CC BY
287
УДК 664
Е. В. Никитина
БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ИСТОЧНИКИ АМИЛОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ: ХАРАКТЕРИСТИКА И НЕТРАДИЦИОННОЕ ПРИМЕНЕНИЕ
Ключевые слова: бактериальные амилолитичексие ферменты, классификация, характеристика, нетрацицонное применение.
В статье освещено современное состояние классификации амилолитических ферментов, описан основной механизм действия на полисахариды. Особое внимание посвящено бактериальным амилазам, которые находят применение в промышленности. Описаны направления использования амилолитичеких ферментов для модификации пищевых источников, обладающих низкими вкусовыми качествами, но высокими питательными.
Keywords: amylolytic enzymes, classification, characteristic, unconventional application.
The current state of classification of amylolytic enzymes is shown in article, the main mechanism of action on polysaccharides is described. The special attention is devoted to bacterial amylases which find application in industry. The directions of amylolytic enzymes use for modification of the food sources with low tastes, but the high nutritious are described.
Амилаза может быть получена из некоторых грибов, дрожжей, бактерий и актиномицетов; однако, ферменты, полученные из грибковых и бактериальных источников доминируют по применению в промышленных секторах. Применение амилазы в промышленных реакциях зависит от ее уникальных особенностей, таких как ее особенность действия, главные и побочные продукты реакции, оптимальная температура и оптимальный pH. Бактериальный а - амилаза, предпочтенна для применения в обработке крахмала и текстильных отраслях промышленности из-за ее действия при более высокой температуре (75-105 оС) и нейтральный к щелочному pH [1].
Среди бактерильных штаммов-продуцентов амилолитических ферментов особое место занимают следующие виды Bacillus subtilis, Bacillus staerothermophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, Bacillus acidocaldarius, Bifidobacterium bifidum и Bifidobacterium acerans.
Крахмал - это главное запасное вещество многих экономически значимых растительных культур: картофеля, кукурузы, риса, тапиоки, пшеницы и др. Крахмасодержащие продукты питания являются важной оставляющей диеты большей части населения Земли. В Европейском союзе ежегодно производится порядка 3,6 миллионов тон кукурузного крахмала, 2 миллиона тонн пшеничного крахмала, и 1,8 миллионов тонн картофельного крахмала [2]. Большая часть промышленных производств по переработки растительного сырья с целью получения крахмала и продуктов его переработки возникла в предыдущее столетие.
В последние десятилетия наблюдается смещение от кислотного гидролиза крахмала к ферментному получению из него мальтодекстринов, модифицированных крахмалов, глюкозо-фруктозных сиропов. Используемые с этой целью ферменты занимают около 30 % всего мирового производства ферментативных препаратов. Помимо прямого использования в гидролизе крахмала этих ферментов, крахмал-разрушающие энзимы используются как детергенты в стиральных и
моющих средствах, а также как античерствеющий и антислёживающий агент в хлебопечении. Ряд этих ферментов принадлежат к одному семейству - а-амилазному семейству или семейству 13 гликозилирующих гидролаз. Эту группу ферментов объединяют ряд общих характеристик как (р/а)8 структуры, гидролиз или формирование гликозидных концов в а-конформации, а также способность сохранять в активном центре остаток аминокислоты. Более чем 21 различных реакций и специфических продуктов обнаружено у ферментов этого семейства. Такое разнообразие позволяет широко использовать ферменты этого ряда в промышленности и для научных целей [3].
В настоящее время выделяют четыре главных группы крахмал-разрушающих ферментов: 1) эндоамилазы; 2) экзоамилазы; 3) ферменты, разрушающие по 1,6-связям; 4) трансферазы. Рассмотрим подробнее каждую из этих групп.
Эндоамилазы способны расщеплять а-1-4 гликозидные связи между остатками глюкозы во внутренней части (эндо-) амилозы или амилопектиновых цепочек. а-Амилаза (ЕС3.2.1.1) это одна из хорошо известных эндоамилаз. Она обнаружена в широком ряде микроорганизмов, принадлежащим к археям и эубактериям, в растениях и животных [4]. Конечным результатом действия а-амилазы являются олигосахариды с переменной длиной цепи с а- конфигурация и а-предельными декстринами, которые составляют разветвленные олигосахариды.
