, 1839 (уязвимый редкий вид). Включен в Приложение 3 Красной книги региона [4]. Кожан двухцветный Vespertilio murinus Linnaeus, 1758 (уязвимый редкий вид). Занесен в Красную книгу Ульяновской области (Приложение 3) [4].
Результаты молекулярно-генетического исследования л етучих мышей в Среднем Поволжье показаны на рис. 1.
В результате молекулярно-генетических исследований впервые проведено штрих-кодирование колоний пяти видов рукокрылых в Ульяновской области (Среднее Поволжье) и выявлено их генетическое разнообразие. Все исследованные виды рукокрылых показали генетическую обособленность друг от друга: уровни генетических дистанций составляют от 10 до 100. Данные генетического анализа выборки лесного нетопыря Pipistrellus nathusius указывают на генетическую неоднородность его левобережной популяции.
Изученные экземпляры усатых ночниц однозначно отделены от остальных клад дендрита и принадлежат к одноименной группе. По предварительному исследованию морфологических признаков они должны быть отнесены в форме aurescens, которая сейчас обозначается как davidii [11, 12]. Однако имеющиеся последовательности из GenBank показали, что davidii — это восточно-азиатская форма. Все формы davidii описаны из Восточного Китая и наверняка являются самостоятельным видом, который к нашей выборке не имеет отношения.
Изучаемые нами усатые ночницы оказались ближе к Myotis aurascens, чем к Myotis davidii. Поэтому материал из региональной популяции должен относиться к европейской группе, а не к азиатской.
Выбранные из GenBank последовательности внешней группы: Myotis daubentonii MT407292.1; Myotis brandtii JF442928.1; Myotis aurascens JF 442863.1; Myotis mystacinus MT 407305.1, а также из Bold Systems (https://www.boldsystems.org/) — Myotis davidii GBMNF2216-22 подверждают таксономическую самостоятельность исследуемых форм рукокрылых.
Вся внешняя группа из GenBank значительно удалена от исследованных экземпляров, что может указывать на региональное своеобразие изу-
№3, 2023
11
15
20
27
41
23
42
100
37
99
100
100
100
27.07.21 Myotis dasycneme 9 27.05.21 Myotis dasycneme 10 27.05.21 Myotis dasycneme 11 27.05.21 Myotis dasycneme 8 21.07.21 Pipistrellus nathusii Э 27.05.21 Myotis dasycneme 15 25.07.21 Vespertilio murinus 16 21.07.21 Myotis daubentoni Э 28.05.21 Pipistrellus nathusius 14 27.07.21 Myotis dasycneme 6 21.07.21 Pipistrellus nathusii Э 21.07.21 Myotis davidii 4 27.05.21 Myotis davidii 5 21.07.21 Myotis dasycneme 1 21.07.21 Pipistrellus nathusius 2 JF442928.1 Myotis brandtii JF442863.1 Myotis aurascens MT407292.1 Myotis daubentonii MT407305.1 Myotis mystacinus GBMNF2216-22 Myotis davidii
Рис. 1. Дендрограмма генетического сходства особей из колоний рукокрылых (2021 г.) по цитохрому с-оксидазы I
чаемых популяций д анных видов от представленных в GenBank образцов (рис. 1).
Выводы
1. В результате молекулярно-генетических исследований впервые проведено штрих-кодирование колоний пяти видов рукокрылых в Ульяновской области (Среднее Поволжье) и выявлено их генетическое разнообразие.
2. Все исследованные виды рукокрылых показали высокую генетическую обособленность друг от друга: уровни генетических дистанций составляют от 10 до 100.
3. Данные генетического анализа выборки лесного нетопыря Pipistrellus nathusius указывают
на генетическую неоднородность его левобережной популяции.
4. Внешняя группа ОепБапк показывает очень высокие значения (100), что может указывать на региональное своеобразие изучаемых популяций данных видов и подтверждает таксономическую самостоятельность исследуемых форм рукокрылых.
