CC BY
7
УДК 577.15.08+606.61
Матиев О.В, Ванюшенкова А.А. Белов А.А.
БАКТЕРИЦИДНАЯ АКТИВНОСТЬ ПРОДУКТОВ ФЕРМЕНТОЛИЗА ХИТОЗАНА И АЛЬГИНАТА НАТРИЯ ПАПАИНОМ
Матиев Олег Витальевич, бакалавр 3-го года обучения факультета биотехнологии и промышленной экологии; Ванюшенкова Анна Алексеевна, магистр 2-го года обучения факультета биотехнологии и промышленной экологии;
Белов Алексей Алексеевич, д.т.н., профессор кафедры биотехнологии, ABelov2004@ yandex.ru Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия 125480, Москва, ул. Героев Панфиловцев, д. 20
Изучен бактерицидный эффект на культуру St. aureus продуктов взаимодействия папаина с такими биополимерами как хитозан и альгинат натрия. Было установлено, что образовавшиеся в процессе деполимеризации хитозана олигохиты обладают бактерицидным эффектом, в то время как альгинат натрия и продукты его взаимодействия с папаином не оказывают подобного эффекта. Ключевые слова: хитозан, альгинат натрия, папаин, материалы для ранозаживления.
BACTERICIDAL ACTIVITY OF CHITOSAN AND SODIUM ALGINATE FERMENTOLYSIS PRODUCTS BY PAPAIN
Matiev O.V., Vaniushenkova A.A., ., Belov A.A.*
D.I. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia. *e-mail: ABelov2004@ yandex.ru
The bactericidal effect on the culture of St. aureus of papain interaction products with such biopolymers as chitosan and sodium alginate has been studied. It was found that oligochaetes formed during the depolymerization of chitosan have a bactericidal effect, while sodium alginate and the products of its interaction with papain do not have a similar effect. Keywords: chitosan, sodium alginate, papain, materials for wound healing
Введение
Протеолитические ферменты находят широкое применение в медицинской практике для терапевтического лечения различных заболеваний [1,2]. Производятся препараты содержащие в качестве терапевтического агента (ТА) как индивидуальный фермент, так и их смеси [3]. Применение протеолитических ферментов в перевязочных препаратах для комплексного лечения гнойно-некротических ран, в качестве агента способствующего удалению некротизированной ткани, является альтернативной хирургическому вмешательству [1,2]. Папаин (Пап) широко применяется как в медицинской практике, так и в косметологии за счет широкой субстратной специфичности, дешевизны и доступности. Пап используется для лечения ран различной этиологии, так как будучи в составе лекарственного препарата, он способствует очищению раневой поверхности и ускоряет прогрессию ранозаживления [4,5]. Пап способен разрушать белковые токсины возбудителей инфекционных заболеваний [2].
Полисахариды применяются в качестве носителей лекарственных средств (ЛС) [1]. Высокий интерес для создания систем по доставке ЛС представляют такие полисахариды как хитозан (Хт) и альгинат натрия (Алг) благодаря доступности, биосовместимости, биодеградации и высокой биологической активности.
Биополимер Хт и продукты его гидролитического расщепления обладают высокой биологической активностью и способностью к модификациям
благодаря свободным гидроксо- и амино- группам, что находит применение в медицине [6]. На основе Хт производятся перевязочные средства, где данный биополимер выступает как в роли спейсора для доставки ТА, так и вспомогательного терапевтического средства [1].
Алг проявляет рН-зависимую анионную природу и обладает способностью взаимодействовать с катионными полиэлектролитами, что имеет приложение в создании систем по доставке ЛС [7]. При местной аппликации Алг проявляет кровоостанавливающее, противовоспалительное и ранозаживляющее действие [8].
При создании перевязочного ранозаживляющего препарата, особое внимание уделяется его бактерицидной активности на патогенные микроорганизмы, осложняющие ранозаживление. Способность к бактерицидной активности, как самого биополимера, так и образовавшихся производных вследствие его модификации ТА или деструкции, позволит уменьшить введение дополнительных количеств бактерицидных компонентов в лекарственный препарат, что упростит его создание.
Экспериментальная часть
Ферментативные активности определяли аналогично [1] используя в качестве субстрата либо, казеин, либо азоколл, либо ВАр№ в 1/15М фосфатном буферном растворе (ФБ) рН-8,0. Иммобилизацию в хитозан проводили аналогично [1] смешивая растворы Хт заданной концентрации и ТА.
