CC BY
28
С.А. Межерицкий1' 2, P.M. Тахауов1' 2, А.Б. Карпов1' 2, Н.В. Литвя ков1' 2,
Е.О. Васильева1' 2, О.О. Гончарик1' 2, М.Б. Фрейдин1, Е.Н. Альбах1' 2, А.А. Бондарюк1' 25 Е.Б. Миронова3' Е.В. Скобельска я\ Ю.В. Семенова3' Г.Б. Некрасов3' А.С. Изосимов39 А.А. Гагарин3
Банк биологического материала здоровых работников Сибирского химического комбината
1 Северский биофизический научный центр ФМБА России, г Северск 2 Проблемная научно-исследовательская лаборатория Томского научного центра Сибирского отделения РАМН, г. Северск 3 Клиническая больница № 81 ФМБА России, г. Северск
R.M. Takhauov1' 2, A.B. Karpov1' 2> S.A. Mezheritsky1' 2> N.V. Litvyakov1' 2S
E.O. Vasilyeva1' 29 O.O. Goncharik1' 29 M.B. Freydin\ E.N. Albach1' 29 A.A. Bondaruk1' 25 E.B. Mironova39 E.V. Skobelskaya1' 29 Yu.V. Semenova35 G.B. Nekrasov39 A.S. izosimov39 A.A. Gagarin3
Healthy employees biological material bank at the Siberian group of chemical enterprises
1 Seversk Biophysical Research Center at the Russian Federal Medical and Biological Agency, Seversk 2 Basic Research Laboratory «Radiation Medicine and Radiobiology» at Tomsk Scientific Center SB RAMS, Seversk, 3 Clinical Hospital Nr. 81 at the Russian Federal Medical and Biological Agency, Seversk, Russia
Keywords: biological material bank, DNA samples, cytogenetic samples, radiation exposure.
Seversk Biophysical Research Centre has been engaged in creating biological material bank Siberian Group of Chemical Enterprises (SGCE) employees and residents of neighboring territories (Seversk city) since 2002. According to the selected methodology,for each participant, this bank stores: a DNA sample,RNA sample and 7 ml blood sample (backup sample). Every cytogenetic sample was checked on frequency and spectrum of chromosome aberrations. The biological material bank stores blood and DNA of 1 390 healthy employees of SGCE. Average employees' age is 57.8±0.32 years, 648 of them (48%) were exposed to external radiation with an average dose of 171.7±9.2 mSv; 63 (5%) persons were exposed to internal radiation, with an average content of 239Pu 53.3±5.5 nCi and 494 (34%) patients were exposed to combined radiation. The database of Regional Medical and Dosimetric Register has info on: age, external radiation doses, Pu dose, employment history, past medical history, cause of death and etc...
Ключевые слова: банк биологического материала, образцы ДНК, цитогенетические препараты, радиационное воздействие.
Цель: В 2002 г. в Северском биофизическом научном центре было начато формирование банка биологического материала (ББМ) работников радиационно-опасного производства Сибирского химического комбината (СХК) — &Здоровые работники СХК». Согласно разработанной методологии,ББМ содержит несколько единиц хранения для каждого человека: образец ДНК, образец РНК и образец крови объемом 7 мл (резервный образец). Для каждого субъекта хранения получены цитогенетические препараты для оценки частоты и спектра хромосомных аберраций. Результаты: ББМ содержит кровь,ДНК и РНК 1390 человек, средний возраст — 57,8±0,32 лет, из них 649 (48%) человек подверглись только внешнему облучению со средней дозой 171,7±9,2 мЗв; 63 (5%) человека подверглись только внутреннему облучению,среднее содержание 239Ри — 53,3±5,5 нКи; 494 (34%) человека подверглись сочетанному облучению. Информация о возрасте, дозах внешнего облучения,
содержании плутония, стаже работы, профессиональном маршруте, перенесенные важнейших заболеваниях в отношении доноров указанного ББМ содержится в базе данных регионального медико-дозиметрического регистра персонала СХК. Выводы: ББМ «Здоровые работники СХК» создается для сохранения биоматериала профессионалов, занятых на радиационно-опасном производстве и длительное время контактирующих с источниками техногенного облучения. На материале ББМ с использованием широкого спектра современные цитогенетических и молекулярно-генетических методов проводятся исследования по выяснению генетических эффектов радиационного воздействия низкой интенсивности, изучению маркеров и механизмов индивидуальной чувствительности человека к радиационному воздействию, а также по оценке роли радиационного фактора в патогенезе наиболее значимых заболеваний человека.
