CC BY
29
Серия «Биология. Экология»
Онлайн-доступ к журналу: http://isu.ru/izvestia
2016. Т. 16. С. 84-89
Иркутского государственного университета
И З В Е С Т И Я
УДК 578.81
Автохтонные бактериофаги в экосистеме
озера Байкал - самого глубокого древнего озера мира:
краткие итоги изучения
В. В. Дрюккер
Лимнологический институт СО РАН, Иркутск E-mail: drucker@lin.irk.ru
Аннотация. Изложены краткие итоги исследований морфологического разнообразия, численности, размерного спектра автохтонных бактериофагов, выделенных из различных биотопов озера Байкал. Молекулярно-биологические исследования байкальских фагов выявили уникальность некоторых из них. Проведён биоинформационный анализ и расшифрован полный геном гигантского фага PaBG из семейства Myoviridae.
Ключевые слова: автохтонные бактериофаги, морфологическое разнообразие, численность, размерный спектр, геном, нейстон, биоплёнки, озеро Байкал.
Введение
В конце прошлого столетия внимание исследователей было обращено на высокую численность вирусов-бактериофагов, содержащихся в воде морей и океанов - до 108-10 частиц в 1 мл воды [6; 7]. Было установлено, что автохтонные вирусы бактерий ввиду своей многочисленности в водных экосистемах оказывают крупномасштабное влияние на глобальные процессы в биосфере, в частности, участвуют в контроле численности, многообразия и эволюции микроорганизмов. Фаги - самые мелкие организмы водных экосистем, их величина измеряется в нанометрах. Они способны быстро размножаться, вызывая лизис бактерий, влиять на многие физиологические, биогеохимические и экологические процессы, осуществляют генетический перенос [8]. Обитание бактериофагов установлено и в пресноводных водоёмах, в том числе в одном из крупнейших древних озёр мира - Байкале.
Материалы и методы
Исследования коли-фагов в оз. Байкал и его притоках были начаты нами в 1997 г. [1]. В 2002-2007 гг. впервые с использованием метода трансмиссионной электронной микроскопии были проведены исследования морфологического разнообразия, размерной структуры, общей численности автохтонных бактериофагов во все сезоны года на различных (до 1 200 м) глубинах озера [2; 3]. Отбор проб воды проводился с помощью батометров преимущественно на центральной мониторинговой станции
разреза Листвянка - Танхой на Южном Байкале (51°42' N, 105° E) с поверхности и глубинных горизонтов 25, 250, 1 000 и 1 200 м в стерильные стеклянные флаконы. Бактериофаги осаждали с применением ультрацентрифуг Beckman-L8-55 (Beckman Instruments, США) и Sorvall Discovery-96 SE (Thermo Fisher Scientific, США), время центрифугирования 1,5-2 ч при скорости 100 000 об/мин. Изучение бактериофагов проводили на трансмиссионном электронном микроскопе LE0-906 E (Zeiss, Германия) при ускоряющем напряжении 80 кВ и увеличении 40 000-70 000*. Общую численность бактерий во взятых пробах воды определяли на эпифлуоресцент-ном микроскопе Olympus ВХ51 (Olympus Corporation, Япония) с красителем ДАПИ (Biotium, США). Идентификация исследованных фагов проводилась согласно международной классификации [4].
Результаты и обсуждение
В водах Байкала установлено высокое таксономическое разнообразие автохтонных бактериофагов. Большинство впервые найденных и изученных автохтонных фагов (76 %) относится к отряду Caudovirales (хвостатые фаги), объединяющему в себе в зависимости от размеров и сократимости хвостовых отростков три семейства: Siphoviridae, Podoviridae, Myoviridae. Среди них преобладают (40-59 %) фаги сем. Siphoviridae (морфотипы В!, В2, В3) с длинным несократимым хвостовым отростком. Это фаги с различной формой капсида, размер которого колеблется в пределах 20-254 нм, длина отростка составляет 45-780 нм. Следующим по встречаемости мор-фотипом были икосаэдрические бактериофаги сем. Podoviridae (морфоти-пы Сь С2) (11-32 %), которые имеют гексагональную форму на плоскости. Характерная особенность фагов этого семейства - наличие короткого конусовидного отростка без базальной пластинки, отходящего от одной из вершин многогранной головки. Размер головки 40-73 нм, длина отростка 8-29 нм. Доля бактериофагов сем. Myoviridae (морфотипы Аь А2) составляет 6-25 %. Его представители отличаются сложной структурной организацией сократимого хвостового отростка. Большинство фагов имеют ба-зальную пластинку с разного рода структурами: зубцеобразными, войлочными придатками и шаровидными телами на конце отростка. Бактериофаги этого семейства имеют икосаэдрическую форму головки размером 69-143 нм, длина хвостовых отростков составляет 25-326 нм, длина чехлов - 15-121 нм.
