CC BY
24
УДК 616. 98
1 А.Ж. Ахметова, 1 С.Е. Рахимова, 2 Л.Т. Чингисова, 1 К.Е. Берикханова, 1 Р.Б. Исаева, 1 А.Р. Акильжанова
1 ÖMip туралы гылымдар орталыгы, Назарбаев Университету Астана
2 Казахстан Республикасы Туберкулез Проблемаларыныи ¥лттьщ Орталыгы, Алматы
КАЗАКСТАННЫИ ЭР ТYРЛI ОБЛЫСТАРЫНДА ТАРАЛГАН M. TUBERCULOSIS
ИЗОЛЯТТАРЫНЬЩ ИЗОНИАЗИДКЕ Т0З1МД1Л1Г1Н АНЫКТАЙТЫН KATG, FABG-INHA, AHPC-OXYR ГЕНДЕР1НДЕГ1 МУТАЦИЯЛАРДЫ АНЫКТАУ
ТYЙiн
Бул жумыста ^азакстанныч 3 облысындагы (Алматы, фстанай ж8не ^ызылорда) жача жавдайлар арасынан бвлiнiп алынган M. tuberculosis изоляттарыньщ изониазидке т©зiмдiлiктi аныктайтын гендерiнде мутациялардыч таралу сипаты мен cne^pi багаланды. Аталган облыстарда таралган M. tuberculosis популяциясына изониазидке твзiмдiлiкке жауап беретiн katG-генiнде мутацияларды4 315^i кодонда басымдылык кврсетуi (с8йкесiнше 97,1 %; 92,3%; 69,2 %) т8н.
Негiзгi сездер: katG генi, fabG-inhA промоторлык аймагы, oxyR-ahpC промоторлык аймагы, изониазид-твзiмдiлiк, Mycobacterium tuberculosis.
Kipicne
Массалык БЦЖ вакцинациясы мен туберкулезге карсы препараттарды колдануга карамастан, туберкулез дYниежYзiнде медицинадагы негiзгi м8селелердiч бiрi болып калуда (1). Жыл сайын жачадан инфекциялангандар саны есуде, ж8не д8рiге твзiмдi M. tuberculosis штаммдары кеч таралуда. Кох таякшаларыныч туберкулезге карсы колданылатын д8рi-д8рмектерге твзiмдiлiгi туберкулезге карсы терапиядагы еч негiзгi кедерп болып табылады. ©кiнiшке орай, бiздiч республикамызда да туберкулездiч д8рiге тезiмдi тYрiмен ауыратын наукастар саны кебеюде.
^азакстан Республикасыныч Туберкулез Проблемаларыныи ¥лттык Орталыгы 2011 ж. м8лiметтерi бойынша, ^останай ж8не ^ызылорда облыстарында ауру керсеткiштерi республикалык дечгейден (95,3 адам 100 000 халыкка) 8лдекайда жогары, с8йкесiнше 100 000 халыкка 110 ж8не 107,5 адамды курайды. Республикалык дечгейдеп ауру кврсеткiштерiнен темен керсетюштер Алматы облысында тiркелген - 100 000 халыкка 80,8 адам.
Изониазид - бiрiншi катардагы негiзгi туберкулезге карсы препараттарды4 6¡^í, туберкулездiч 8р тYрлi формаларын емдеуде кеч колданылады. Препарат аэробты жавдайларда белсендi тYPде бвлiнетiн микобактерияларга бактеридцидтi 8сер етедi. Тыныштык кYЙдегi ж8не анаэробты жавдайдагы микроагзаларга 8сер етпейдi. Изониазид рифампицинмен бiрге барлык терапиялык сызбанускалардыч курамына кiредi (2, 3).