It is our priority to have and operate biological material bank with samples of every employee working at hazardous production facility, especially at nuclear production facility. It is crucially important to preserve biological material of these employees, who are growing less due to the natural loss, for long (20-40 years). It is also important to collect DNA samples from the immediate relatives of nuclear facilities employees, to establish the ground for large-scale work to explore long-term effects of prolonged exposure to radiation.
С расшифровкой человеческого генома и бурным развитием молекулярно-генетических технологий стало возможным изучение механизмов развития основных заболеваний и патологических состояний, а также эффектов воздействия различных факторов, в том числе радиационного, на субклиническом уровне для разработки патогенетически обоснованных методов диагностики, лечения и профилактики. В этой связи возникла необходимость сбора и сохранения генетического материала лиц, подвергавшихся воздействию данных факторов. Оптимальным был признан способ сохранения биологического материала в виде специальных банков [5; 8; 9; 14; 15]. Для проведения исследований по оценке генетических эффектов долговременного радиационного воздействия низкой интенсивности, изучения механизмов и маркеров индивидуальной радиочувствительности человека (ИРЧ), в Северском биофизическом научном центре ФМБА России (СБН Центр) в 2002 г. было начато формирование банка биологического материала (ББМ) здоровых работников Сибирского химического комбината (СХК). Донорами ББМ являются работники крупнейшего в мире комплекса предприятий атомной индустрии — СХК. Данное предприятие начало функционировать в 1952 г., 7 августа 1953 г. была получена первая партия обогащенного урана промежуточной концентрации, а 20 но-
ября 1955 г. был введен в эксплуатацию первый атомный реактор И-1. Следует подчеркнуть, что на протяжении всего периода функционирования СХК на его предприятиях не было значимых радиационных аварий и инцидентов, следствием которых стало бы переоблучение значительных групп персонала СХК и населения закрытого административно-территориального образования (ЗАТО) Северск.
В 2000-2002 гг. в СБН Центре был создан региональный медико-дозиметрический регистр (РМДР) персонала СХК и населения ЗАТО Северск. РМДР содержит персональные данные обо всех работниках СХК за все годы деятельности предприятия. Общая численность работников, нанятых с начала строительства комбината, составила около 66 500 человек. В базу данных РМДР вносятся информация о причинах смерти всех жителей ЗАТО Северск, умерших в городе, а также дата и причина смерти бывших работников СХК, выехавших за пределы ЗАТО Северск и сменивших место жительства.
Методика сбора и верификации информации о донорах ББМ «Здоровые работники СХК»
Необходимо уточнить: используя термин «здоровые», мы имеем в виду, что среди доноров этого ББМ нет больных злокачественными новообразованиями (ЗНО) и острым инфарктом миокарда (ОИМ).
Однако, принимая во внимание тот факт, что большая часть доноров этой группы старше 45 лет, разумеется, их нельзя считать здоровыми людьми в обычном понимании этого слова.
1. Кадровая информация: работников СХК идентифицировали на основании индивидуальных регистрационных карточек, которые хранятся в секторе учета отдела кадров СХК. Для каждого человека была извлечена следующая информация: Ф.И.О., дата рождения, дата поступления на СХК и завод, профессия. Для уволенных работников была получена информация о дате увольнения. Детальные сведения о профессиональном маршруте, т.е. о перемещениях из одного подразделения в другое в пределах завода, и изменении профессии была получена в секторах учета каждого отдельного завода.
2. Информация о жизненном статусе: адреса всех граждан в возрасте старше 16 лет регистрируются в карточке соответствующего адресного бюро. В этих карточках иногда содержатся сведения о смене фамилии. Информация о дате и причине смерти поступала из различных источников. Для уволенных в связи со смертью — из отдела кадров. Верификация даты и причины смерти осуществлялась также в патолого-анатомическом отделении клинической больницы № 81 ФМБА России (КБ № 81), а для умерших после увольнения и переехавших — в адресных бюро соответствующих населенных пунктов. Кроме того, информация о факте смерти и причинах смерти лиц, выехавших за пределы ЗАТО Северск, поступала от родственников согласно посылаемым запросам.