Иммобилизацию в альгинат натрия проводили смешением 2% раствора альгината натрия и ТА. Было установлено, что Алг уменьшает ферментативную активность Пап, полученные данные представлены на рис.1 Уменьшение ферментативной активности может быть связано с образованием интерполиэлектролитного комплекса. В то время как Хт обладает активирующем эффектом на папаин [9]. Разница во взаимодействиях связана, на наш взгляд, с разницей в зарядах исследуемых полисахаридов - Алг заряжен отрицательно, а Хт положительно. Методом вискозиметрии было исследовано изменение вязкости водных растворов (25°С) Алг при взаимодействии с папаином и комплексом
папаин-цистеин. Полученные данные представлены на рис.2. Наблюдается незначительное изменение вязкости во времени, папаин не оказывает значительного влияния на скорость
деполимеризации Алг. Разрушение образовавшегося интерполиэлектролитного комплекса не происходит. Тогда как при взаимодействии Пап с Хт происходит быстрая деполимеризация Хт с образованием олигохитов [6]. Во внешней оболочки Пап находятся положительно заряженные аминокислоты - так изоэлектрическая точка (р1) папаина составляет 8,75 [10], и это в основном остатки е-ЫНг лизина вследствие чего не возможно образование полиэлектролитного комплекса с Хт.
Рис 1. Изменение ферментативной активности (А/Ао) папаина (0,5 мг/мл) при взаимодействии - Алг и папаина в различных соотношениях Алг:папаин, субстрат казеин
Рис. 2. Изменение вязкости (у/по) во времени альгината натрия в присутствии папаина (Алг-Пап); альгината в присутствии папаина и цистеина (Алг-Пап-Цис).
Для проверки биоцидного действия был использован микропланшетный метод. В каждую лунку микропланшета вносилось 100 мкл исследуемого раствора, 80 мкл питательной среды и 20 мкл суточной культуры клеток микроорганизмов. Планшет помещался в термостат (37°С) при постоянном перемешивании. Через каждый час проводили измерения оптической плотности при длине волны 505 нм на фотометре для микропланшетов iMark фирмы Bio-Rad Lab. Inc., USA в течении 24 часов. Для контроля количества микроорганизмов проводился высев на чашки микрометодом Коха.
Бактерицидной активности продуктов ферментолиза хитозана, по отношению к культуре St.aureus, полученные микропланшетным методом,
представлены на рис.3. Полученные данные можно объяснить тем, что в случае грамположительных бактерий положительно заряженные олигохиты взаимодействует с отрицательно заряженными протеогликанами на клеточной стенке, что приводит к ее изменению, а затем к гибели бактерий, вызванной осмотическим шоком [11].
Кривые роста культуры St.aureus при добавлении продуктов взаимодействия Алг и Пап представлены на рис.4.
Рис.3. Кривые роста и ингибирования культуры St.Aureus при взаимодействии с исследуемыми веществаи.
Рис 4. Кривые роста культуры 81Лигеш' при взаимодействии с исследуемыми веществами.
По полученным данным можно сказать, что как сам Пап и Алг, так и продукты их взаимодействия не обладают выраженной антимикробной активностью к данной культуре. Заключение
В процессе взаимодействия папаина и хитозана происходит образование олигохитов обладающих бактерицидной активностью к культуре St.aureus, в то время как папаин, альгинат натрия и продукты его взаимодействия с папаином не проявляют подобного эффекта.
Список литературы
[1] Белов А.А. Разработка промышленных технологий получения новых медицинских материалов на основе модифицированных волокнообразующих полимеров, содержащих биологически активные белковые вещества // Дисс. на соис. уч. степ. докт. техн. наук М., РХТУ, 2009. 385 с.
[2] Полиферментные препараты в гнойной хирургии: Методические рекомендации. / Под ред. член-корр. РАМН Н.А.Ефименко.- М., 2005.- 32 с.
[3] Машковский М.Д. Лекарственные средства. М.: Новая волна. 15-е изд. 2006. - 1206 с
[4] Leite AP, Oliveira BGRB, Soares MF, Barrocas DLR. Uso e efetividade dapapaína no processo de
cicatriza£äo de feridas: uma revisäo sistemática. //RevGaúcha Enferm. 2012;33(3):198-207.
[5] 'S.A.S.H. Ajlia, 'F.A.A. Majid Efficacy of Papain-based Wound Cleanser in Promoting Wound Regeneration //Pakistan Journal of Biological Sciences 13 (12): 596-603, 2010 ISSN 1028-8880, DOI: 10.3923/pjbs.2010.596.603
[6] Muanprasat, C. & Chatsudthipong, V., Chitosan oligosaccharide:Biological activities and potential therapeutic applications //Pharmacology and Therapeutics (2016), doi: 10.1016/j.pharmthera. 2016.10.013
[7] Jinchen Sun and Huaping Tan Alginate-Based Biomaterials for Regenerative Medicine Applications //School of Materials Science and Engineering, Nanjing University of Science and Technology, Nanjing 210094, China.Materials 2013, 6, 1285-1309; doi:10.3390/ma6041285
[8] Регистр лекарственных средств России
[9] Матиев О.В., Белов А.А. Иммобилизация папаина на хитозан. // Успехи в химии и химической технологии (Москва). 2021, том 35, № 12, с. 117-119.
[10] Мосолов В.В. Протеолитические ферменты. М.: Наука. 1971. 414с.
[11] Muanprasat, C. & Chatsudthipong, V.. Chitosan oligosaccharide:Biological activities and potential therapeutic applications //Pharmacology and Therapeutics (2016), doi: 10.1016/j.pharmthera. 2016.10.013