Изониазидтщ микобактерияларга 8сер ету механизмi рифампицинмен салыстырганда кYPделiрек. Изониазид белсендi емес формадагы д8рiдiк препарат болып табылады. Микроб жасушасыныч iшiне тYскеннен кешн, препарат каталаза-пероксидаза ферментУ ч 8серiнен белсендi формаларга, ягни бос радикалды изоникотин кышкылыныч туындыларына айналады. Д8л осы туындылар кептеген жасушалык нысандарга закымдаушы 8сер етедi. Эсердiч негiзгi нысаны болып NADH-т8уелдi-ACp-редуктаза (InhA) саналады. Бул M.tuberculosis жасуша кабыкшасыныч негiзгi компонент - миколий кышкылы (агыл. Mycolic acid)
синтезУч Heri3ri ферментi. Сонымен катар, изониазидщ белсендi бос радикалды туындылары микроагзаныч ДН^-сы, квмiрсулары мен липидтерЫе тiкелей закымдаушы эсер етедi (4). Изониазидке твзiмдiлiктiч пайда болуын бiрнеше генетикалык локустардагы взгерiстермен байланыстырады: katG (каталаза-пероксидаза генi), inhA аймагы (NADH-т8уелдi-ACP-редуктаза ген1), ahpC аймагы (алкил-гидропероксидредуктаза Твзiмдiлiктiч пайда
болуы мен katG генiндегi мутациялар немесе делециялардыч арасындагы байланыс алгаш рет Zhang et.al (1992) жумысында кврсетiлген (5). Генетикалык взгерiстер katG каталазды белсендтИыч толык немесе жартылай жогалуына 8келедi, katG мен изониазидтщ байланысу кабiлетi твмендейдi, осыныч нэтижеЫнде изониазид белсендi емес формадан белсендi формага айналмайды.
Зерттеу жумыстары, твзiмдiлiкке 8келетiн нуклеотидтi алмасулар katG генУч квптеген позицияларында пайда болатынын кврсетедк Бiрак, квп жагдайда 60-98% изониазид-твзiмдi штаммдарда мутациялар 315-кодонда кездеседi (6, 7). Осы кодондагы мутациялар жогары дечгейдеп твзiмдiлiктiч пайда болуына 8келедi (8).
Каталазды активтткпч жогалуы твзшдтктщ тек бiр гана себебi емес. Сонымен катар, твзiмдiлiк NADH-т8уелдi-ACP-редуктазаны кодтайтын inhA генiндегi мутациялар незiнде де пайда болады (9). Изониазид-твзiмдi изоляттардыч 0-5% жагдайында мутациялар курылымдьщ генде табылса (10), 8-20% жагдайда мутациялар fabG-inhA промотор аймагында кездеседi (11, 13). AhpC гипервнiмдiлiгiне 8келетiн ahpC промоторлык аймагындагы взгерiстер мен изониазидке твзiмдiлiкпен байланыс Wilsson et al. (1996) жумысында кврсетiлген (12). Зерттеу жумыстары, изониазид-твзiмдi штаммдарда мутациялар oxyR-ahpC промоторлык аймагында болатынын да кврсетедi (14).
Зерттеу дизайнi ауру-бакылау зерттеулерЫ (1-сурет); когортаныч болжалды зерттеулерУ молекулалык-эпидемиологиялык зерттеулердi; адамныч туберкулезге генетикалык сезiмталдыFы зерттеулерiн камтиды.
1-сурет - Ауру-бакылау зерттеулершщ дизайнi.
Осы зерттеу жумысыньщ максаты:
Казакстанныч 3 облысынан (Алматы, Кызылорда, Костанай обльстарь) жача жагдайлар арасьнан белУп алы^ан M. tuberculosis клиникалык изоляттарыныч katG reHÍ, fabG-inhA, oxyR-ahpC промоторлык аймагында мутациялар жиiлiгiн аныктау.