Кодирование причин смерти осуществляется по международной классификации болезней 10-го пересмотра (МКБ-10) независимо от года смерти.
3. Информация о дозах внешнего облучения: данные об индивидуальных дозах внешнего у-излучения, измеренных с помощью фотопленочных и термолюминесцентных дозиметров, были получены из отдела охраны труда, ядерной и радиационной безопасности СХК. Индивидуальный дозиметрический контроль (ИДК) персонала проводится с момента ввода в действие основных тех-
нологических процессов с 1953 г. В период 1958—1998 гг. в системе контроля индивидуальной дозы у-излучения применялся пленочный дозиметр; первые термолюминесцентные дозиметры эксплуатировались в период 1988—2003 гг. С 1998 г. на СХК эксплуатируется автоматизированный комплекс индивидуальной дозиметрии с термолюменисцент-ными дозиметрами. Данный комплекс полностью заменил устаревшие пленочные и термолюминесцентные дозиметры.
В соответствии с правилами организации дозиметрического контроля ИДК осуществляется на рабочих местах, где уровень у-излучения может достигать 30% допустимой дозы радиационного воздействия в год, поэтому не все лица, включенные в РМДР, имеют данные ИДК. В РМДР содержатся индивидуальные дозы облучения работников СХК за каждый год работы и суммарные накопленные дозы облучения за весь период. До настоящего момента верификация доз внешнего облучения не проводилась.
Диапазон доз внешнего облучения работников СХК — от 0,03 до 1800 мЗв. Число работников, контролировавшихся по внешнему облучению, составляет 16 074 человека. При этом у 89,94% суммарная накопленная доза внешнего облучения не превышает 200 мЗв.
Только с 2002 г. на СХК проводится контроль индивидуальной дозы хронического облучения персонала в полях нейтронного излучения. До 2002 г. на СХК не проводился индивидуальный контроль по облучению нейтронами, при этом лишь немногим более 5% персонала СХК, находящегося под ИДК, контролируется по нейтронному облучению.
Для населения ЗАТО Северск суммарная эквивалентная доза облучения всего тела в период 1970—1999 гг. и средняя годовая эффективная доза облучения в период 2000— 2005 гг. были многократно ниже предельно допустимых доз (до 1999 г. предел доз составлял 500 мбэр/год, с 2000 г. — 1 мЗв/год).
4. Информация о внутреннем облучении: информация о работниках СХК, подвергавшихся внутреннему облучению, получена в биофизической лаборатории Центра гигиены и эпидемиологии № 81 ФМБА России. Контролировали по внутрен-
нему облучению 8355 человек, из числа которых 3525 работникам проводили стационарное биофизическое определение содержания 239Ри на фоне введения пентацина. Однако в отличие от персонала производственного объединения «Маяк» число работников СХК, имевших высокое содержание 239Ри в организме, было существенно ниже.
5. Источники медицинской информации: источником медицинской информации является архив медицинской документации СБН Центра. Архив содержит около 135 242 единиц хранения, среди которых более 24 000 амбулаторных карт бывших работников СХК, протоколы аутопсий с 1949 по 2011 г., журналы гистологических исследований с 1950 по 2011 г. Также архив содержит более 65 000 историй болезни работников СХК и жителей ЗАТО Северск, проходивших обследование и лечение в стационарных отделениях КБ № 81 по поводу следующих заболеваний: ЗНО (солидные раки, независимо от локализации — С00—С80); гемобла-стозы (С81—С96); заболевания щитовидной железы (Е00—Е07); врожденные пороки развития (000-089); ОИМ (121); острые нарушения мозгового кровообращения (внутримозговое кровоизлияние — 161 и инфаркт мозга — 163); сахарный диабет (Е10—Е14). Выбор данных нозологических форм обусловлен, с одной стороны, их значимостью в структуре заболеваемости и смертности населения, с другой — необходимостью проведения углубленных исследований по выяснению роли радиационного фактора в патогенезе данных заболеваний и отнесения их к возможным стохастическим эффектам долговременного радиационного воздействия низкой интенсивности. Источником информации служит и медицинская документация КБ № 81 (действующие медицинские карты амбулаторных и стационарных больных, журналы клинической лаборатории) и учреждений здравоохранения областного центра (г. Томска) , где также проходят лечение сотрудники СХК. КБ № 81 является единственным крупным лечебно-профилактическим учреждением, оказывающим основной объем медицинской помощи персоналу СХК и населе-
нию ЗАТО Северск. Данное обстоятельство практически исключает вероятность потери данных.