Благодарности. Авторы признательны О. Г. Салтыковой за консультации и помощь в сборе рукокрылых. Особую благодарность авторы выражают Д. Г. Смирнову, И. В. Загороднюку за консультации по определению видов летучих мышей.
Библиографический список
1. Безруков В. А., Каменек В. М. Видовой состав рукокрылых (Chiroptera) Ульяновской области // Геоэкологические проблемы Среднего Поволжья: сб. науч. тр. регион. науч. семинара. — Ульяновск: УлГУ, 2008. — С. 14—17.
2. Безруков В. А., Смирнов Д. Г. Видовой состав и особенности распространения рукокрылых (Chiroptera: Mammalia) на территории Ульяновской области // Известия ПГПУ им. В. Г. Белинского. — 2012. — Т. 29. — С. 190—200.
3. Бобринский Н. А., Кузнецов Б. А., Кузякин А. П. Определитель млекопитающих СССР. М.: Просвещение, 1965. — 382 с.
12
№ ь, vovb
4. Красная книга Ульяновской области / под науч. ред. Е. А. Артемьевой, А. В. Масленникова, М. В. Корепова. — М.: Издательство «Буки Веди», 2015. — 550 с.
5. Кузнецов Б. А. Определитель позвоночных животных фауны СССР (пособие для учителей). Ч. 3. Млекопитающие. — М.: Просвещение, 1975. — 208 с.
6. Крускоп С. В. К распространению нетопырей комплекса Pipistrelluspipistrellus/pygmaeus (Chiroptera, Vespertilionidae) в России // Plecotus et al. — 2007. — № 10. — С. 36—46.
7. Смирнов Д. Г., Безруков В. А., Ильин В. Ю. Использование пространства местообитания и кормового времени Myotis daubentonii (Chiroptera, Vespertilionidae) на Самарской Луке // Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Естественные науки. — 2017. — Т. 4, № 20. — С. 5—19.
8. Стрелков П. П., Бунтова Е. Г. Усатая ночница (Myotis mystacinus) и ночница Брандта (M. brandti) в СССР и взаимоотношения этих видов. Сообщение 1 // Зоологический журнал. — 1982. — Т. 61, № 8. — С. 1227—1243.
9. Dietz C., von Helversen O. Illustrated Identification key to the bats of Europe. Tuebingen & Erlangen, 2004. — 72 p.
10. Ivanova N. V., Zemlak T. S., Hanner R. H., Hebert P. D. N. Universal primer cocktails for fish DNA barcoding // Molecular Ecology Notes. — 2007. — Vol. 7, iss. 4. — P. 544—548.
11. Zagorodniuk I. Cryptic diversity and changes of views on mammal fauna composition // In: Zagorodniuk I. (ed.). Monitoring of Mammal Fauna. Vol. 10. Luhansk, 2010. P. 13—27.
12. Zhigalin A. New data on David's myotis, Myotis davidii (Peters, 1869) (Mammalia, Chiroptera, Vespertilionidae), in Siberia and the Urals. Biodiversity Data Journal, 2019. Vol. 7. № e34211, P. 2—12.
BARCODING RESEARCH OF BATS (CHIROPTERA, VESPERTILIONIDAE) IN THE MIDDLE VOLGA (THE ULYANOVSK REGION)
E. A. Artemyeva, Ph. D. (Biology), Dr. Habil., Associate Professor, I. N. Ulyanov Ulyanovsk State Pedagogical University, hart5590@gmail.com, Ulyanovsk, Russia,
A. V. Mishchenko, Ph. D. (Biology), Associate Professor, I. N. Ulyanov Ulyanovsk State Pedagogical University, a.misch@mail.ru, Ulyanovsk, Russia,
V. A. Krivosheev, Ph. D. (Biology), Associate Professor, I. N. Ulyanov Ulyanovsk State Pedagogical University, a.misch@mail.ru, Ulyanovsk, Russia
References
1. Bezrukov V. A., Kamenyok V. M. Vidovoj sostav rukokrylyh (Chiroptera) Ul'yanovskoj oblasti [Spices composition of bats (Chiroptera) of the Ulyanovsk Region]. Geoekologicheskieproblemy Srednego Povolzh'ya: sb. nauch. tr. region. nauch. seminara. Ul'yanovsk, UlGU, 2008. P. 14—17 [in Russian].
