CC BY
112
Новости клеточных технологий
из биоптатов головного мозга неврологических пациентов. Методика была испытана на 13 больных, результаты опубликованы в недавнем номере журнала Neurosurgery. Метод выделения НСК из биоптатов головного мозга человека и получения из них нейронов был разработан группой 2 года назад [7]. Цели настоящего исследования - показать выполнимость, безопасность и низкую инвазивность процедуры на пациентах, а также возможность выделения и экспансии ex vivo достаточного количества НСК.
Микробиоптаты получали эндоскопически из боковых желудочков головного мозга во время рутинного нейрохирургического вмешательства по поводу гидроцефалии. Осложнений процедуры, включая «новый» неврологический дефицит, не наблюдали. Клеточная суспензия, выделенная из биоптатов механически-ферментативным методом, помещалась в дифференцировочную среду. Клетки всех био-птатов формировали нейросферы в течение нескольких дней и создавали новые нейросферы после диссоциации и пассирования в течение 3-7 недель. Стволовые клетки нейросфер клонировались [около 7% всех клеток нейросферы) и были способны дать новую нейросферу в 2 пассажах. То есть, если считать, что одна нейросфера содержит в среднем 300 клеток, и из одной клетки можно получить 1 нейросферу, то в двух пассажах можно выделить 90 000 клеток из одной исходной. В конце первой недели культивирования 78% клеток несли глиальные маркёры и 22% - нейрональные.
Функциональная зрелость нейронов, подтверждённая методом патч-кламп, наблюдалась через 3 недели культивирования.
Таким образом, исследователи предложили новый метод выделения ауто-НСК из головного мозга пациента, показали его безопасность и выполнимость. Важным моментом является возможность производить экспансию in vitro собственных нейрональных прогениторов с получением большого количества функционально зрелых нейронов. Для выращивания нейросфер использовали протокол Johansson [8], предложенный в 1999 году. Общее количество функциональных нейрональных клеток, которое позволяет получать метод, можно считать достаточным, поскольку ранее было показано, что, например, для замещения функции при болезни Паркинсона может быть достаточно всего лишь 80 000 полноценных нейронов [1]. Локализация НСК в субвентрикулярной зоне головного мозга человека позволяет безопасно забирать биоптат через стенку желудочка, поскольку рядом нет никаких функционально значимых структур, в отличие от другого сайта НСК - гиппокампа и зубчатой извилины.
Чёткая анатомическая локализация сайтов НСК в головном мозге взрослого человека, безопасность процедуры получения биоптата и возможность «наращивания» нейрональных клеток ex vivo позволят развивать этот метод в будущем и занять передовые позиции в клинической заместительной нейротрансплантологии.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Bjorklund A., Lindvall O. Cell replacement therapies for central nervous system disorders. Nat. Neurosci. 2000; 3: 537-44.
2. Huang H., Chen L., Wang H. et al. Influence of patients' age on functional recovery after transplantation of olfactory ensheathing cells into injured spinal cord injury. Chin. Med. J. [Engl) 2003; 116: 1488-91.
3. Winkler C., Kirik D., Bjorklund A. Cell transplantation in Parkinson's disease: how can we make it work? Trends Neurosci. 2005; 28: 86.
4. Palmer T.D., Schwartz P.H., Taupin P. et al. Cell culture. Progenitor cells from human brain after death. Nature 2001; 411: 42-3.
5. Klassen H., Ziaeian B., Kirov II. et al. Isolation of retinal progenitor cells from post-mortem human tissue and comparison with autologous brain progenitors. J. Neurosci. Res. 2004; 77: 334-43.
6. Schwartz P.H., Bryant P.J., Fuja T.J. et al. Isolation and characterization of neural progenitor cells from post-mortem human cortex. J. Neurosci. Res. 2003; 74: 838-51.
7. Westerlund U., Moe M.C., Varghese M. et al. Stem cells from the adult human brain develop into functional neurons in culture. Exp. Cell Res. 2003; 289: 378-83.
8. Johansson C.B., Svensson M., Wallstedt L. et al. Neural stem cells in the adult human brain. Exp. Cell Res. 1999; 253:733-6.
