CC BY
85
УДК 616. 248 - 053. 2 - 07 - 097 : 577. 123. 8
АУТОАНТИТЕЛА К НАТИВНОЙ ДНК ПРИ АТОПИЧЕСКОЙ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЕ У ДЕТЕЙ
Р.А. Курбанов, З.И. Абрамова, В.Н. Цибулькина, Г.М. Зайнетдинова
Кафедра биохимии (зав. - проф. Д.Г. Ишмухаметова) Казанского государственного университета, кафедра клинической иммунологии и аллергологии (зав. - проф. В.Н. Цибулькина) Казанского государственного медицинского университета
Аутоиммунные реакции при бронхиальной астме развиваются при тяжелом ее течении, и в этом случае синтезируются антитела (противоядерные, противолегоч-ные, к гладкой мускулатуре легких и др.) [4]. Мы поставили цель - исследовать уровень аутоиммунного ответа на примере изменения количества аутоантител - IgG к нативной ДНК (ААТ-IgG к нДНК) в крови у детей с атопической бронхиальной астмой (АБА) в критические возрастные периоды.
Методом иммуноферментного анализа (ИФА) были исследованы сыворотки крови 193 подростков с диагнозом "атопичес-кая бронхиальная астма", предоставленные аллергологическим отделением ДРКБ. Контролем служили результаты 21 относительно здорового подростка призывного возраста 15-17 лет.
Под наблюдением находились 193 ребенка в возрасте от 5 до 17 лет (мальчиков - 133, девочек - 60).
Бронхиальная астма характеризовалась как атопическая форма, течение персисти-рующее, легкая, средняя или тяжелая степени тяжести. Диагноз ставился на основании данных аллергологического анамнеза, положительных результатов кожного тестирования, положительного ответа в провокационных ингаляционных пробах, повышенного уровня общего IgE в сыворотке крови и по оценке показателей функции внешнего дыхания.
Нуклеазную активность определяли по способности антител гидролизовать плаз-мидную ДНК рБИ 322 [6].
Математический анализ полученных результатов проводился с использованием пакета программ "Excel (2003)". Сравнение вариационных рядов осуществлялось с помощью непараметрического критерия Крускала-Уоллиса и T-критерия Манна-Уитни. Достоверность различия частоты встречаемости признака определяли по точечному методу Фишера. Корреляционный анализ выполнялся методом ранговой корреляции Спирмена-г5 [2].
Для сравнительной характеристики двух выборок (данные ИФА) мы оценивали закономерность варьирования индивидуальных показателей ААТ-^О к нДНК у больных с АБА и у здоровых лиц с применением коэффициентов асимметрии (Д5) и эксцесса (Ех). Если Л5 и Ех превосходят критические точки для разных уровней значимости, содержащиеся в табличных данных, гипотеза о нормальности распределения должна быть отвергнута [2]. Поскольку медианы (Ме) отличались от средних (рис.1Б), а выборочные Л5 и Ех, превышали табличные значения (табл. 1), то это означало, что варьирование индивидуальных показателей ААТ-^О к нДНК проявляет выраженную асимметрию и, следовательно, не подчиняется закону нормального распределения (рис.1А) [2]. Это
Таблица 1
Характеристика статистических параметров*
Статистические параметры ААТ к ДНК
больные АБА здоровые
Число измерений 193 21
Значение Л5 1,894 0,901
Значение Ех 4,497 -0,569
Характер распре- правосторонний, правосторонний,
деления островершинный плосковершинный
* Табличные данные: на уровне значимости (р = 0,05) критические значения Л5 для выборок аналогичного объема близки соответственно к 0,208 и 0,711, критические значения Ех равны 0,823 (при п=193) и 0,877 (при п=21).
делает некорректным использование для характеристики выборки таких статистических параметров, как среднее и стандартные отклонения. Поэтому в дальнейшей работе использовались только структурные характеристики (Ме, перцентили), т.е. данные в этом случае представлены как Ме и интерперцентильный размах.
На рис.1Б представлены 95%-ные доверительные интервалы для выборочных Ме. Статистически значимыми счи-
Степени тяжести АБА
Степени тяжести Число подростков (абс./%) Ме Среднее (Хср)
Легкая 78/40,4 0,11 0,14
Средняя 45/23,3 0,13 0,17
Тяжелая 70/36,3 0,17 0,21
Б
Рис. 1. Гистограмма распределения уровней ААТ-]^С к нДНК (-Ме) у обследованного контингента по тяжести общей выборки (А) и соотношение показателей Ме и среднего данной выборки (Б).
(57,15%) человек, от 0,1 до 0,2 у 6 (28,57%) и от 0,2 до 0,25 у 3 (14,28%), т.е. высокое содержание ААТ-^О к нДНК в крови было характерно только для детей с АБА.