В вириопланктоне оз. Байкал в небольшом количестве встречаются фаги семейств Microviridae, Leviviridae, Inoviridae, у которых отсутствует чётко дифференцированный отросток, характерный для большинства автохтонных вирусных частиц. Они имеют икосаэдрическую форму и малые размеры (36-42 нм) и отличаются от других форм своей однородностью как по размерам, так и по морфологии. Кроме них найдены крупные фаги без хвостового отростка размером 110-160 нм с наличием двух чётко выраженных оболочек.
Особый интерес представляют обнаруженные в Байкале формы бактериофагов, которые отсутствуют в современной международной классификации и не описаны для других водных экосистем. Так, в летний период был найден своеобразный морфотип, который имеет головку в форме юлы. Особенность других фагов заключается в том, что от капсида радиально отходят шиповидные выросты длиной 7 нм. Обнаружены фаги с двумя чётко дифференцированными оболочками и толстым хвостовым выростом, с вытянутой головкой поперёк хвостового отростка в форме молотка. Морфологические исследования вириопланктона поверхностных вод других водных экосистем также указывают на преимущественное распространение фагов отряда СаЫоука1е8.
В 2008-2015 гг. нами проведены исследования таксономического состава и размерной структуры вирусного сообщества нейстона оз. Байкал, находящегося на границе раздела фаз вода - воздух, а также входящего в микробиоценозы биоплёнок, формирующихся на границе фаз вода - геологические породы в природных условиях литорали Байкала. В сообществе нейстона, в отличие от водной толщи, основную часть составляют бесхвостые бактериофаги (65 %), относящиеся к семействам Microviridae, Leviviridae, Tectiviridae. Фаги с укороченными конусовидными хвостовыми отростками сем. Podoviridae составляют около 25 %. Представители семейств Siphoviridae и Myoviridae, отличающиеся морфологией и наличием хвостового отростка и обладающие специализированными терминальными структурами, были немногочисленны - около 10 %. В вирионейстоне в значительном количестве были найдены нитчатые фаги семейства Inoviri-dae, представленные длинными (до 2 000 нм) гибкими и жёсткими прямыми и тонкими изогнутыми нитями. Найдены также бактериофаги, обладающие сходными структурными признаками с вирусами редких семейств Rudiviridae, Fuse11oviridae, которые ранее в озере не регистрировались.
В размерной структуре фагов нейстонной плёнки на границе вода -воздух преобладали мелкие формы с диаметром капсида 30-60 нм (44 %). Фаги размером > 60-80 нм и более 80 нм составляли 28 и 23 % соответственно. Частота встречаемости фагов размером < 30 нм оказалась незначительной - 5 %. Численность бактериофагов в нейстоне варьировала от 0,05 до 0,16 млн частиц/мл.
Изучение морфологического состава и размерной структуры фагов биоплёнок, формирующихся на границе: вода - мрамор, вода - гранит, вода-слюда, вода - кварц, вода - габбро, вода - уртит дало иные результаты. В составе микробного сообщества доминировали фаги сем. Podoviridae (40-50 %), за исключением биоплёнок на границе вода - слюда, где они составляли около 23 %. Это были фаги с диаметром капсида 42-55 нм и длиной хвостового отростка 8-22 нм. На втором месте по встречаемости в биоплёнках (35-45 %) были мелкие фаговые частицы гексагональной формы без отростков размером 30-52 нм, предположительно относящиеся к сем. Microviridae. В небольшом количестве обнаружены бактериофаги семейств Myoviridae и Siphoviridae. Единичными экземплярами представле-
ны оболочечные фаги, а на пластинах мрамора и амфиболита найдены нитчатые фаги сем. Inoviridae.