Подготовил A.B. Берсенев По материалам Neurosurgery 2005; 57: 779-84
Аутотрансплантация обкладочных клеток обонятельного анализатора для лечения травмы спинного мозга -австралийское исследование
В настоящее время в нескольких странах мира запущены сразу несколько клинических испытаний различных методов клеточной трансплантации для лечения травмы спинного мозга (ТСМ) [1-3]. Метод трансплантации обкладочных клеток обонятельного анализатора или обкладочных обонятельных клеток [ООК, olfactory ensheathing cells - OEC) при ТСМ, продемонстрировавший эффективность в нескольких десятках экспериментальных протоколов, в настоящее время проходит I-II фазу клинических испытаний в Китае [6], Португалии [5, 7], Австралии [4] и России [8]. По неофициальным данным, этой процедуре подверглись около 500 человек. Большая часть из них лечилась в Китае клетками, выделенными из обонятельной луковицы абортированных плодов человека [6]. Однако во всех этих исследованиях, группы пациентов значительно различались по возрасту, времени и локализации травмы, не были рандомизированы. Кроме
того, нет данных по фенотипической характеристике клеточного материала [6]. Результаты некоторых пилотных испытаний не публиковались и не обсуждались [7, 8]. Таким образом, до сих пор нельзя однозначно говорить о клинической эффективности данного метода.
OEC обонятельной луковицы или «нейроэпителия» обонятельной области слизистой оболочки носа имеют глиальную природу и способны пролиферировать в культуре. Многочисленные эксперименты показали, что эти клетки, подобно шванновским, через неясные механизмы способны стимулировать аксональную регенерацию и вызывать ремиелини-зацию [4] в области повреждения спинного мозга.
В недавнем номере журнала Brain были опубликованы результаты I фазы слепого, контролируемого клинического испытания метода аутотрансплантации OEC пациентам с ТСМ, проходившего в Австралии. Перед началом клинических
Новости клеточных технологий
испытаний авторами было показана возможность выделения необходимого количества OEC [10] из слизистой оболочки носа пациентов, без нарушения обоняния [9]. Более 50 опубликованных экспериментальных протоколов и собственный опыт группы послужили основанием к началу клинических испытаний. Целью исследования явилась оценка осуществимости метода и его безопасности в течение года после трансплантации.
Из 600 рассматриваемых запросов в исследование включили 21 человека, из которых после тщательного отбора выполнили трансплантации троим. Ещё 3 пациента вошли в контрольную группу. Основными включающими критериями стали: повреждение спинного мозга травматического генеза с полным функциональным перерывом, уровень повреждения T4-T10, неврологически стабильное состояние ASIA [American Spinal Injury Association) класс А и адекватный психо-социальный статус пациентов [для возможности долговременного наблюдения).
OEC выделяли по описанному ранее протоколу из био-птатов обонятельной области слизистой оболочки носа пациентов и культивировали в течение 4-10 недель перед трансплантацией [9, 10]. Через 1-2 недели OEC приобретали типичный «глиальный» фенотип - GFAP+ [> 95%), S100+/p75+ [76-88%) и не экспрессировали маркёр шван-
Трехмерная реконструкция начального отдела обонятельного анализатора:
1 — нейросенсорные клетки с ресничками;
2 — поддерживающий эпителиоцит; 3 — базальные клетки; 4 - olfactory ensheathing cells; 5 — lamina cribrosa решетчатой кости; 6 — слизь
По Greep R.O., Weiss L. (1973), с изменениями
новских клеток - HNK-1 [что исключало контаминацию ими культуры).
Клетки вводили во время нейрохирургического вмешательства в несколько точек по разным траекториям в место повреждения и вокруг него. Общее количество вводимых клеток составляло 1,12, 2,24 и 3,28 миллионов соответственно. Для точного дозированного введения применяли микрохирургическую технику и специально разработанный аппарат, состоящий из инъектора и микроманипулятора.
В результате исследования было показано, что метод не несёт в себе никаких побочных эффектов и осложнений как непосредственно во время трансплантации, так и в ближайший и отдалённый послеоперационный период. Это было подтверждено как клинически, так и с использованием магнитно-резонансной томографии. Время наблюдения пока составило 1 год. Пациенты будут находиться под наблюдением до 3 лет. Клиническую эффективность метода не оценивали.