Анализ результатов иммунологического обследования смешанной группы детей в возрасте от одного года до 15 лет показал нивелирование отклонений средних показателей по сравнению с данными здоровых доноров [1]. Есть сведения, что у детей с АБА в разных возрастных группах комплекс изменений иммунологических показателей и их выраженность относительно нормативных в соответствующей возрастной группе имеют различия [3], поэтому мы определяли уровни ААТ-^О к нДНК у девочек и мальчиков критических возрастных периодов.
Средние уровни ААТ-^О к нДНК (по Ме) у девочек и мальчиков различаются в легкой стадии - соответственно 0,10 и 0,12, в средней - 0,10 и 0,16, в тяжелой -0,20 и 0,15.
Для более полной характеристики распределения выборки индивидуальных показателей ААТ-^О к нДНК у подростков разного пола использованы Ме, 25 и 75-й перцентили (50%-ный доверительный интервал), между которыми расположено 50% значений ААТ-^О к нДНК.
Достоверной разницы (р = 0,57) в содержании ААТ-^О к нДНК в сыворотке у девочек (Ме = 0,14 отн. ед.; 25-й пер-центиль = 0,10 отн. ед.; 75-й перцентиль =
Число детей
Рис.2. Содержание ААТ-]^С к нДНК в сыворотке периферической крови у детей с АБА школьного возраста и у относительно здоровых лиц призывного возраста.
тали различия при значениях двустороннего р < 0,05.
Сведения об уровнях ААТ-^О к нДНК и частоте встречаемости в сыворотке крови обследованных представлены на рис. 2. Обращает на себя внимание разброс индивидуальных показателей у больных с АБА от 0,03 до 0,70 отн. ед., среди относительных здоровых - от 0,02 до 0,24 отн. ед. Причем у 57 (29,5%) обследованных уровень ААТ-^О к нДНК варьировал от 0,02 до 0,1, у 86 (44,56%) - от 0,1 до 0,2, у 25 (12,95%) - от 0,2 до 0,3 и у 25 (12,95%) -от 0,3 до 0,7 отн.ед. В группе относительно здоровых лиц содержание ААТ к нДНК колебалось от 0,03 до 0,1 отн.ед. у 12
Таблица 2
Влияние тяжести АБА на уровни ААТ-!^ О к нДНК
Степени тяжести АБА Число детей Ме р
мальчики девочки мальчики девочки
Легкая 56 22 0,12 0,10 0,30
Средняя 32 13 0,16 0,10 0,03
Тяжелая 45 25 0,14 0,20 0,05
Таблица 3
Сравнение степени достоверности (р) различий в уровне ААТ-!^О к нДНК из сыворотки подростков в зависимости от тяжести в критические периоды жизни
Тяжесть АБА
младший (п = 57)
Возраст школьников
средний (п = 92)
старший (п=34)
Легкая (А)
Средняя (Б)
п = 21 Ме = 0,105 25-й перц. - 0,07 75-й перц. - 0,15
п = 39 Ме = 0,12 25-й перц. - 0,08 75-й перц. - 0,17
п = 11 Ме = 0,11 25-й перц.- 0,10 75-й перц.- 0,13
п = 17 Ме = 0,13 25-й перц. - 0,11 75-й перц. - 0,19
п = 20 Ме = 0,15 25-й перц. - 0,10 75-й перц. - 0,22
п = 7 Ме = 0,11 25-й перц.- 0,06 75-й перц.- 0,20
Тяжелая (В)
п = 19 Ме = 0,15 25-й перц. - 0,10 75-й перц. - 0,24
п = 33 Ме = 0,20 25-й перц. - 0,12 75-й перц. - 0,35
п = 16 Ме = 0,18 25-й перц.- 0,12 75-й перц.- 0,21
Р (А/В)
А-В: 0,03
А-В: 0,005
А-В: 0,05
0,21 отн. ед.) и мальчиков (Ме = 0,14 отн. ед.; 25-й-перцентиль = 0,09 отн. ед.; 75-й - пер-центиль = 0,19 отн. ед.) обнаружено не было. Поэтому мы обращали внимание на изменения уровня ААТ-]^0 к нДНК у подростков разного пола в зависимости от тяжести АБА (табл.2).
Как следует из табл. 2, различия в уровне ААТ в крови становятся достоверными (р<0,05) у подростков с АБА с учетом тяжести заболевания. Кроме того, отмечены различия в нарастании уровней ААТ-к нДНК в сыворотке подростков, особенно у девочек. Предстояло выяснить, связано ли достоверное изменение количества ААТ-]^0 к нДНК в сыворотке крови подростков только с усугублением тяжести астмы или с физиологическим состоянием детей в критические возрастные периоды? Для этого были изучены изменения количества ААТ-1^0 к нДНК в сыворотке крови детей дошкольного (56 лет), младшего школьного (7-10 лет), среднего школьного (11-14 лет) и старшего школьного (15-17 лет) возраста [5].