Методика сбора биологического материала
Забор биологического материала производится только при подписании донором информированного согласия. Добровольное согласие составлено в соответствии со статьями 30—33 «Основ законодательства Российской Федерации об охране здоровья граждан» № 5487-1 от 22 июля 1993 г., а также в соответствии с частью 5 Правил надлежащей клинической практики ( Good Clinical Practice — GCP) Международной конференции по гармонизации (International Conference on Harmonisation — ICH).
Список потенциальных доноров из числа здоровых работников СХК составляется на основании целевой выборки из базы данных РМДР, доноры приглашаются для сдачи крови в лабораторию геномной медицины СБН Центра.
После поступления крови и информированного согласия в лабораторию геномной медицины донору присваивается уникальный персональный идентификационный номер (ПИН), представляющий собой комбинацию букв и цифр, его ПИН идентичен таковому в базе данных РМДР. Доступ к кодификатору базы данных ББМ имеет только руководитель лаборатории геномной медицины. Порядок доступа к данным РМДР и базе данных доноров ББМ, а также уровень доступа для различных пользователей определяется специальным положением, разработанным в соответствии с действующим законодательством Российской Федерации и актуальными международными протоколами.
Для приготовления цитогенетических суспензий кровь забирается в пробирку типа Vacuette с гепарином в объеме 7—9 мл. Для выделения нуклеиновых кислот кровь забирается в пробирку типа Vacuette с ЭДТА в объеме 7—9 мл. В лаборатории геномной медицины из пробирки с ЭДТА кровь разливается по трем соответственно пронумерованным пластиковым пробиркам на 1,5 мл типа Eppendorf. Одна пробирка предназначена для выделения ДНК, вторая — для выде-
ления РНК, оставшаяся пробирка с кровью и Vacuette помещаются на резервное хранение в банк крови при температуре —80°С.
Методика подготовки биологического материала для хранения. Выделение ДНК
Для выделения ДНК из крови с ЭДТА в качестве базисного используется стандартный метод фенол-хлороформной экстракции с некоторыми модификациями [13].
Из 0,7 мл цельной крови получается 30—100 мкг ДНК. Концентрация и «чистота» выделения ДНК оценивается на спектрофотометре «NanoDrop-2000» («Thermo Scientific», США) (рис. 1). В среднем концентрация ДНК в пробах составляет 550±103 нг/мкл с соотношением А260/А280 = 1,75—2,15 и А260/А230 = 1,60—2,31. Это достаточно «чистая» ДНК для использования в полимераз-ной цепной реакции (ПЦР) и секвенирова-нии. Целостность ДНК оценивается с помощью электрофореза в 2% агарозном геле на буфере ТВЕ (рис. 2) по наличию высокомолекулярных бэндов ДНК.
После выделения и определения качественных и количественных характеристик все образцы ДНК хранятся в ультранизкотемпературной установке «MDF-U4186S» («Sanyo», Япония) при температуре —80°С.
Выделение РНК
Для выделения РНК используется 0,7 мл свежей крови. На первом этапе из свежей крови изолируют лейкоциты с помощью 1xSSC (лизирует эритроциты) и центрифугирования. К осадку лейкоцитов добавляется 0,5 мл RNAlater® («Ambion», США), пробирки до выделения РНК помещаются на хранение при температуре —80С. Для получения РНК используются метод P. Chomczynski, N. Sacchi [7] и реактив «TRIZOL», осадок РНК после промывки 70% этиловым спиртом и подсушивания растворяют в Н20 miliQ с ингибитором РНК-аз RiboLock® («Fermentas», Литва). Качество РНК оценивается электрофоретически по наличию выраженных бэндов 28S и 18S ри-босомальной РНК (рис. 3). Концентрация и «чистота» РНК определяются на спектрофотометре «NanoDrop-2000» («Thermo
Scientific», США) (рис. 4), хранится РНК при температуре —80С.