Это исследование показывает современный подход к проекту клинического испытания метода клеточной трансплантации в рамках доказательной медицины. Тщательный отбор пациентов и разработка включающих и исключающих критериев, согласно международным рекомендациям к испытаниям при ТСМ [11], позволяют достоверно оценить эффект метода и «стандартизировать» процедуру. Авторы подчёркивают, что тщательная разработка методики забора клеточного материала, подготовки трансплантата и его пересадки позволила избежать таких возможных осложнений как потеря обоняния, посттравматические кисты и сирингомиелия.
Однако, применение ОЕС остаётся дискутабельной темой в лечении ТСМ. Это связано с тем, что до сих пор нет единого мнения по идентификации и маркированию этих клеток. Проблема усугубляется ещё и тем, что ряд исследовательских групп заявляет о наличии другой популяции - мультипо-тентных стволовых клеток в обонятельной области слизистой оболочки носа человека [14], в дополнение к ОЕС, которые не являются стволовыми. В этой работе было показано, что все клетки не имели HNK-1, однако это не исключает контаминацию культуры шванновскими клетками на 100%, поскольку не все они несут этот маркёр. Кроме того, в работе Такатл было показано, что трансплантация шван-новских клеток при ТСМ значительно эффективней, чем трансплантация ОЕС [12]. В одной из недавних работ [13], не выявившей эффективности метода при ТСМ, дискутируется целесообразность трансплантации ОЕС больным людям и подчёркивается, что экспериментальных исследований выполнено явно недостаточно, чтобы перенести технологию в клинику. Эта дискуссия ещё раз показывает, что для оценки клинической эффективности метода необходима разработка и принятие единых протоколов испытаний, включающих характеристику клеточного материала и критерии отбора пациентов для трансплантации. Тем не менее, II фаза испытаний, начавшаяся в настоящее время в ряде центров, призвана ответить на вопрос о клинической эффективности метода и целесообразности продолжения внедрения технологии.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Park H.C., Shim Y.S., Ha Y. et al. Treatment of complete spinal cord injury patients by autologous bone marrow cell transplantation and administration of granulocyte-macrophage colony stimulating factor. Tissue Eng. 2005; 11: 913-22 .
2. Knoller N., Auerbach G., Fulga V. et al. Clinical experience using incubated autologous macrophages as a treatment for complete spinal cord injury: phase I study results. J. Neurosurg. Spine 2005; 3: 173-81.
3. Guest J., Herrera L.P., Qian T. Rapid recovery of segmental neurological function in a tetraplegic patient following transplantation of fetal olfactory bulb-derived cells. Spinal Cord AOP, 6 September 2005; doi:10.1038/ sj.sc.3101820.
4. Reie P.J. Cellular transplantation strategies for spinal cord injury and translational neurobiology. NeuroRx. 2004; 1: 424-51.
5. Senior K. Olfactory ensheathing cells to be used in spinal-cord repair trial. Lancet Neurol. 2002; 1: 269.
6. Huang H., Chen L., Wang H. et al. Influence of patients' age on functional recovery after transplantation of olfactory ensheathing cells into injured spinal cord injury. Chin. Med. J. [Engl) 2003; 116: 1488-91.
7. Laurance Johnston. Olfactory tissue transplantation for spinal cord injury. http://www.healingtherapies.info/OlfactoryTissue1.htm
8. Брюховецкий А.С., Менткевич Г.Л., Зайцев А.Ю. и др. Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий. http://www.neurovita.ru/reports/rus_report01_1.html.
Новости клеточных технологий
9. Feron F., Perry C., McGrath J.J., Mackay-Sim A. New techniques for biopsy and culture of human olfactory epithelial neurons. Arch. Otolaryngol. Head. Neck. Surg. 1998; 124: 861-6.
10. Bianco J.I., Perry C., Harkin D.G. et al. Neurotrophin-3 promotes purification and proliferation of olfactory ensheathing cells from human nose. Glia 2004; 45: 111-23.
11. Steeves J., Fawcett J., Tuszynski M. Report of international clinical trials workshop on spinal cord injury February 20-21, 2004, Vancouver, Canada. Spinal Cord 2004; 42: 591-7.
12. Takami T., Oudega M., Bates M.L. et al. Schwann cell but not olfactory ensheathing glia transplants improve hindlimb locomotor performance in the moderately contused adult rat thoracic spinal cord. J. Neurosci. 2002; 22: 6670-81.
13. Collazos-Castro J.E., Muneton-Gomez V.C., Nieto-Sampedro M. Olfactory glia transplantation into cervical spinal cord contusion injuries. J. Neurosurg. Spine 2005; 3(4): 308-17.
