CC BY
40
УДК595.384.12
В.И. Ковалёва, ВГМУ; Г.Г. Калинина, Дальрыбвтуз, Владивосток АВТОРАДИОГРАФИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПОЛОВЫХ КЛЕТОК САМЦОВ ТРАВЯНОГО ШРИМСА PANDALUS LATIROSTRIS
Анализ данных авторадиографии показал, что синтетические процессы в половых клетках весной более активны, когда гонады находятся в состоянии активного гаметогенеза. Между синтезом ДНК и РНК имеется положительная корреляция. ДНК включается в интерфазные и профазные ядра до стадии пахинемы. В сперматогониях и сперматоцитах I порядка преобладает ядерный синтез ДНК.
Интенсивность синтетических процессов в развивающихся половых клетках определяется авторадиографически. В настоящее время включение меченых предшественников лучше изучено у позвоночных. Такие предшественники использовались для описания длительности стадий спермато- и спермиогенеза [7, 8]. Данные об авторадиографических исследованиях крайне скудны, а относительно половых клеток самцов травяного шримса они, по нашим сведениям, отсутствуют.
В настоящей работе исследовали синтез ДНК И РНК в половых клетках самцов травяного шримса в различные сезоны года.
В некоторых авторадиографических исследованиях половых клеток беспозвоночных отмечается идентичность распределения метки в опытах in vivo и in vitro. Холланд и Гизе [6], исследуя синтез ДНК в гонаде морского ежа, установили, что опыты с изотопами in vivo и in vitro выявляют одинаковую авторадиографическую картину.
Авторадиографические исследования синтеза ДНК и РНК в семенниках травяного шримса выполнены in vitro. Кусочки семенников размером 0,5 см инкубировали в 30 мл морской воды, содержащей меченый по тритию предшественник (тимидин или уридин в концентрации
3,7 • 105 С- /мл.), в течение 10, 20 и 30 мин, 1, 2, 4, 6, 12 и 16 ч. Перед нанесением эмульсии Р-срезы обрабатывали 2%-ой хлорной кислотой 15 мл. Длительность экспозиции - 24 дня при температуре 4 °С. Подсчитывали число меченых клеток и количество зёрен над клетками. Опыты с тимидином и уридином проводили зимой и весной. Рассчитывали коэффициенты корреляции между интенсивностью включения тимидина и уридина в ядро и цитоплазму сперматогоний. Степень достоверности коэффициентов корреляции определяли обычными методами [2]. Количественные данные обрабатывали на ЭВМ МИР-2.
Инкубация с тимидином. Зимой в гонаде креветки интенсивно образуются половые клетки [1]. Анализ автографов показывает, что ядра сперматогоний активно синтезируют ДНК. Интенсивность метки, т.е. количество зерен серебра над ядром, в течение инкубации возрастает в среднем от 5 до 25 (таблица). К концу опыта 94 % всех интерфазных ядер сперматогоний включают предшественник ДНК. Количество зёрен над ядрами иногда более 30, встречаются плотные «шапки» зёрен над клетками.
В апреле-мае гонада находится в состоянии активного гаметогенеза. Половые клетки представлены главным образом сперматогониями и сперматоцитами I; наблюдаются деления созревания. Самый активный синтез ДНК происходит в ядрах сперматоцитов I порядка (таблица). К 12 ч инкубации над всеми интерфазными ядрами этих клеток увеличивается метка (рисунок).