Приготовление цитогенетических препаратов
Постановка лимфоцитарной культуры производится из цельной крови с гепарином непосредственно в день забора. После окончательной фиксации из одной части полученных цитогенетических суспензий готовятся цитогенетические препараты для рутинного анализа хромосомных аберраций, а вторая часть суспензии разливается по пластиковым пробиркам емкостью 1,5 мл и хранится в морозильной камере банка цитогенетических суспензий при температуре —20°С.
Все процедуры проводятся в стерильных условиях с использованием ламинарного шкафа. Среду (85% RPMI 1640 и 15% эмбриональной телячьей сыворотки) в объеме 8 мл вносят в бакпечатки и добавляют 2 мл цельной крови и 2—2,5% фитогемагглютини-на «Sigma» (США). Культуральные флаконы объемом 25 мл («TPP», США) помещаются в суховоздушный термостат при 37°С и культивируются 45 часов. Потом добавляется колхицин до конечной концентрации 0,06 мкг/мл, культивирование продолжается еще 3 часа. Фиксация культур проводится на 48-м часе культивирования по общепринятой методике: гипотонизация (в 0,56% растворе KCl, содержащем 0,95% цитрата натрия), фиксация (смесью этанола и ледяной уксусной кислоты в соотношении 3:1), раскапывание клеточной суспензии на охлажденные обезжиренные предметные стекла. Рутинная окраска хромосом проводится красителем Гимза. Для хромосомного анализа используется микроскоп «Leica DM2500» (Германия). У каждого индивида исследуется не менее 300 метафаз.
Характеристика ББМ «Здоровые работники СХК»
С момента создания в ББМ СБН Центра было собрано 3823 единицы хранения, полученные из биологического материала около 1400 доноров — здоровых работников СХК.
В таблице 1 представлено количество биологических образцов в ББМ «Здоровые работники СХК».
Рис. 1. Спектрограмма ДНК в образцах, выделенных фенольным методом из крови здоровых работников Сибирского химического комбината (480-800 нг/мкл, соотношения А260/А280 = 1,79-1,92 и А26(/А2}0 = 2,25-2,31)
Рис. 2. Электрофореграмма ДНК, выделенной фенольным методом из крови здоровых работников Сибирского химического комбината.
Примечание: первая линейка - маркёр молекулярной массы
В ББМ содержатся кровь, цитогенетические суспензии, образцы ДНК и РНК крови здоровых работников СХК: образцы цельной крови (почти 1400 резервных образцов крови, которые хранятся при температуре —80°С) и ДНК (более 1300 образцов).
Рис. 3. Электрофореграмма РНК, выделенной из лейкоцитов периферической крови с помощью реактива «ТЯШОЬ» (видны два бенда - 28Б и 18Брибосомальной РНК)
Имеются также цитогенетические суспензии в количестве около 1390 образцов и около 900 образцов РНК, выделенных из лейкоцитов крови.
На сегодняшний день в ББМ «Здоровые работники СХК», содержится биологиче-
Рис. 4. Концентрация РНК в образцах, выделенных из крови здоровых работников Сибирского химического комбината (450-710 нг/мкл, соотношения А260/А280 = 2,06-2,09 и А260/А230 = 1,76-2,13)
Таблица 1 Распределение биологических образцов в банке биологического материала «Здоровые работники СХК»
Биологический образец Количество здоровых работников СХК
Цельная кровь 1390
ДНК крови 1350
РНК крови 865
Цитогенетические суспензии 1568*
Итого образцов 3823
ский материал 1390 доноров (986 мужчин и 404 женщин). Средний возраст мужчин — доноров ББМ составляет 54,9±0,37 года, женщин — 59,2±0,56 года. Средняя продолжительность работы на СХК у мужчин составляет 27,44±0,40 года, у женщин — 25,1±0,56 года.
Ежегодно производится уточнение информации о случаях заболевания ЗНО или ОИМ среди работников СХК по базе данных РМДР. Эта процедура позволяет своевременно исключить из ББМ здоровых доноров, лиц, заболевших ЗНО и ОИМ, что имеет большое значение при анализе эффектов радиационного воздействия. В период 2002—2012 гг. у 40 доноров ББМ «Здоровые работники СХК» были выявлены ЗНО различных локализаций, у 11 человек развился ОИМ.
