CC BY
37Фізика живого, Т. 1?, Nol, 2009. С.1б9-1?1.
© Гарманчук Л.В., Перепелиціна О.М., Непийвода Х.Д., Остапченко Л.І., Сидоренко М.В.
УДК 577.3
АУТОКРИННИЙ МЕХАНІЗМ ПРОГРЕСІЇ ПУХЛИННИХ КЛІТИН В 2-D ТА 3-D КУЛЬТУРАХ
Гарманчук Л.В1., Перепелиціна О.М2., Непийвода Х.Д.1, Остапченко Л.І1., Сидоренко М.В.2
1 Київський національний університет імені Тараса Шевченка Київ, Україна 2Відділення біотехнічних проблем діагностики ІПКК НАН України, Київ, Україна
Надійшла до редакції 26.06.2009
Одними із виражених чинників прогресії пухлинних клітин є фактори росту, які опосередковують свій мітогенний вплив специфічними рецепторами, внутріклітинний домен яких є тирозинкіназа. Ріст пухлинних клітин в трьохвимірному просторі in vitro адекватно моделює процес формування мікрометастазів in vivo. За умов культивування клітин MCF-7 в безсивороткових умовах досліджували рівень секреції ЕФР-подібних полі пептидів клітинами, що знаходились в 2D та 3D рості. Виявлено, що рівень продукції ЕФР-подібних пептидів клітинами моношарової культури в 2,5 рази (p<0,05) вище, ніж аналогічний показник в сфероїдній культурі.
Ключові слова: ЕФР-подібні поліпептиди, аутокринна продукція, клітини MCF-7.
ВСТУП
Родина поліпептидів, подібних епідермальному фактору росту, є чинниками проліферації клітин різного генезу як в нормі, так і при злоякісній трансформації клітин. Ці поліпептиди проявлять мітогений ефект опосередковано специфічними рецепторами (Р-ЕФР), внутріклітинний домен яких є тирозинкіназа. Рівень експресії рецептору до ЕФР або його структурних та функціональних аналогів -білків родини c-erbB корелює зі злоякісністю пухлинних клітин [1], а також розглядається як об’єкт таргетної терапії [2, З]. Виявлено також, що метастатичний потенціал пухлин та їхні інвазивні властивості також пов’язані прямо або опосередковано через ряд молекул з рівнем фосфорилюючої/ аутофосфорилюючої активності Р-ЕФР [4]. З іншого боку, в злоякісних клітинах виявлено підсилення аутокринної секреції ЕФР-подібних факторів росту, які є стимуляторами проліферації, особливо в умовах дефіциту поживних субстратів. Моделлю формування мікропухлин в системі in vitro є сфероїдний ріст, за якого виявлено пряму залежність між кількістю сфероїдів утворених in vitro, та кінетикою росту пухлин in vivo. Також встановлено, що здатність клітин утворювати З-D культуру прямо корелює зі злоякісністю вихідної пухлини та характеризує її метастатичну активність, що може бути пов’язано з механізмом аутокринної та паракринної регуляції факторами росту та їх специфічними рецепторами функціонування клітин [5]. Рак молочної залози відноситься до найбільш агресивної патології, механізми прогресії якої прямо корелюють із
активацією родини ЕФР-подібних цитокінів та їх специфічних рецепторів. Тому, мета нашого дослідження полягала в оцінці рівня продукції ЕФР-подібних поліпептидів в середовище культивування клітин MCF-7 (рак молочної залози) в умовах З-D росту.
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
Клітинні лінії та моделі. Використано лінія клітин MCF-7 (рак молочної залози). Моделювання 2-D та З-D росту клітин в культурі проводили як описано [в]. Для дослідження рівня продукції ЕФР-подібних пептидів клітинами в двух системах росту використовували кондиційоване середовище (К-середовище) культивування клітин, яке отримували слідуючим чином. Клітини, що росли в 2-D культурах після досягнення практично 100% моношару та З-D культурах після виходу клітин в «стаціонарну» фазу росту, поміщали в безсивороткове середовище, після чого інкубували протягом 2 діб. Потім К-середовище відбирали та з використанням стандартних підходів та міні-колонок Sep-Pack C1S, очищали ЕФР-подібні пептиди як описано нами раніше [7]. В якості стандарту молекулярної маси та біологічної активності використовували ЕФР із підщелепних слинних залоз мишей.
РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
В результаті проведеного дослідження було хроматографічно очищено та ідентифіковано ЕФР-подібні пептиди із кондиційованого середовища клітин MCF-7 в системі 2-D та З-D росту.
Гарманчук Л.В., Перепелиціна О.М., Непийвода Х.Д., Остапченко Л.І., Сидоренко М.В.
1 2 З
Рис. 1. Електрофореграма ЕФР-подібних білків після хроматографічної очистки із К-середовищ 2-Б та 3-Б (2, 3, треки, відповідно) культур. Трек 1- ЕФР стандарт.
При ідентифікації молекулярної маси, очищеного пептиду, було виявлено, що вона становить близько 6 кДа, і що може належати ТФР-а - структурному та функціональному аналогу ЕФР. Для підтвердження
вищезазначеного припущення було проведене дослідження мітогенної активності отриманого пептиду. Виявлено стимулюючий ефект пептиду в широкому діапазоні концентрацій (0,05-100 нМ) по відношенню до клітин МСБ-7, який проявлявся у підсиленні проліферативної активності клітин на 31,1±10,3% (для ЕФР стандарту - цей показник дорівнює 62,3±16,3 %), порівняно з контролем. Найбільша стимулююча дія для поліпептиду виділеного з К-середовища МСБ-7 знаходилась в діапазоні концентрацій (1,6 - 12,5 нМ), а для ЕФР (0,05 -0,8 нМ) (рис.2).
Порівняння мітогеної активності
концентрація,нМ
—«—ЕФР-стандарт —■—ЕФР-подібний пептид —а—контроль
Рис. 2. Скринінг мітогенної активності ЕФР-подібних пептидів, очищених із К-середовища клітин МСР-7
Таблиця 1.
Концентрація ЕФР-подібних пептидів, очищених із К- середовища __________________культивування клітин МСБ-7.____________________
2-Б 3-Б
Концентрація ЕФР-подібного пептиду 17,9 нг±1,3/ 106 кл 7,2 нг±1,1/ 106 кл
Отримані результати можуть вказувати, з одного боку, на більший ЕФР-подібний секреторний потенціал моношарової культури клітин МСБ-7, а з іншого, на більш високу реактивність сфероїдної культури [8], де активніше відбувається проліферація в безсивороткових умовах, і, відповідно, аутокринно продуковані фактори із середовища мікрооточення більш
інтенсивно в порівнянні з моношаровою культурою включаються в мітотичний цикл. Так, за умов сфероїдного росту в одній пухлинній клітині може одночасно активуватись декілька аутокринних петель, гетерогенних за типом лігандів та їх рецепторів. ЕФР - подібні цитокіни також можуть стимулювати проліферативну активність трансформованих клітин по юкстакринному і/або
АУТОКРИННИЙ МЕХАНІЗМ ПРОГРЕСІЇ ПУХЛИННИХ КЛІТИН В 2-D ТА 3-D КУЛЬТУРАХ
інтракринному механізмах [9]. З цієї точки зору, клітини в сфероїдній культурі володіють вищою ступінню міжклітинної комунікації і, відповідно, можуть інтенсивніше використовувати аутокринно та паракринно продуковані фактори мікрооточення. Більш довготривале культивування MCF-7 в сфероїдній культурі виявляє також такий феномен як поява одиночних клітин в сузпензії, які можуть набувати здатності до міграції. Насьогодні також відомо про важливу роль ЕФР-подібних поліпептидів та їх рецепторів в міграції клітин. Таким чином, отримані результати щодо вищих показників секреції ЕФР-подібних пептидів в умовах 2-D росту можуть свідчити за нижчу реактивність 2-х вимірної культури пухлинних клітин в порівнянні з 3-х вимірною.
