CC BY
56
DOI: 10.24411/2074-5036-2019-10019 УДК 579.672
Ключевые слова: Bacillus coagulans, идентификация, схема R. Gordon, устойчивость культур, плоско-кислая порча. Key words: Bacillus coagulans, identification, scheme R. Gordon, crop resistance, flat acid damage.
Мартынова К.В.
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ БАКТЕРИЙ BACILLUS COAGULANS, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ТОМАТОВ И ТОМАТОСОДЕРЖАЩИХ
ПРОДУКТОВ ПИТАНИЯ
BACTERIOLOGICAL IDENTIFICATION BACTERIA OF BACILLUS COAGULANS, ISOLATED FROM TOMATOES AND TOMATO-CONTAINING FOODS
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Ульяновский государственный аграрный университет имени П.А. Столыпина» Адрес: 432017, Россия, Ульяновская область, город Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1 Federal state budgetary educational institution of higher education «Ulyanovsk state agrarian university
named P.A. Stolypin» Adress: 432017, Russia, Ulyanovsk region, Ulyanovsk city, Boulevard New Venets, 1
Мартынова Ксения Вячеславовна, аспирант кафедры Микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы ФГБОУ ВО Ульяновский ГАУ. E-mail: belova_kcenya@mail.ru. Тел. 8-904-195-25-31
Martynova Ksenia Vyacheslavna, graduate student of the department «Microbiology, virology, epizootology and veterinary-sanitary examination» FGBOU VO Ulyanovsk GAU. E-mail: belova_kcenya@mail.ru. Tel. 8-904-195-25-31
Аннотация. Работа посвящена идентификации бактерий Bacillus coagulans, выделенных из томатов и томатосо-держащих продуктов питания по схеме бактериологической идентификации бактерий рода Bacillus, разработанной R. Gordon. Представлены результаты исследований по изучению воздействия физических (температурной устойчивости) и химических факторов (устойчивости к трихлорметану) референс-штаммов Bacillus coagulans и выделенных нами полевых штаммов бактерий. Полученные данные свидетельствуют, что выделенные культуры обладают сходными биологическими свойствами с коллекционными штаммами Bacillus coagulans. Процесс аутентификации организмов представляет собой трудоемкий этап проведения биологических исследований, но несмотря на это является одним из самых важных методов бактериологической идентификации бактерий Bacillus coagulans, которые являются причиной возникновения плоско-кислой порчи томатосодержащих продуктов питания. Summary. The work is devoted to the identification of bacteria Bacillus coagulans, isolated from tomatoes and tomato-containing foods according to the scheme of bacteriological identification of bacteria of the genus Bacillus, developed by R. Gordon. The results of studies on the effects ofphysical (temperature resistance) and chemical factors (resistance to trichloromethane) of reference strains of Bacillus coagulans and selected field strains of bacteria are presented. The data obtained indicate that the isolated cultures have similar biological properties with collection strains of Bacillus coagulans. The process of authentication of organisms is a time-consuming stage of biological research, but despite this is one of the most important methods for bacteriological identification of bacteria Bacillus coagulans, which are the cause of the flat-acid damage of tomato-containing food.
Введение
Одной из популярных и распространенных овощных культур являются томаты, которые характеризуются высокой питательной ценностью и входят в рецептуру многих консервов. Но томаты, как и любой другой продукт, могут быть подвержены воздействию различных бактерий, которые в свою очередь являются причиной их порчи. Наиболее часто фиксируется у консервируемых томатов и томатосодержа-щих продуктов питания плоско-кислая порча,
возбудителем которой являются бактерии вида Bacillus coagulans, которая характеризуется отсутствием внешних признаков порчи со стороны тары до ее вскрытия, но при этом консервы могут содержать токсины. Токсины в свою очередь оказывают негативное воздействие на организм человека, также испорченный продукт не может быть использован для дачи на корм животным и подлежит уничтожению [1, 3, 6].