Материалдар мен эдютер. Зерттеу жумысында Алматы, Кызылорда ж8не Костанай облыстарынан жиналган фeнотиптiк изониазидке тезiмдi 60 (34 -Алматы облысынан, 13 - Кызылорда облысынан ж8не 13 Костанай облысынан) ж8не сeзiмтал 57 (20 -Алматы облысынан, 24 - Кызылорда облысынан, 13 -Костанай облысынан) M. tuberculosis клиникалык изоляттары анализдeндi. Изоляттардыч изониазидке дэрiлiк сeзiмталдыFы Казакстан Республикасыныч Туберкулез Проблемаларыныч ¥лттык ОрталыFы референс-зертханасында (Алматы каласы) абсолютт концентрациялар 8дiсiмeн аныкталды. Бакылау ретще M. tuberculosis H37Rv рeфeрeнттi штаммы (NC_000962) колданылды. ЖиналFан M. tuberculosis клиникалык изоляттарыныч тiршiлiк бeлсeндiлiгi 80°С температурада 30 минут зиянсыздандырылды. ДНК Supply, 2004 нускауына с8йкес белщк
M. tuberculosis клиникалык изоляттарыныч изониазидке тезiмдiлiгiн аныктайтын katG гeнi, fabG-inhA жэне oxyR-ahpC промоторлык аймаFыныч амплификациясын курамында 10xdNTP, 10xbuffer, 2,5 mM MgCl2, 1 бiрлiк Taq-полимераза (Fermentаs, EC) ж8не 10 пмоль 8рбiр праймер бар стандартталFан реакциялык коспада Eppendorf амплификаторында еткiздiк. ПТР коспасыныч жалпы келeмi 20 |1 katG гeнi, fabG-inhA ж8не oxyR-ahpC промоторлык аймаFыныч нуклeотидтiк тiзбeктeрiн аныктауды ендiрушi-компания хаттамаларына с8йкес ABI 373о (Applied Biosystems, АКШ) генетикалык анализаторыныч кемeгiмeн жYзeгe асырдык.
Зерттеу нэтижелерк 117 M. tuberculosis клиникалык изоляттарыныч (сeзiмтал ж8не тезiмдi) изониазидке тезiмдiлiккe жауап бeрeтiн мутациялар кeздeсeтiн katG геы, fabG-inhA ж8не oxyR-ahpC
промоторлык аймагыныч нуклеотидтiк TÍ36eKTepÍH аныктау бойынша зерттеу жумыстары вткiзiлдi.
Барлык 117 M. tuberculosis клиникалык изоляттарыныч (сезiмтал да, твзiмдi де) изониазидке твзiмдiлiктi аныктайтын гендердегi мутациялар 59 (50,4%) M. tuberculosis изоляттарда аныкталды.
57 изониазид-твзiмдi изоляттардыч (95%) katG геынде сериннiч треонин аминкышкылына алмасуына экелетЫ 315-шi кодондагы мутация аныкталды. Соныч iшiнде екi жавдайда (3,5%) кос мутациялар байкалды, ягни бiр уакытта мутациялар katG генiнде жэне fabG-inhA промоторлык аймагыныч -15 Т-С позициясында кездестi. Екi жавдайда (3,32%) мутациялар, сэйкесЫше, fabG-inhA промоторлык аймагыныч - 8 Т-С позициясында жэне oxyR-ahpC промоторлык аймагыныч - 46 G-A позициясында табылды. Калган 1,66% (1 изолят) жавдайда барлык изониазид-твзiмдi M. tuberculosis клиникалык изоляттарыныч арасында мутациялар аныкталмады, бул изолятта мутациялар изониазидке-твзiмдiлiктi аныктайтын баска гендерде болуы мYмкiн деп тYсiндiруге болады.
Изониазид-сезiмтал 57 M. tuberculosis клиникалык изоляттарын зерттеу барысында katG генi, fabG-inhA жэне oxyR-ahpC промоторлык аймагында мутациялар аныкталмады.
Облыстар бойынша альнан мэлiметтер 1-кестеде кврсетiлген. 3 облыста таралган изониазид-твзiмдi изоляттарда katG генiнiч Ser315Thr кодонындагы мутация сэйкесiнше Алматы, Кызылорда жэне Костанай облыстарында 97,1%, 92,3%; 69,2% байкалды. Алматы облысындагы барлык твзiмдi изоляттардыч арасында 1 жавдайда (2,9%) мутациялар аныкталмады. Кызылорда облысындагы изониазидке-твзiмдi Yлгiлердiч арасында 15,4% (2 изолят) жавдайында кос мутациялар - katG (Ser315Thr) + fabG-inhA (-15 C-T), 15,4 % жавдайында мутациялар fabG-inhA промоторлык аймагыныч -15 С-Т позициясында аныкталды. Костанай облысында изониазид-твзiмдi клиникалык изоляттардыч 7,7% жавдайында мутациялар fabG-inhA промоторлык аймагыныч - 8 Т-С позициясында кездестк
1-кесте.