Література
1. Yarden Y. The EGFR family and its ligands in human
cancer: signalling mechanisms and therapeutic
opportunities // European J of Cancer. - 2001- Vol.37.
- P.3-8.
2. Garmanchuk L.V., Perepelytsina O.M., Cheshuk V.E., Sydorenko M.V. EGFR expression and dimerization in the breast cancer resected postoperation tissue can be a negative prognostic factor // THE BREAST- 2009. -Vol.18 - P.28
3. Normanno N, De Luca A, Bianco C et al. Epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling in cancer // Gene.-2006. - Vo1.366, N1 - P^-^.
4. Chan K.C., Knox W.F., Gee J.M., et al Effect of epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibition on epithelial proliferation in normal and premalignant breast.// Cancer Res.- 2002 - Vo1.62, N1- P.122-12S.
5. Kim J.B., Stein R., O'Hare M.J. Three-dimensional in vitro tissue culture models of breast cancer-- a review // Breast Cancer Res Treat.- 2004 - Vol.S5, N3 - P.2S1-291.
в. Perepelitsina O.M., Garmanchuk L.V., Sydorenko M.V., Ostapchenko L.I. Reactivity and sensibility of breast carcinoma (MCF-7) in coculture depends on architecture of cells model // Physics of the alive. - 200S. - Vo1.16, N 2 - P. 105-111.
7. Roberts A.B., Anzano M.N., Lamb L.C. et al. Isolation from murine sarcoma cells of novel transforming growth factors potentiated by EGF // Nature - 19S2 - Vol.295 -P.417-419.
S. Гарманчук Л.В., Перепелиціна О.М., Сидоренко М.В. Спосіб тестування біологічно активних сполук на придатність як лікарських засобів // Патент на корисну модель-№З50З7 від 26.0S.09.
9. Richter A., Drummond D.R., MacGarvie J., Puddicombe S.M., Chamberlin S.G., Davies D.E.. Contribution of the transforming growth factor a B-loop B-Sheet to binding and activation of the epidermal growth factor receptor // J. Biol. Chem. - 1995 - Vol. 270.
- P.1612-1616.
АУТОКРИННЫЙ МЕХАНИЗМ ПРОГРЕСИИ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК В 2-D И 3-D КУЛЬТУРАХ Гарманчук Л.В., Перепелицына Е.М., Непыйвода К.Д., Остапченко Л.И., Сидоренко М.В.
Одними из выраженных индукторов прогресии опухолевых клеток являются факторы роста, опосредующие свое митогенное влияние специфическими рецепторами с тирозинкиназной активностью. Рост опухолевых клеток в 3-D пространстве in vitro адекватно моделирует процесс формирования микрометастазов in vivo. В условиях культивирования клеток MCF-7 в безсывороточной среде исследовали уровень продукции ЭФР-подобных полипептидов клетками, растущими в 2-D и 3-D культурах. Обнаружено, что уровень продукции ЭФР-подобных пептидов клетками монослойной культуры в 2,5 раза (p<0,05) выше, чем аналогичный показатель в сфероидной культуре.
Ключевые слова: ЭФР-подобные полипептиды, аутокринная продукция, клетки MCF-7.
AUTOCRINE MECHANISM OF THE PROGRESSION TUMOR CELLS IN THE 2-D AND 3-D GROWTH Garmanchuk L.V., Perepelitsyna E.M., Nepiyvoda Kh,D., Ostapchenko L.I., Sydorenko M. V.
Overproduction of growth factors is essential cause of tumor cells progression. Growth Factors realize its mitogen influence through specific receptors with intrinsic intracellular protein-tyrosine kinase activity. Growth of tumor cells in 3-dimentional space in vitro modulates process of formation micro-metastases in vivo exactly. In research was investigated level of EGF-like peptides secretion in unfed culture, in conditions of 2-D and 3-D growth. It was discovered that level of production EGF-like peptides was higher in 2,5 times in monolayer culture as in spheroid culture.
Key words: EGF-like polypeptides, autocrine production, MCF-7 cells.