В профазных ядрах сперматоцитов I порядка количество зерен серебра невелико. Ядра редко встречающихся сперматоцитов II порядка тимидин не включают. Синтез ДНК в ядрах сперматогоний заметно снижается, но полностью не исчезает. К концу опыта только 45 % всех ядер сперматогоний содержали меченый предшественник ДНК
30
Интенсивность включения (число зерен, ± Мт) 3Н-тимидина и 3Н-уридина в половые клетки семенников травяного шримса
Месяц Клетки Длительность инкубации
10 мин 20 мин 30 мин 1 ч 2ч 4ч 6ч 12ч
Тимидин
Февраль Сперматогонии: ядро - 5,6 ± 0,6 6,0 ± 0,4 6,3 ± 0,3 13,3 ±0,9 24 ±0,7 19,8 ±0,2 21,1 ±0,6
Май Сперматогонии: ядро Сперматоциты I порядка: ядро 2.2 ±0,3 2.3 ±0,1 2,5 ± 0,1 2,7 ± 0,1 3,4 ± 0,1 3,1 ± 0,1 5.5 ± 0,2 4.5 ± 0,1 6,5 ±0,1 11 ±0,1 8,7 ±0,2 12,5 ±0,8 15.7 ±0,9 14.8 ±0,1 15,3 ±0,2 18,0 ±0,6
Февраль Ури дин
Сперматогонии: ядрышко ядро цитоплазма 2,7 ±0,1 3,4 ±0,3 4,8 ±0,4 3,6 ±0,1 3,2 ±0,2 4.8 ±0,1 4.9 ±0,2 3,4 ±0,7 7,6 ±0,7 4,9 ±0,8 3.7 ±0,2 8.7 ±1,4 5,0 ±0,2 3,9 ±0,2 8,8 ±0,1 4,4 ±0,5 4.2 ±0,4 11,8 ±0,6 5.3 ±0,3 -
Май Сперматогонии: ядрышко ядро цитоплазма - 3,9 ±0,4 4,6 ±0,1 3,4 ±0,5 3,8 ±0,1 7,5 ±0,1 3,2 ±0,1 4.9 ±0,5 9,2 ±1,1 4.9 ±0,1 5.1 ±0,5 10.1 ±1,1 4,8 ±0,5 5,2 ±0,3 9,5 ±0,3 4,8 ±0,2 - -
Сперматоциты I порядка: ядро - - 3,9 ±0,1 6,3 ±0,1 6,9 ±0,4 7,4 ±0,3 - -
31
Радиоавтографы гонады самца травяного шримса после 12 часов инкубации с 3Н-тимидином в ядрах сперматоцитов I. Ув. об. 100 х. ок. 15
Инкубация с уридином. В феврале наряду с синтезом ДНК в сперматогониях не менее активно синтезируется РНК. Первые зерна серебра появляются над ядрышком сперматогоний, интенсивность метки на протяжении всего времени инкубации небольшая (см. таблицу). Позднее метка появляется в ядре и цитоплазме, но в цитоплазме зерен значительно меньше.
В мае включение РНК-предшественника снижается, уменьшается количество меченых сперматогоний. Зерна серебра видны главным образом над сперматоцитами I порядка, предшественник включается только в интерфазные и профазные ядра, что соответствует данным, полученным при изучении сперматогенеза других животных [4]. В цитоплазме клетка не обнаруживается. Отсутствие цитоплазматического синтеза РНК в сперматоцитах I порядка можно объяснить тем, что рост этих клеток у приморской креветки не выражен. Во время деления сперматоцитов и после него РНК не синтезируется. Сперматоциты II порядка РНК-предшественник не включают.
У дальневосточной креветки Р. аНгозШэ ядра сперматогоний синтезируют ДНК зимой и весной, т.е. когда гонада переходит на стадии активного гаметогенеза, что подтверждается морфологическими данными [1]. Цитоплазматический синтез РНК в сперматогониях у травяного шримса сопряжен с ядерным. Наблюдается достоверная корреляция между количеством зерен серебра над ядром и цитоплазмой сперматогоний в гонаде, инкубированной с тимидином весной. Уридин включается главным образом в ядра сперматогоний, в
32
цитоплазме этих клеток интенсивность этой метки незначительна. Цитоплазма сперматоцитов I предшественник РНК не включает. Таким образом, можно говорить о преобладании в сперматогониях и сперматоцитах I ядерного синтеза. Подобные результаты получены и при исследовании синтеза РНК в процессе сперматогенеза у других животных [3]. Наиболее активные синтетические процессы в гонаде травяного шримса наблюдаются весной, что соответствует массовому накоплению сперматогонии и подготовке сперматоцитов I к мейозу. Таким образом, авторадиографические данные позволяют более полно интерпретировать гистологические картины и точнее характеризовать состояние половых клеток семенника в течение года.
Библиографический список
1. Калинина Г.Г. Кавалёва В.И. Репродуктивная биология травяного шримса залива Петра Великого. Владивосток: Дальрыбвтуз, 2008. С. 49-52.
2. Урбах В.Ю. Биометрические методы. М.: Наука, 1964. 415 с.
3. Anastassova-Kristeva M., Kantcheva L., Hadjioloff A.I. Rechercher histoautoradiographiques sur la synthese d'ADH et ARN dans la spermatopoiese chez le hamster Изв. Ин-те морфол. Бълг. АН, 1974. 15, 3: 5-15.
4. Hilscher B., Hilscher W, Dauss D. Autoradiographische Untersuchungen zur Kinetic der Praspermatogenese und Spermatogenese der Wistarratte. Zuctthygine. 1972. 7, 1: 1-14.
5. Holland N.D. Giese A.C. An autoradiographic investigation of the gonads of the purple sea urchin (Strongylocentrotus purpuratus). Biol. Bull. 1965. 128, 2: 241-258.
6. Meistrich M.Z., Reid B.O., Barcellone W.J. Changes in sperm nuclei during spermiogenesis and epididymal maturation. Exp. Cell Res. 1976. 99, 1: 72-78.
7. Rocchi B.A. Studio dell' incorporazione della timidina durante la spermatogenesi di Asselus coxalis. Atti Accad. naz. Lincei. Rend. Cl. sci. fis., mat. e natur. 1967. 42, 2: 264-268.