14. Murrell W., Feron F., Wetzig A. et al. Multipotent stem cells from adult olfactory mucosa. Dev. Dyn. 2005; 233(2): 496-515.
Подготовил A.B. Берсенев По материалам Brain 2005; 128(Pt 12): 2951-60
КЛОНИРОВАНИЕ
Сравнительное геномное исследование клонированных и нормальных эмбрионов
Технология переноса соматического ядра в энуклеиро-ванный овоцит имеет большое значение для биомедицины и сельского хозяйства, так как это уникальный способ получения генетически идентичных родительским клеток или животное-клон. Однако, все ис^едовательские группы отмечают крайне низкую частоту рождения жизнеспособного животного из такого эмбриона [nuclear transfer, NT-эмбрион). Как правило, еще при раннем эмбриональном развитии наблюдаются значительные нарушения в ткане- и органогенезе, несовместимые с жизнью. И хотя уже получено немало клонированных животных различных видов, полностью контролировать процесс и направленно увеличивать его эффективность пока не удается. Одной из основных причин низкой эффективности технологии считается нарушение эпигенетического контроля работы генов, вследствие этого - неправильное развитие эмбриона. Тем не менее, репрограммирование соматического ядра при его переносе достоверно показано, и удачные случаи клонирования доказывают изменения в генной активности и «снятие» эпигеномной информации.
Недавно была проведена работа по сравнению экспрессии генов в нескольких NT-эмбрионах коров на стадии бластоцисты, с соматическими клетками - донорами ядер и с нормально оплодотворенными бластоцистами. Анализ более 5000 тысяч генов, проведенный при помощи микрочипов, показал, что экспрессия генов в NT-эмбрионах сильно отличается от соматических клеток-доноров и минимально отличается от нормальных бластоцист. Это доказывает, что перенесенные в ооциты ядра претерпевают значительное перепрограммирование на стадии бластоцисты, и проблемы, возникающие при развитии тканей и органов из NT-эмбрионов, возможно, связаны с ошибками этого феномена, значение которых увеличивается в процессе органогенеза.
При сравнении картины транскрипции удалось выявить 29 % генов, по-разному экспрессирующихся в NT-эмбрионах и
соматических клетках-донорах ядер. Эти гены относятся к следующим сигнальным путям: окислительное фосфорили-рование, клеточный цикл, синтез АТФ, цикл трикарбоновых кислот, метаболизм пуринов, пирувата, гликолиз и глюконе-огенез, а также апоптоз. Исследователи проанализировали в NT-эмбрионах 94 гена, которые экспрессируются в этих клетках на высоком уровне. Из них 23 гена значительно сильнее экспрессировались в исследуемых образцах, по сравнению с донорными соматическими клетками. Среди них - ранее описанные ODC1, PECAM1, CCNE1 - гены, специфичные для эмбриональных стволовых клеток [ЭСК). Таким образом, принимая во внимание различия в уровне экспрессии описанных генов, можно предположить, что ядро соматической клетки претерпевает значительное перепрограммирование после переноса в яйцеклетку.
Профиль экспрессии генов был сравнен у NT-эмбрионов и эмбрионов, полученных вследствие искусственной инсеминации [artificial insemination, AI-эмбрионы) и искусственного оплодотворения [in vitro fertilization, IVF-эмбрионы). Оказалось, что активность генов в NT-эмбрионах более схожа с таковой в AI-эмбрионах, тогда как различия между NT-и IVF-эмбрионами более значительные. Интересно, что при сравнении индивидуальных эмбрионов внутри группы более однородными являются NT-эмбрионы, а IVF-эмбрионы -наиболее разнородные. Схожая картина генной экспрессии у NT-эмбрионов также подтверждает механизм перепрограммирования ядра. Различия между IVF-эмбрионами могли возникнуть вследствие культивирования или генетических различий матерей-доноров яйцеклеток.
Несмотря на схожую генную экспрессию между NT- и AI-эмбрионами, 50 генов [около 1 %) отличаются по уровню транскрипции. Среди них 8 экспрессируются только в NT-эмбрионах, а 17 - только в AI-эмбрионах. Возможно, эти гены связаны с различиями развития in vitro и in vivo. Для некоторых из этих генов описаны функции, например, TFAP2A необходим для формирования нервной трубки и