Размерная структура бактериофагов биоплёнок на горных породах преимущественно (70-85 %) представлена мелкими фаговыми частицами с диаметром капсида 30-60 нм. Размерный класс > 60-80 нм составил 10-25 %, а частота встречаемости частиц размером > 80 нм оказалась незначительной. Общая численность бактериофагов на различных геологических средах изменялась в значительных пределах: 0,03-0,1 млн частиц/см2.
В глубоководной олиготрофной экосистеме Байкала фаги семейства Siphoviridae доминируют по всей водной толще, как это наблюдается и в большинстве других водных экосистем. В нейстонной пленке на границе фаз вода - воздух преобладают бесхвостые бактериофаги семейств Micro-viridae, Leviviridae, Tectiviridae, а в биоплёнках, образованных на границе фаз вода - геологические породы в литорали озера - мелкие с укороченным отростком фаги семейства Podoviridae.
Изучение размерной структуры байкальских бактериофагов, обнаруженных в водной толще, показало, что их размерный спектр представлен пятью классами величин: < 30 нм; 30-60 нм; > 60-80 нм; > 80-100 нм; > 100 нм. Преобладают фаги с размерами 30-80 нм, частота встречаемости которых составляет 25-90 % на всех исследованных глубинах с максимальным значением в поверхностном слое воды. Субдоминантной группой в размерном спектре представлены крупные фаги с размерами > 100 нм с частотой встречаемости до 56 %. Из общего числа изученных бактериофагов только 2-7 % - частицы с размерами < 30 нм, которые преимущественно представлены фагами без хвостового отростка.
Численность свободных фаговых частиц в воде оз. Байкал в различные сезоны года изменялась от 0,01 до 0,58 106 частиц/мл. Наибольшая численность фагов отмечается в весенний и летне-осенний периоды в поверхностном слое воды, минимальное - в зимний период на глубине 1 000 м. Подобная сезонная периодичность в развитии фаговых частиц согласуется с динамикой общей численности бактерий в воде озера. В вертикальном распределении бактериофагов в Байкале отмечена общая закономерность - снижение их количества с глубиной. Однако на глубине 1 200 м наблюдается увеличение численности фагов до 0,03 106 частиц/мл, что может быть сопряжено с особенностями функционирования микробиоценоза придонной зоны озера. Полученные результаты позволили установить прямую связь численности фагов и бактерий на различных глубинах озера: коэффициент корреляции этих показателей в поверхностном слое воды составил 0,42 (p < 0,01), на глубине 25 м - 0,74 (p < 0,001), на глубине 250 м -0,62 (p < 0,01).
Молекулярно-биологические исследования бактериофагов, выделенных из вод озера, позволили выявить уникальность некоторых из них. С использованием методов секвенирования проведён биоинформационный анализ и расшифрован полный геном гигантского фага PaBG из семейства Myoviridae, инфицирующего Pseudomonas aeruginosa. Не обнаружено су-
щественной гомологии его ДНК с ДНК других фагов, для которых известны последовательности геномов. Гигантский фаг PaBG имеет двухцепо-чечную ДНК длиной 258,139 п. н., с G-C-составом 55,82 %, в которых закодированы 308 открытых рамок считывания. Установлено, что 13 генов кодируют структурные компоненты вириона, идентифицированы пять генов, кодирующих белки транспорта РНК. Полученные результаты отражают разнообразие бактериофагов внутри семейства Myoviridae и приближают нас к пониманию роли вирусов в экологии и эволюционных процессах. Геномная последовательность гигантского байкальского фага PaBG зарегистрирована в GenBank (№ KF147891).