Казакстан Республикасынныч 3 облысынан жиналган М. tuberculosis клиникалык изоляттарыныч katG,
Облыс Тезiмдi Yлгiлeр саны Ceзiмтал Yлгiлeр саны katG (Ser315Thr) геннде мутациялар аныкталFан Yлriлeр саны (%) fabG-inhA промоторлык аймапында мутациялар аныкталFан Yлгiлeр саны (%) oxyR-ahpC (-46G-A) промоторлык аймаFында мутациялар аныкталFан Yлгiлeр саны (%) Кос мутациялар - katG (Ser315Thr) + fabG-inhA (-15 CT) аныкталFан Yлriлeр саны (%) Мутациялар аныкталмаFан Yлriлeр саны (%)
-15 C-T - 8 T-C
Алматы 34 20 33 (97,1) - - - - 1 (2,9)
Кызылорда 13 24 9 (69,2) 2 (15,4) - - 2 (15,4)
Костанай 13 13 12 (92,3) - 1(7,7) - - -
KopbiTbiHAbi. 3eprrey «yMbicbiHbi^ H8TU«eciH,qe, AnMaTbi, ^ocTaHart «8He ^bi3binop,qa o6nbicTapbiH,qaFbi «a^a «afflartnap apacbHaH 6eniHin anbHfaH M. tuberculosis nonyn^uacbiHa u30Hua3Mfl npenapaTbHa Te3iMfliniKKe «ayan 6epeTiH katG reHiHi^ 315-wi Ko,qo-HNHflafb мyтaцмflHN4 (Ser-Thr) «ofapbi «uiniKTe (C8M-KeciHme 97,1%; 92,3%; 69,2 %) Ke3flecyi T8H.
ddeöuemmep:
1. Global tuberculosis control: epidemiology, strategy, financing // WHO report. - 2009. - P. 303.
2. Rodrigues L., Machado D., Couto I., Amaral L., Viveiros M. Contribution of efflux activity to isoniazid resistance in the Mycobacterium tuberculosis complex // Infect Genet Evol. - 2012. - Vol 12(4). - P.695-700.
3. Zhang Y. Isoniazid. -In Rom W. N., Garay S. M., Lippincott W. and Wilkins (ed). Tuberculosis. A Wolters Kluwer Company, New York. 2003. - P. 739-758.
4. Leung E.T., Ho P.L., Yuen K.Y., Woo W.L., Lam T.H., Kao R.Y., Seto W.H., and Yam W.C. Molecular Characterization of Isoniazid Resistance in Mycobacterium tuberculosis: Identification of a Novel Mutation in inhA // Antimicrob Agents Chemother. - 2006. -Vol 50(3). - P. 1075-1078.
5. Zhang Y., Heym B., Allen B., Young D. and Cole S. The catalase-peroxidase gene and isoniazid resistance of Mycobacterium tuberculosis// Nature. -1992. -Vol. 358. -P. 591-593.
6. Zhang M., Yue J., Yang Y., Zhang H., Lei J., Jin R., Zhang X., Wang H.. Detection of Mutations Associated with Isoniazid Resistance in Mycobacterium tuberculosis Isolates from China// J. Clin. Microbiol. -2005. -Vol. 43. -P. 5477-5482.
7. Mokrousov I., Narvskaya O., Otten T., Limeschenko E., Steklova L., and Vyshnevskiy B. High Prevalence of KatG Ser315Thr Substitution among Isoniazid- Resistant Mycobacterium tuberculosis Clinical Isolates from Northwestern Russia, 1996 to 2001// Antimicrob. Agents Chemother. -2002. -Vol. 46(6). -P. 1417-1424.
8. Abate D., Tedla Y., Meressa D., Ameni G. Isoniazid and rifampicin resistance mutations and their effect on second-line anti-tuberculosis treatment// The International Journal of Tuberculosis and Lung Disease. -2014. - Vol. 18(8). -P. 946-951(6).
9. Jagielski T., Bakuta Z., Roeske K., Kaminski M., Na-piorkowska A., Augustynowicz-Kopec E., Zwolska Z and Bielecki J. Detection of mutations associated with isoniazid resistance in multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis clinical isolates// J. Antimicrob. Chemother. -2014. -Vol. 69 (9). -P. 2369-2375.