Для бактериологической идентификации бактерий рода Bacillus используется схема
9
дифференциации бацилл на три морфологические группы по R. Gordon. В последнее время очень распространены методы моле-кулярно-генетических исследований идентификации бацилл. Однако, такие методы требуют временных затрат и неприемлемы для быстрой идентификации в виду отсутствия праймеров для большинства представителей рода Bacillus. Процесс аутентификации организмов представляет собой трудоемкий этап проведения биологических исследований, но несмотря на это является одним из самых важных методов бактериологической идентификации бактерий [4, 5, 8, 9].
Цель исследований - провести бактериологическую идентификацию бактерий Bacillus coagulans, выделенных из томатов и томатосодержащих продуктов питания.
Задачи:
- изучить биохимические свойства рефе-ренс-штаммов B. coagulans и выделенных культур, используя схему бактериологической идентификации бактерий рода Bacillus, разработанной R. Gordon;
- изучить воздействие физических (температурной устойчивости) и химических факторов (устойчивости к трихлорметану) референс-штаммов Bacillus coagulans и выделенных бактерий.
Материалы и методы
Штаммы B. coagulans 566, B. coagulans 10468, B. coagulans 10473, B. coagulans 732, B. coagulans 948 получены из музея НИИЦМБ ФГБОУ ВО Ульяновский ГАУ. Объекты исследований - 25 наименований пищевого сырья и продуктов питания (свежие томаты, томаты в собственном соку, томатная паста, кетчуп, растительные консервы с добавлением томатной пасты и др.).
10
Для идентификации бактерий использовали схему Gordon (1973) [5, 8]. В исследованиях применяли питательный бульон для культивирования микроорганизмов сухой ((ГРМ-бульон) г. Оболенск Московская область Серпуховской район), трихлорметан стабилизированный 0,6-1% этанола (хлороформ) ч.д.а. ТУ 2631-066-44493179-01. Бактериальные культуры хранились в виде столбика мягкого 0,7% мясо-пептонного агара, засеянного уколом при температуре 2-40С.
Результаты исследований и их обсуждение
Первый этап исследований заключался в подготовке проб для выделения культур, для этого готовили разведения 1:10 и культивировали в условиях термостата 24 ч при температуре 370С. Выделение «чистой культуры» проводили методом Дригальского на среде Донована, при наличии однотипных колоний анализировали не менее трех колоний. Изучали мазки выросших культур, из которых грам-положительные споровые бактерии затем подлежали дальнейшему исследованию.
Для изучения биохимических свойств рефе-ренс-штаммов B. coagulans 566, B. coagulans 10468, B. coagulans 10473, B. coagulans 732, B. coagulans 948 и выделенных нами культур использовали схему Gordon [8]. Оценка результатов посевов проводилась через 24-48 часов инкубирования в условиях термостата (36±10C).
В результате проведенных исследований из 25 проб пищевого сырья и продуктов питания было выделено 5 культур (таб. 1), которые характеризовались следующими свойствами: подвижные грамположительные бактерии палочкообразной формы, спорообразующие. Рост на мясо-пептонном агаре (МПА) представлен в виде слизистых матовых колоний
Таблица 1
Характеристика объектов исследований
№ Номер пробы Наименование объекта выделения
1 8 Томатная паста «Каждый день»
2 9 Кетчуп «Спело Зрело»
3 12 Томат с признаками порчи
4 23 Томат с признаками порчи
5 25 Сок с мякотью. Мультиовощной со свеклой «Сады Придонья»
серо-белого цвета с морщинистой поверхностью и волнистым краем, рост на мясо-пеп-тонном бульоне (МПБ) проявляется в виде слабого помутнения среды и образованием на ее поверхности светлой пленки.
Был изучен оптимальный рост бактерий, который наблюдали при 35-500С и рН в пределах от 5,5 до 6,2. Все выделенные штаммы продуцировали каталазу (рис. 1), вызывали гидролиз крахмала (рис. 2), не продуцировали летициназу, не разжижали желатин, отсутствовал гидролиз мочевины и рост при 7% NaCl.