Заключение
Проведённые в 2002-2015 гг. в различных биотопах Байкала исследования позволили обнаружить и идентифицировать автохтонные бактериофаги, представляющие собой малоизвестное трофическое звено экосистемы Байкала. Были изучены их таксономическое разнообразие, размерный спектр, закономерности временного и пространственного распределения от поверхности до максимальных глубин. Повсеместное распространение вирусов указывает на активное участие вириопланктона в структуре и функционировании самой древней и глубоководной пресноводной экосистемы мира. На основе полученных результатов разработана схема «микробиаль-ной петли», описывающая функционирование автохтонных организмов вириопланктона в экосистеме Байкала, взаимодействующих со всеми её составными частями. К сожалению, некоторые отечественные исследователи и в настоящее время не учитывают постоянное присутствие автохтонных водных вирусов и их важность для понимания биотических процессов, происходящих в различных водных экосистемах [5]. Результаты вышеописанных исследований ныне применяются для создания коллекции байкальских бактериофагов, некоторые из которых в дальнейшем могут стать объектами для практического использования в медицинских и биотехнологических целях.
Работа выполнена в рамках госзадания VI.55.1.3. № 0345-2014-0004.
Список литературы
1. Дрюккер В. В. Коли-фаги озера Байкал и его притоков / В. В. Дрюккер, А. А. Масленников // Современные проблемы экологии, природопользования и ресурсосбережения Прибайкалья : материалы Всесоюз. науч. конф. - Иркутск, 1998.- С. 279.
2. Дрюккер В. В. Фаги озера Байкал / В. В. Дрюккер, Н. В. Дутова // Микроорганизмы в экосистемах озер, рек и водохранилищ : тез. Междунар. Байк. микро-биол. симп. - Иркутск, 2003.- С. 35.
3. Дрюккер В. В. Изучение морфологического разнообразия бактериофагов озера Байкал / В. В. Дрюккер, Н. В. Дутова // Докл. РАН.- 2006.- Т. 410, № 6. -С. 847-849.
4. Ackermann H. W. Frequency of morphological phage descriptions in 1995 / H. W. Ackermann // J. Arch. Virol. - 1996. - N 141. - P. 209-218.
5. Boulion V. V. The biotic balance in Lake Baikal: Comparison of the results of modeling and observations / V. V. Boulion // Dokl. Biol. Sci. - 2016. - Vol. 468. -P. 142-145.
6. High abundance of viruses found in aquatic environments / O. Bergh [et al.] // Nature. - 1989. - N 340. - P. 467-468.
7. Viruses as partners in spring bloom microbial trophodynamics / G. Bratback [et al.] // J. Appl. Environ. Microbiol. - 1990. - N 56. - P. 1400-1405.
8. Wommack K. E. Virioplankton: Viruses in Aquatic Ecosystems / K. E. Wom-mack, R. R. Colwell // Microbiology and molecular Biology Reviews. - 2000. - Vol. 64, N 1. - P. 69-114.
Autochthonous Bacteriophages in the Ecosystem of Lake Baikal - the Deepest Ancient Lake in World
V. V. Drucker
Limnological Institute SB RAS, Irkutsk
Abstract. We performed studies of morphological diversity, abundance, size spectrum of autochtonous bacteriophages using a modern method of transmission electronic microscopy isolated from different biotops of Lake Baikal. Molecular biological studies of Baikalian phages revealed a unique nature of some of them. We performed as well bioin-formational analysis and deciphered the complete genome of a giant phage from the family Myoviridae, contaminating Pseudomonas aeruginosa - PaBG using modern new generation sequence methods (MiSeq, Illumina).
Keywords: autochthonous bacteriophages, morphological diversity, abundance, size range, genome, neuston, biofilms, Lake Baikal.
Дрюккер Валентин Валерианович доктор биологических наук, профессор, главный научный сотрудник Лимнологический институт СО РАН 664033, г. Иркутск, ул. Улан-Баторская, 3 тел. (3952) 42-54-15 e-mail: drucker@lin.irk.ru
Drucker Valentin Valerianovich Doctor of Sciences (Biology), Professor, Principal Research Scientist Limnological Institute SB RAS 3, Ulan-Batorskaya st., Irkutsk, 664033 tel.: (3952) 42-54-15 e-mail: drucker@lin.irk.ru