Энзимы, принадлежащие второй группе, экзоамилазы, включают в себя ферменты, которые разрывают исключительно а-1-4 гликозидные связи, как например Р-амилаза (ЕС 3.2.1.2), а также расщепляющие как а-1-4 так и а-1-6 гликозидные связи подобно амилоглюкозидазе или глюкоамилазе (ЕС 3.2.1.3) и а-глюкозидазе (ЕС 3.2.1.20). При действии экзоамилаз на глюкозы с внешних концов амилозы и амилопектина продуктом является или глюкоза (при действии глюкоамилаз и а-глюкозидаз), или мальтоза и а-предельные декстрины (при действии р-амилазы). р-Амилаза и глюкоамилаза также преобразовывают аномерную
конфигурацию высвобожденной мальтозы из а в ß форму. Глюкоамилаза и а-глюкозидаза могут отличаться по субстратной специфичности: а-глюкозадаза действует наилучшим образом на малтоолигосахариды и высвобождает глюкозу с а-конфигурацией, тогда как глюкоамилаза лучше гидролизует длинноцепочечные полисахариды. ß-Амилазы и глюкоамилазы обнаружены в большом ряде микроорганизмов [4].
Другие экзо-действующие амилолитические энзимы - циклодекстрин глюкотрансферазы (EC 2.4.1.19), энзим, который к тому же имеет способности к трансгликозилированной активности. К этому ряду принадлежат мальтоз-генерирующие а-амилазы (глюкан 1,4-а-глюкангидролаза, EC 3.2.1.133), например амилаза из Bacillus stearothermophilus, отщепляющая мальтозу [5], и мальтоолигосахариды, которые образуются при действии амилазы из Pseudomonas stutzeri (EC 3.2.1.60) (образуется мальтетроза) [5] или амилазы (EC 3.2.1.98) из Klebsiella pneumoniae (образуется мальтогексоза) [7].
Третья группа крахмал-конвертирующих энзимов составляют энзимы, гидролизующие исключительно а-1-6-гликозидные связи: изоамилаза (EC 3.2.1.68) и пуллуланаза тип I (EC 3.2.1.41). Основное различие между пулланазами и изоамилазой - это способность к гидролизу пуллулана, полисахарида с повторяющимися фрагментами мальтотриоз, которые соединены а-1-6-связями [8]. Пуллуланаза гидролизует а-1-6-гликозидные связи в пуллулане и амилопектине, тогда как изоамилаза может разрушать только а-1-6-связи в амилопектине. Эти энзимы исключительно деградируют амилопектин, оставляя длинные линейные участки полисахаридов. Выявлено, что глюкоамилаза из Sclerotium rolfsii также имеет значимое действие на пуллулан [9].
Также есть множество энзимов типа пуллуланаза, которые гидролизуют как а-1-4- так и а-1-6-гликозидные связи. Эти принадлежат группе II пуллуланаз и называется а-амилаза-пуллуланаза или амилопуллуланаза. Основные продукты разложения являются мальтоза и мальтотриоза. Особенный фермент, принадлежащий этой группе пуллуланаз -это неопулллуланаза, которая может также выполнить трансгликозилирование с образованием нового а-1-4- или а-1-6- гликозидного остатка [10].
Четвертая группа крахмал-разрушаюших ферментов - трансферазы, которые расщепляют а-1-4- гликозидные связи молекулы донора и переносят часть донора на гликозилированный акцептор с образованием нового гликозидного конца. К таким ферментам относятся например амиломалтаза (EC 2.4.1.25) и циклодекстрин гликозилтранфераза (EC 2.4.1.19), которые формируют новый а-1-4-гликозидную связь, а при энзим разветвленных субстратов (EC 2.4.1.18) формирует новые а-1-6 гликозидные связи.
Циклодекстрин гликозилтранферазы имеют очень низкую гидролитическую активность и одновременно синтезирует циклические
олигосахариды из 6, 7, или 8 остатков глюкозы и
сильно разветвленные декстрины с высокой молекулярной массой. Циклодекстрины образуются через внутримолекулярное транкликозилирование, при котором фермент разрушает а-1-4-гликозидную связь и одноврменно редуцирующий конец превращается в нередуцирующий [11,12].
Амиломальтаза очень сходна с циклодекстрин гликозилтранферазами в типе энзиматической реакции. Основное различие в том, что амиломалтаза выполняет реакцию
трангликозилирования, заканчивающуюся
линейным продуктом, тогда как циклодекстрин гликозилтранфераза дает циклический продукт. Амиломальтазы обнаружены в различных микроорганизмах, которые используют мальтозу или разлагают гликоген [11].