В качестве дополнительных тестов для дифференциации выделенных штаммов Bacillus coagulans применяли биохимические тесты, предложенные Сидоровым [5, 7]. В ходе проведенных исследований наблюдали следующие результаты: положительная реакция на сахарозу, дульцит, мальтозу, глюкозу, ксилозу; отрицательная реакция на маннит, инозит, сорбит; не ферментируют лактозу; утилизация цитрата не происходит.
Результаты вышеназванных исследований представлены в таблице 2.
Таблица 2
Результаты изучения биохимических свойств референс-штаммов B. coagulans
и выделенных культур
Название тестов Номера штаммов
566 10468 10473 732 948 8 9 12 23 25
Подвижность микроорганизмов + + + + + + +
Продукция каталазы + + + + + + +
Схема Гордона Продукция летициназы - - - - - - -
Гидролиз крахмала + + + + + + +
Разжижение желатина - - - - - - -
Гидролиз мочевины - - - - - - -
Рост при 7% ШС1 - - - - - - -
Кислоты:
сахарозы + + + + + + +
дульцита + + + + + + +
Дополнительные маннита - - - - - - -
мальтозы + + + + + + +
биохими- глюкозы + + + + + + +
ческие инозита - - - - - - -
тесты сорбита - - - - - - -
ксилозы + + + + + + +
лактозы - - - - - - -
Утилизация цитрата - - - - - - -
Рис. 1. Результаты изучения способности выделенных культур продуцировать каталазу (слева - положительная реакция, справа - отрицательная)
На основании проведенных тестов схемы Gordon [8] и биохимических тестов [5] мы утверждаем, что музейные штаммы бакте-
рий Bacillus coagulans 566, Bacillus coagulans 10468, Bacillus coagulans 10473, Bacillus coagulans 732, Bacillus coagulans 948 и выделенные нами 5 культур бацилл обладают аналогичными биохимическими свойствами.
Дальнейшая работа была посвящена изучению воздействия физических (температурной устойчивости) и химических факторов (устойчивости к трихлорметану) выделенных бактерий и референс-штаммов Bacillus coagulans [2].
Устойчивость выделенных бактерий и культур B. coagulans 566, B. coagulans 10468, B. coagulans 10473, B. coagulans 732, B. coagulans 948 к высоким температурам изучали с помощью прогревания на водяной бане в диапазоне 60-900С в течение 30 минут. Далее производили посев прогретых культур на МПА и культивировали в условиях термостата в течение 24 часов при температуре 35±20С, наличие выросших колоний (рис. 3) свидетельствует об устойчивости культур к воздействию температуры. Результаты исследований представлены в таблице 3. Нами установлено, что выделенные бактерии и референс-штаммы B. coagulans выдерживают воздействие высоких температур до 900С.
Следующий этап исследований заключался в изучении устойчивости выделенных бактерий и референс-штаммов B. coagulans к воздействию трихлорметана. Для этого применяли соотношение бактериальной культуры и хлороформа 10:1, время воздействия 5-30 минут с 5-минутным интервалом при постоянном встряхивании пробирок и отстаивании в течение 1/5 временного интервала воздействия. Затем надосадочную жидкость высевали на МПА, культивировали в условиях термостата в течение 18 часов (35±20С). Наличие роста культур в виде колоний свидетельствует об устойчивости бактериальных культур к воздействию трихлорметана (табл. 3). В проведенных экспериментах определено, что выделенные бактерии и музейные штаммы B. coagulans выдерживают воздействие хлороформа при временной экспозиции 5-15 минут.
Заключение
На основании проведенных тестов схемы Gordon [8] и дополнительных биохимиче-
Рис. 2. Положительный результат изучения способности культур В. еоа^1ат 566 и В. еоа^1ат 10468 гидролизировать крахмал
Рис. 3. Устойчивость выделенной культуры № 8 к воздействию высоких температур (в диапазоне 60-900С в течение 30 мин.)