2. Bezrukov V. A., Smirnov D. G. Vidovoj sostav i osobennosti rasprostraneniya rukokrylyh (Chiroptera: Mammalia) na territorii Ul'yanovskoj oblasti [Spices composition and peculiarities of bat's distribution (Chiroptera: Mammalia) in the territory of the Ulyanovsk Region]. Izvestiya PGPU im. V. G. Belinskogo. 2012. Vol. 29. P. 190—200 [in Russian].
3. Bobrinskiy N. A., Kuznetsov B. A., Kuzyakin A. P. Opredelitel' mlekopitayushchih SSSR. [Guide of mammals of the USSR]. Moscow, Prosveshchenie. 1965. 382 p. [in Russian].
4. Krasnaya kniga Ul'yanovskoj oblasti / pod nauch. red. E. A. Artem'evoj, A. V. Maslennikova, M. V. Korepova. [The Red Data Book of the Ulyanovsk Region]. Moscow, Buki Vedi Publishing House, 2015. 550 p.] [In Russian].
5. Kuznetsov B. A. Opredelitel' pozvonochnyh zhivotnyh fauny SSSR (posobie dlya uchitelej). Ch. 3. Mlekopitayushchie. [Key to Vertebrate Animals of the Fauna of the USSR (a manual for teachers). Part 3. Mammals]. Moscow, Education, 1975. 208 p. [In Russian].
6. Kruskop S. V. K rasprostraneniyu netopyrej kompleksa Pipistrellus pipistrellus/pygmaeus (Chiroptera, Vespertilionidae) v Ros-sii [On the distribution of bats of the Pipistrellus pipistrellus/pygmaeus complex (Chiroptera, Vespertilionidae) in Russia]. Plecotus et al. 2007. No. 10. P. 36—46 [In Russian].
7. Smirnov D. G., Bezrukov V. A., Il'in V. Yu. Ispol'zovanie prostranstva mestoobitaniya i kormovogo vremeni Myotis daubentonii (Chiroptera, Vespertilionidae) na Samarskoj Luke [The use of habitat space and feeding time for Myotis daubentonii (Chiroptera, Vespertilionidae) on the Samarskaya Luka]. Izvestiya vysshih uchebnyh zavedenij. Povolzhskij region. Estestvennye nau-ki. 2017. Vol. 4, No. 20. P. 5—19 [In Russian].
8. Strelkov P. P., Buntova E. G. Usataya nochnica (Myotis mystacinus) i nochnica Brandta (M. brandti) v SSSR i vzaimoot-nosheniya etih vidov. Soobshchenie 1 [Mustachioed bat (Myotis mystacinus) and Brandt's bat (M. brandti) in the USSR and relationships between these species. Message 1]. Zoologicheskij zhurnal. 1982. Vol. 61, No. 8. P. 1227—1243 [In Russian].
9. Dietz C., von Helversen O. Illustrated Identification key to the bats of Europe. Tuebingen & Erlangen, 2004. 72 p.
10. Ivanova N. V., Zemlak T. S., Hanner R. H., Hebert P. D. N. Universal primer cocktails for fish DNA barcoding. Molecular Ecology Notes. 2007. Vol. 7, iss. 4. P. 544—548.
11. Zagorodniuk I. Cryptic diversity and changes of views on mammal fauna composition. In: Zagorodniuk I. (ed.). Monitoring of Mammal Fauna. Vol. 10. Luhansk, 2010. P. 13—27.
12. Zhigalin A. New data on David's myotis, Myotis davidii (Peters, 1869) (Mammalia, Chiroptera, Vespertilionidae), in Siberia and the Urals. Biodiversity Data Journal, 2019. Vol. 7. № e34211. P. 2—12.
№3, 2023
13