Большая часть ферментов, способных изменять структуру крахмала, относятся к одному семейству. Это семейство объединено по сходности аминокислотной последовательности, то есть детерменированы сходными генами. Его называют а-амилазное семейство, которое включает 13 гликозилгидролаз согласно классификации Henrissat [13]. В эту группу включаются ферменты, имеющие следующие характеристики: 1) они воздействуют на а-гликозидный конец, что позволяет им и гидролизовать этот конец с образованием как а-иномеров моно- или олигосахаридов (гидролиз), так и а-1-4 или 1-6 гликозидных последовательностей (трангликозилирование), или сочетаются обе эти активности; 2) они имеют (ß/a)8 или TIM бочкообразные структуры, образующие каталитический центр; 3) они обладают в первичной последовательности ДНК четырьмя очень хорошо сохранившимися областями [3], которые кодируют аминокислоты, формирующие каталитический центр, а также несколько аминокислот, которые придают устойчивости всей структуре TIM [14].
В современных условиях особое внимание уделяется бактериальным источникам
амилолитических ферментов. Ферменты этого семейства выделены из различных бактерий: Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, bacillus licheniformis, Thermus thermophiles, Aspergilus niger. В настоящее время а-амилаза, пуллуланаза, циклодекстрин гликозил-трансфераза и
малтопродуцирующая амилаза широко
используются в промышленном производстве в различных областях [15]. Наиболее востребованная из них а-амилаза, она же, вероятно, имеет наиболее широко распространение. Кроме их традиционного использования для осахаривания и перевода в жидкую фракцию крахмала, эти ферменты применяют для подготовки вязких, стабильных крахмальных растворов. Подобные коллоидные смеси используют для разделения текстильных волокон, ректификации пива от мутности или мякоти во фруктовых соках, кроме того их применяют для предобработки животного корма с целью повышения усвояемости и перевариваемости.
В современном мире, где существенная проблема нехватки пищевых источников, одним из
направлений использования амилолитичеких ферментов является изменения пищевых источников с низкими вкусовыми качествами, но высокими питательными. Примером такого нетрадиционного использования может служить модификация каштана. В некоторых южных странах на культуре каштановых деревьев лежит важная экологическая и экономическая роль. Использование их плодов имеет локальное значение, например, засахаренная мякоть каштана идет в кондитерскую продукцию. А этом случае отбираются только деликатесные продукты из высококачественных каштанов (с точки зрения размера, формы или соответствия для чистки и обработки), соответственно, это небольшой процент годового каштанового урожая. Остальное же годовой урожай каштановых плодов можно перерабатывать, учитывая их крахмалистую природу. Трансформированные с помощью амилаз каштаны могут быть использованы в получении альтернативной пищи или для биотехнологических целей [16].
В Европе одним из регионов, лидирующих по выращиванию каштанов, является испанская Галлия. На сегодняшний момент активно продвигаются две реальных промышленных направления для использования переработанных каштанов: 1) изучается и внедряется технология получения сладкой муки для людей с заболеваниями брюшной полости и аллергиков, вследствие отсутствия глютена в каштанах; 2) внедряется производство алкогольного напитка из дистиллятов перебродившего каштана. В первом случае, используется только частичный ферментный гидролиз крахмала каштана с помощью амилаз, в то время как во втором гидролиз должен пройти полностью. С целью создания модели полного расщепления крахмала в каштановых плодах испытывались смеси термостабильные а-амилаза (Termamyl 120L, тип S) и глюкоамилаза (AMG 300L). Полный гидролиз проходит только в том случае, когда используют высокие концентрации обоих ферментов, при этом проявляется синергический эффект у энзимов [16].
Датская фирма Novo Nordisk производит два ферментных препарата: 1) BAN 480L (бактериальная а-амилаза, выделенная из селективного штамма Bacillus amyloliquefaciens); и 2) Dextrozyme E (подобранная смесь глюкоамилазы из генетически модифицированого штамма Aspergilus niger и пуллуланазы из генетически модифицированного штамма Bacillus). Эти смеси ферментов широко используются для гидролиза в различных отраслях промышленности [17].
Расширяющаяся новая область применения а-амилаза - это область производства стиральных порошков и моющих средств. Современная тенденция среди потребителей заключается в использовании более холодных температур для стирки или мытья посуды. В этом случае, при использовании более низких температур, удаление крахмала с ткани и фарфора становится более проблематичным. Стиральные порошки с а-амилазами оптимально работают при умеренных
температурах и щелочной pH, что может помочь решать возникшую проблему.