ских тестов [5] мы утверждаем, что выделенные нами из томатов и томато содержащих продуктов питания 5 штаммов бактерий обладают аналогичными биохимическими свойствами с музейными штаммами бактерий Bacillus coagulans 566, Bacillus coagulans 10468, Bacillus coagulans 10473, Bacillus coagulans 732, Bacillus coagulans 948. В результате проведенных исследований нами было установлено, что выделенные бактерии и референс-штаммы B. coagulans устойчивы к воздействию высоких температур в диапазоне 60-900С (время эксперимента 30 минут) и к обработке трихлорметаном в соотноше-
12
Таблица 3
Устойчивость выделенных бактерий и референс-штаммов B. coagulans к воздействию высоких температур и к воздействию трихлорметана
Воздействие физических и химических факторов Название культур
566 10468 10473 732 948 8 9 12 23 25
Временной интервал воздействия высоких температур на культуру, минут 60 + + + + + + + + + +
63 + + + + + + + + + +
66 + + + + + + + + + +
69 + + + + + + + + + +
72 + + + + + + + + + +
75 + + + + + + + + + +
78 + + + + + + + + + +
81 + + + + + + + + + +
84 + + + + + + + + + +
87 + + + + + + + + + +
90 + + + + + + + + + +
Временной интервал воздействия трихлор-метана на культуру, минут 5 + + + + + + + + + +
10 + + + + + + + + + +
15 + + + + + + + + + +
20 - - - - - - - - - -
25 - - - - - - - - - -
30 - - - - - - - - - -
нии к культуре 1:10 (время экспозиции 5-15 минут).
Физиолого-биохимическая идентификация бактерий рода Bacillus - это материало-емкое и трудоемкое исследование, на которое уходит примерно 155 часов (6 суток), однако в отличие от молекулярно-генетических исследований идентификации бацилл, которые требуют временных затрат и не приемлемы для быстрой идентификации в виду отсутствия праймеров для большинства представителей рода Bacillus, этот способ является наиболее оптимальным в бактериологической идентификации бактерий Bacillus coagulans.
Список литературы
1. Белова, К.В. Выделение бактерий рода Bacillus из объектов санитарного надзора / К.В. Белова, Н.А. Феоктистова // Актуальные проблемы инфекционной патологии и биотехнологии. Материалы VII-й Международной студенческой научной конференции. -том 1. - Ульяновск, 2015.
2. Васильев, Д.А. Бактериофаги рода Bacillus: монография / Д.А. Васильев, Н.А. Феоктистова, С.Н. Золотухин, А.В. Алешкин - Ульяновск, УГСХА им. П. А. Столыпина, НИИЦМиБ, 2013. - с. 66-67.
3. Вербина, Н.М. Микробиология пищевых производств / Н.М. Вербина, Ю.В. Каптерева. - М.: Агропромиздат, 1988. - с. 256.
4. Лабинская, А.С. Общая и санитарная микробиология с техникой микробиологического исследования / А.С. Лабинская, Л.П. Ещина. - М.: Медицина, 2004.- с. 34-37.
5. Сидоров, М.А. Определитель зоопатогенных микроорганизмов: справочник / М.А. Сидоров. - М. Колос, 1995. - с. 104-112.
6. Смирнов, В.В. Методические рекомендации по выделению и идентификации бактерий рода Bacillus из организма человека и животных / В.В. Смирнов, С.Р. Резник, И.Б. Сорокулова. - Киев: Наукова думка, 1983. - с. 51.
7. Феоктистова, Н.А. Распространение Bacillus cereus и Bacillus mycoides в объектах санитарного надзора / Н.А. Феоктистова, Д.А. Васильев,
C.Н. Золотухин [и др.] // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. -2014. - № 1 (25). - с. 68-76.
8. Gordon, R. The genus Bacillus / R. Gordon // In Handb. Microbiol. Cleveland (Ohio), 1973. - V.1. -P. 71-88.
9. Keller, D. Bacillus coagulans as a probiotic [Text] /
D. Keller, S. Farmer, A. McCartney, G. Gibson // Food Science and Technology Bulletin: Functional Foods, 2010. - Vol. 7, N 7. - P. 103-109.
13