Здоровые работники СХК в зависимости от вида профессионального облучения распределены на четыре группы: 1-я группа (п=184) работников СХК не подвергалась радиационному воздействию ( используется как контрольная); 2-я группа (п=649) работников подвергалась воздействию только внешнего у-излучения; 3-я группа (п = 63) подвергалась воздействию только внутреннего облучения за счет инкорпорированного 239Ри; 4-я группа (п=494) подвергалась сочетанному (внешнему и внутреннему) облучению. Таким образом, во 2—4-ю группы входят 1206 работников СХК, подвергавшихся долговременному профессиональному облучению. Распределение доноров в соответствии с дозами внешнего облучения и содержанием 239Ри представлено в таблице 2.
Среднее значение дозы внешнего облучения составило 171,7±9,2 мЗв, диапазон доз — 0,1—1 551,0 мЗв, медиана — 78,5; ин-терквартильный размах — 12,0—249,1 мЗв. В соответствии с данными табл. 2 подавляю-
щее большинство доноров имеют дозы внешнего облучения до 200 мЗв.
Среднее содержание инкорпорирован -ного 239Ри у обследованных работников составило 53,3±5,5 нКи, уровень колебался в пределах 0,1—1 965,0 нКи, медиана — 18,0 нКи, интерквартильный размах — 11,0—60,0 нКи.
Таким образом, ББМ «Здоровые работники СХК» представляет собой уникальное, практически неисчерпаемое хранилище материала для проводимых исследований, направленных на выяснение молекулярных основ и изучение генетических аспектов ИРЧ.
Характеристика исследований, выполняемых с использованием ББМ «Здоровые работники СХК»
На основе созданного ББМ проводится широкий спектр генетических исследований, в частности исследования по оценке эффектов длительного профессионального облучения у работников СХК.
Оценка дозовой зависимости частоты хромосомных аберраций. Было показано, что у работников СХК, подвергавшихся только внешнему облучению, дозовая зависимость для количества аберрантных клеток, хромосомных и хроматидных аномалий имеет нелинейный характер. При облучении в дозе до 10 мЗв наблюдается достоверное уменьшение частоты аберрантных клеток, хроматидных и хромосомных аберраций по сравнению с контролем, что соответствует явлению радиационного гормези-са. Хроническое облучение при дозах менее 40 мЗв не оказывает значимого мутагенного действия на геном человека. Начиная с диапазона доз 41—100 мЗв отмечается статистически значимое увеличение выхода аберрантных метафаз и аберраций хроматидно-го и хромосомного типов. В диапазоне доз
Таблица 2 Распределение доноров банка биологического материала «Здоровые работники СХК» в зависимости от дозы внешнего облучения и содержания 239Ри
Диапазон мЗв
0 > 0—20 > 20—50 > 50—100 > 100—200 > 200—350 > 350—500 > 500
0 184 198 77 81 106 75 57 55
> 0—0,5 нКи 1 4 5 1 0 0 0 0
> 0,5—3,7 нКи 5 6 2 1 0 0 0 0
> 3,7—10 нКи 5 46 32 15 0 0 0 0
> 10—50 нКи 35 69 64 54 42 10 4 0
> 50 нКи 17 20 14 23 45 29 6 2
Примечания: в ячейках таблицы представлено число работников с соответствующими дозами внешнего облучения и содержанием 239Ри:
без облучения только внешнее только внутреннее сочетанное
100—400 мЗв на кривой дозовой зависимости имеется плато, уровень цитогенети-ческих аномалий не увеличивается и только возрастает статистическая значимость различий с контролем. При дозах более 400 мЗв устанавливается линейная зависимость от дозы облучения. При сравнении частот хромосомных аберраций в исследуемой группе с контролем отмечается значительное увеличение суммарной частоты аберрантных клеток ( более чем в 1,5 раза) с р=0,00001. Длительное внешнее облучение индуцирует различные виды разрывов хромосом: увеличены частоты одиночных, парных и точечных фрагментов. Наблюдается значительное (более чем в 2,5 раза) повышение частоты дицентриков (р=0,006), но по кольцевым хромосомам различия статистически незначимы [11; 12].