Два крахмала-модифицирующих фермента - а-амилазаного семейства, которые не находят пока крупномасштабного применения - это амиломальтаза и фермент, увеличивающего степень разветвления крахмала. Существуют несколько патентов, описывающих потенциальное
использование второго фермента в хлебе как анти-стареющего агента [18], или для производства низко-вязких с высокой молекулярной массой крахмалов, например для покрытия бумаги [19] или разделения текстильных волокон, таким образом, делающих волокна более прочными [20].
Потенциально интересное промышленное применение амиломальтазы, - производство термообратимых крахмальных гелей. Как уже указано выше, нормальный необработанный крахмальный гель не может быть растворен в воде после того, как имела место его ретрограция. Тем не менее, крахмал, что обработанный амиломальтазой получается термообратимые желирующие характеристики: он может быть растворен при многоразовом нагревании. Это поведение очень схоже с желатином. Van der Maarel с соаторами [3] описал этот процесс, используя амиломальтазу из термофильной бактерии Thermus thermophilus. К настоящему времени, амиломальтазы коммерчески не доступны и термообратимые крахмальные гели не производятся в промышленном масштабе.
Таким образом, ферментные препараты амилолитического ряда микробного происхождения могут быть использованы не только для модификации пищевого сырья, но могут быть использованы с целью получения непищевых продуктов с заданными свойствами.
Литература
1. Aiyer, P.V. // African J. Biotechnology - 2005. - V.4-N.13 -P.1525 - 1529.
2. DeBaere H. // Starch. 1999. - V.51, - P.189-193.
3. Maarel M.J.E.C., B. Veen, J.C.M. Uitdehaag, H. Leemhuis, Dijkhuizen L. // J. Biotechnology. - 2002. -V.94, - P.137-155.
4. Pandey, A., Nigam, P., Soccol, C.R., Soccol, V.Y., Singh, D., Mohan, R. // Biotechnol. Appl. Biochem. - 2000. -V.31, - P.135-152.
5. Diderichsen, B., Christiansen, L. //. FEMS Microbiol. Lett. - 1988. - V.56, - P.53-60.
6. Robyt, J.F., Ackerman, R.J., // Arch. Biochem. Biophys. -1971. - V.145, - P.105-114.
7. Momma, M. // Biosci. Biotechnol. Biochem. -2000. -V.64, - P.428-431.
8. Israilides, C., Smith, A., Scanlon, B., Barnett, C., // Biotechnol. Genet. Eng. Rev. -1999. -V.16, -P.309-324.
9. Kelkar, H.S., Deshpande, M. // Starch. - 1993. - V.45, -P.361-368.
10. Takata, H., Kuriki, T., Okada, S., Takesada, Y., Iizuka, M., Imanaka, T. // J. Biol.Chem. -1992. -V.267, - P.18447-18452.
11. Takaha, T., Smith, S.M. // Biotechnol. Genet. Eng. Rev. -1999. -V.16, - P.257-280.
12. Van der Veen B.A., J.C.M. Uitdehaag, B.W. Dijkstra, L. Dijkhuizen // Biochem. Biophys. Acta. - 2000. - V.1543. -P.336-360.
13. Henrissat, B. // Biochem. J. - 1991. - V.280, P.309-316.
14. Kuriki, T., Imanaka, T. // J. Biosci. Bioeng. -1999. -V.87, - P.557-565.
15. Никитина Е.В., Решетник О.А., Губайдуллин Р.А. // Вестник Казанского технологического университета. -2013. -Т. 16. - № 13. - С. 148-153.
16. Lopez C., Torrado A., Fucinos P., Guerra N. P., Pastrana L. // Enzyme and Microbial Technology. - 2006. - V.39, -P.252-258.
17. Prochaskaa K. / P. Kedzioraa, J.L. Thanhb, G. Lewandowicz // Food Hydrocolloids. - 2007. -V.21, -P.654-659.
18. Spendler, T., Jergensen, O., Patent application WO97/41736. 1997.
19. Bruinenberg, P.M., Hulst, A.C., Faber, A., Voogd, R.H., European patent application EP 0 690 170 A1. 1996.
20. Hendriksen, H.V., Pedersen, S., Bisgard-Frantzen, H. Patent application WO 99/35325. 1999.
© Е. В. Никитина - канд. биол. наук, доц. каф. технологии пищевых производств КНИТУ, НОЦ фармацевтики КФУ, ev-nikitina@inbox.ru.
© E. V. Nikitina - PhD, associate Professor of Technology of food production KNITU, REC "Pharmaceuticals KFU, ev-nikitina@inbox.ru.