10. Zhang Y. and A. Telenti. Genetics of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis// In Hatfull G, Jacobs W R (ed). Molecular genetics of mycobacteria. American Society of Microbiology Press, Washington D.C. - 2000. - P. 235-254
11. Ramaswamy, S., and J. M. Musser. Molecular genetic basis of antimicrobial agent resistance in Mycobacte-rium tuberculosis: 1998 update// Tuber. Lung Dis. - 1998. -Vol. 79. - P. 3-29.
12. Costa ERD., Ribeiro M.O., Silva SNM., Arnold L.S, Rostirolla D.C. et al. Correlations of mutations in katG, ox-yR-ahpC and inhA genes and in vitro susceptibility in Mycobacterium tuberculosis clinical strains segregated by spoli-gotype families from tuberculosis prevalent countries in South America// BMC Microbiology. -2009. - Vol. 9. - P.39.
13. Ramaswamy S.V., Dou S.J., Rendon A., Yang Z., Cave M.D., and Graviss E.A.. Genotypic analysis of multi-drug-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from Monterrey, Mexico// J. Med. Microbiol. - 2004. - Vol. 53. -P. 107-113.
14. Baker L.V., Brown T.J., Maxwell O., Gibson A.L., Fang Z., Yates M.D. and Drobniewski F.A. Molecular Analysis of Isoniazid-Resistant Mycobacterium tuberculosis Isolates from England and Wales Reveals the Phylogenetic Significance of the ahpC -46A // Polymorphism Antimicrob. Agents Chemother. - 2005. - Vol. 49. - P. 4 1455-1464.
Резюме
ОПРЕДЕЛЕНИЕ МУТАЦИЙ В ГЕНАХ KATG, FABG-INHA, AHPC-OXYR, ОБУСЛАВЛИВАЮЩИХ УСТОЙЧИВОСТЬ К ИЗОНИАЗИДУ, СРЕДИ КЛИНИЧЕСКИХ ИЗОЛЯТОВ M. TUBERCULOSIS ИЗ РАЗЛИЧНЫХ ОБЛАСТЕЙ КАЗАХСТАНА 1 А.Ж. Ахметова, 1 С.Е. Рахимова, 2 Л.Т. Чингисова, 1 К.Е. Берикханова, 1 Р.Б. Исаева, 1 А.Р. Акильжанова 1 Центр Наук о жизни, Назарбаев Университет, Астана, 2 Национальный Центр Проблем Туберкулеза Республики Казахстан, Алматы В данной работе проведена оценка спектра и характера распространенности мутаций в генах, обуславливающих резистентность к изониазиду в штаммах, выделенных из трех областей Казахстана (Алматинская, Костанайская и Кызылординская область). Для популяции M. tuberculosis, циркулирующей в данных областях характерна высокая частота встречаемости мутаций в 315 кодоне katG-гена (97,1%; 92,3%; 69,2 % ^ответственно), определяющем устойчивость к изониазиду.
Ключевые слова: ген katG, промоторная область fabG-inhA, промоторная область oxyR-ahpC, изониазид-устойчивость, Mycobacterium tuberculosis.
Abstrart
DETERMINATION OF MUTATIONS IN KATG, FABG-INHA, AHPC-OXYR GENES RESPONSIBLE FOR IZONIAZID-RESISTANCE AMONG CLINICAL ISOLATES OF M. TUBERCULOSIS FROM DIFFERENT REGIONS OF KAZAKHSTAN 1 A.Zh. АкИте^а, 1 S.E. Rakhimova, 2 L.T. Chingissova, 1 К.У. Berikkhanova, 1 R.B. Issayeva, 1 AR. Аkilzhanova 1 Center for Life Sciences, Nazarbayev University, Astana, 2 National Center for Tuberculosis Problems, Almaty Spectrum of mutations in genes that cause resistance to isoniazid in clinical isolates of M. tuberculosis circulating in 3 regions of Kazakhstan (Almaty, Kostanay, Kyzylorda regions) was estimated in this study. High frequency of mutations at 315 codon of katG gene (97,1%; 92,3%; 69,2% respectively) responsible for resistance to isoniazid was detected among M. tuberculosis isolates distributed in mentioned regions.
Key words: katG gene, fabG-inhA promoter region, oxyR-ahpC promoter region, isoniazid-resistance, Mycobacterium tuberculosis.