Оценка вклада внутреннего облучения в индукцию хромосомных аберраций в группе с сочетанным облучением. Для этого исследования были подобраны группы, в которых суммарная доза хронического внешнего облучения в группах с внешним и сочетанным облучением не различалась (189,6±14,2 и 171,5±20,4 мЗв соответственно, р=0,452). Тем не менее при сочетанном облучении по сравнению с внешним облучением наблюдается снижение суммарного числа аберрантных мета-фаз, одиночных и парных точечных фрагментов и хроматидных обменов, т.е. дополнительная радиационная нагрузка за счет внутреннего облучения от инкорпорированного 239Ри каким-то образом защищала хромосомный аппарат лимфоцитов от повреж-
дающего действия хронического внешнего облучения. На наш взгляд, этот феномен подобен адаптивному ответу, но нельзя забывать, что речь идет о разных видах излучений, и «адаптивный» фактор (внутреннее облучение) действует одновременно с «повреждающим» фактором (внешним облучением). У работников СХК, больных ЗНО, частота цитогенетических маркеров радиационного поражения выше, чем у здоровых работников, что, вероятно, свидетельствует о повышенной ИРЧ лиц, заболевших ЗНО. Показано, что из всех типов хромосомных аберраций только частота дицентрических хромосом является высокозначимым маркером риска развития ЗНО на фоне низкоинтенсивного облучения [1—4; 6; 12].
Взаимосвязь частоты хромосомных аберраций и активности процессов апоптоза. В условиях долговременного радиационного воздействия у-излучения у работников СХК в диапазоне доз 1—500 мЗв зависимость активности каспазы-3 (биохимического маркера апоптоза) лимфоцитов крови здоровых людей от дозы имеет нелинейный характер с максимумом в области 10—96 мЗв и снижением активности при облучении в дозе более 96 мЗв. Это свидетельствует об угнетающем действии хронического облучения на процесс апоптоза. Снижение активности процесса апоптоза при дозе облучения более 96 мЗв сочетается с повышением уровня аберрантных клеток, начиная с этой дозы облучения. Снижение активности процесса апоп-тоза под действием хронического облучения является одним из ключевых механизмов
накопления цитогенетических аномалий в лимфоцитах крови у работников СХК при дозах более 96 мЗв [6; 10].
Идентификация полиморфизмов, ассоциированных с хромосомными аберрациями, возникающими под действием хронического облучения. Впервые в мире были проведены биочиповые исследования ( на чипе «Cancer_SNP_Panel GT-17-211» («illumina»), содержащем 1 421 SNP-маркер 408 генов) взаимосвязи SNP с частотой и спектром хромосомных аберраций у 96 работников СХК (мужчин славянской национальности в возрасте 45—65 лет и с суммарной дозой внешнего облучения 100—300 мЗв). Установлены 23 SNP (rs2725349, rs2392221, rs1041163, rs2114443, rs6083, rs7462102, rs1760904, rs1051690, rs4986894, rs488133, rs5742694, rs2373721, rs5742667, rs1269486, rs1149901, rs2873950, rs1574154, rs10934500, rs4688046, rs889162, rs230532, rs312016, rs4807542), ассоциированных с частотой различных типов хромосомных аберраций; из них 11 SNP связаны более чем с одним типом хромосомных аберраций А. Во всех случаях носительство «редкого» (мутантно-го) генотипа по любому из 23 SNP сопряжено с высокой частотой различных типов хромосомных аберраций по сравнению с носи-тельством гетерозиготного или «дикого» генотипа по данным SNP. Полиморфный локус rs1051690 3'UTR в miR-618 связывающем регионе гена инсулинового рецептора ассоциирован с 4 типами хромосомных аберраций: частотой хроматидных фрагментов, ди-центрических хромосом, кольцевых хромосом и транслокаций [12].
Заключение
В настоящее время в СБН Центре создан один из крупнейших в мире ББМ лиц, подвергавшихся длительному профессиональному облучению в диапазоне «малых» доз, на базе которого проводятся исследования по следующим направлениям:
• выяснение генетических эффектов радиационного воздействия низкой интенсивности;
• изучение маркеров и механизмов ИРЧ к радиационному воздействию.
Дальнейшее расширение ББМ и внедрение новых технологий сохранения и анализа биологического материала позволит расходовать меньшее количество образцов и тем самым продлит сохранение уникального материала.
Объединение имеющегося исследовательского ресурса с другими подобными хранилищами биологического материала, донорами которых являются лица, подвергавшиеся радиационному воздействию, даст возможность получить объективные выводы относительно ИРЧ и выяснить отдаленные эффекты долговременного воздействия техногенного облучения в различных диапазонах доз.
Литература
1. Литвяков Н.В., Гончарик О.О., Межерицкий С.А. и др. Генетические аспекты развития злокачественных новообразований в условиях долговременного радиационного воздействия / Под общ. ред. Р.М. Тахауова. Томск: Изд-во Том. ун-та, 2010.
2. Фрейдин М.Б., Васильева Е.О., Скобельская Е.В. и др. Частота и спектр хромосомных аберраций у работников Сибирского химического комбината // Бюллетень сибирской медицины. 2005. № 2. С. 75-81.
3. Фрейдин М.Б., Гончарова И.А., Васильева Е.О. и др. Оценка связи полиморфизма генов IL1B, NOS3, GSST1 и GSTM1 с уровнем хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови работников Сибирского химического комбината // Вопросы радиационной безопасности. 2007. № 4. С. 31-37.
4. Фрейдин М.Б., Иванина П.В., Тахауов Р.М. и др. Оценка связи полиморфизма генов эксцизионной репарации с риском развития злокачественных новообразований у работников Сибирского химического комбината // Радиационная биология. Радиоэкология. 2008. Т. 48. № 4. С. 439-444.
5. Akyama M., Kyozumi S. Kusunoki Y. et al. Monitoring exposure to atomic bomb radiation by somatic mytation // Environmental Health Perspectives. 1996. Vol. 104. P. 493-496.
6. Belyavskaya V.A., Takhauov R.M., Freidin M.B. et al. Effect of p53 polymorphism on cancer risk in workers exposed to occupational radiation // Siberian Oncology Journal. 2008. № 1 (25). P. 45-50.
7. Chomczynski P., Sacchi N. The single -step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on // Nature Protocols. 2006. № 1. P. 581-585.
8. Gemeinholzer B., Dröge G., Zetzsche H. et al. The DNA Bank Network: The Start from a German Initiative // Biopreservation and Biobanking. 2011. Vol. 9. № 1. P. 51-55.
9. Kodama Y., Mashima J., Kaminuma E. et al. The DNA Data Bank of Japan launches a new resource, the DDBJ Omics Archive of functional genomics experiments // Nucleic Acids Research. 2012. Vol. 40. P. 38-42.
10. Litviakov N.V., Denisov E.V., Takhauov R.M. et al. Association between TP53 gene ARG72PRO polymorphism and chromosome aberrations in human cancers // Molecular Carcinogenesis. 2010. Vol. 49. P. 521-524.
11. Litviakov N.V., Freidin M.B., Takhauov R.M. et al. The association gene polymorphisms with risk of cancer in long-term "low-dose" y-irradiation exposure // Ecological Genetics. 2009. Vol. 7. № 4. P. 23-33.
12. Litviakov N.V., Goncharik O.O., Mezheritsky S.A. et al. Gene polymorphisms and the frequency of chromosomal aberrations in employees of nuclear industry enterprises, with low-dose exposure
(microarray for using) // European Journal of Human Genetics: abstracts of European Human Genetics Conference, June 23— 26, Nbrnberg, Germany. 2012. Vol. 20. Suppl. 1. P. 376.
13. Malcolm B.J. Jr., Jeanne E. Paulus-Thomas Purification of human genomic DNA from whole blood using sodium perchlorate in place of phenol // Analytical Biochemistry. 1989. Vol. 180. № 2. P. 276-278.
14. Sak J., Pawlikowski J., Goniewicz M., Witt M. Population biobanking in selected European countries and proposed model for a Polish national DNA bank // Journal of Applied Genetics. 2012. Vol. 53. № 2. P. 159-165.
15. Shinkarkina A. P., Abrosimov A.Yu., Lushnikov E.F. et al. The international project "Chernobyl Tissue Bank": the results and the prospects of thyroid radiation-induced pathology study // Medical Radiology and Radiation Safety. 2011. Vol. 56. № 6. P. 30-41.
Контакты:
Карпов Андрей Борисович
заместитель директора по научной работе Северского биофизического научного центра, заслуженный врач Российской Федерации, доктор медицинских наук, профессор. Тел./факс: 8(382-3) 99-40-01, 99-40-02, 99-40-03 e-mail: [email protected]; [email protected]