Корреляционный анализ зависимости уровня ААТ-1^0 к нДНК от возраста детей показал, что возрастные особенности состояния параметров аутоиммунитета, по-
Таблица 4
Уровни ААТ-^О к нДНК в сыворотке крови детей с АБА в зависимости от пола
Степень тяжести АБА Мальчики Девочки
2,5-97,5 перцентилей соответственно
Легкая 0,04-0,48 0,03-0,25
Средняя 0,05-0,45 0,04-0,33
Тяжелая 0,03-0,52 0,08-0,58
видимому, не влияют на уровень ААТ-]^0 к нДНК: г5 = 0,07; р = 0,34.
Результаты, суммированные в табл. 3, свидетельствуют о достоверности различий в уровнях ААТ-1^0 к нДНК в зависимости от тяжести заболевания. Изменения в уровнях ААТ-1^0 к нДНК в сыворотке у детей с АБА средней тяжести характеризуются значительным разбросом индивидуальных данных. По мнению специалистов, это критическая фаза заболевания, которая влияет на ход дальнейшего развития астмы: регресс или усугубление тяжести течения. Уровни антител в группах обследованных находятся в зависимости от половой принадлежности (мальчики и девочки). У мальчиков незначительно различаются как нижние пределы уровня ААТ-]^0 к нДНК в сыворотке, так и верхние пределы в зависимо-
Таблица 5
Результаты корреляционного анализа зависимости уровня ААТ к нДНК от пола, возраста больных, сезона течения болезни и тяжести АБА
Показатели От пола От возраста От сезона От тяжести
П 193 193 193 193
0,012 0,1 0,065 0,29
И2 0,0006 0,018 0,005 0,09
Р 0,87 0,15 0,37 0,0005
сти от тяжести астмы. Иная картина у девочек: в их крови уровень антител возрастает более чем в 2 раза по мере усложнения течения болезни (табл. 4)
Выявленные нами изменения уровней ААТ-^О к нДНК в сыворотке у детей с АБА в различных возрастных группах были подвергнуты корреляционному анализу. В частности, мы изучали корреляцию между уровнем антител в сыворотке детей с АБА не только от пола и возраста, но и от сезона года и тяжести болезни. С помощью методов корреляционного анализа было установлено, что в обследованной нами группе детей нет ни возрастной, ни половой, ни сезонной зависимости значений ААТ-^О к нДНК. Прямая корреляция средней степени установлена между уровнем ААТ-^О к нДНК и тяжестью бронхиальной астмы (табл.5).
Итак, наши исследования показали, что в сыворотке детей, больных АБА имеются антитела к нДНК, уровень которых коррелирует именно с тяжестью болезни.
Данные литературы последнего десятилетия свидетельствуют о существовании природных абзимов - антител с нуклеаз-ной активностью и при аутоиммунной патологии. Их появление вполне правомерно связывают с аутоиммунизацией организма в случаях подобных заболеваний. Очевидно, что появление абзимов является общей тенденцией ответа иммунной системы высших организмов при тяжелой патологии [7]. Уникальность белков, обладающих ДНКазной активностью, заключается в том, что они эффективно катализируют гидролиз фосфодиэфирной связи. ДНКазы имеют важное значение в процессах нуклеинового обмена и для поддержания физиологической концентрации ДНК в организме человека [9]. Например, повышение концентрации ДНК в крови может привести к накоплению ДНК-белковых комплексов, индукции наработки антиДНК антител и развитию различного рода аутоиммунных заболеваний [8].
Однако открыты альтернативные пути гидролиза ДНК каталитически активными антителами, которые нарабатываются у больных с аутоиммунными заболеваниями.
Впервые природные каталитически активные АТ были обнаружены в крови пациентов с бронхиальной астмой к вазо-интестинальному пептиду (У1Р) [11], а затем АТ с ДНКазной активностью - в крови больных системной красной волчанкой [13] и другими заболеваниями [10]. В связи с этими данными обнаруженные антитела в периферической крови детей с АБА были изучены на наличие каталитической активности. ДНКазная активность ААТ-^О к нДНК оценивалась по их способности превращать субстрат - суперспиральную ДНК рБИ322 (I) - в кольцевую (II) и линейную (III) формы (рис.3). На дорожках 2-4, 6-9 и 10-12 видно, как падает количество суперспиральной ДНК (I форма) и нарастает количество продуктов ее расщепления, особенно кольцевой (II форма) ДНК на протяжении 8 часов реакции.
Наиболее активными оказались антитела из сыворотки крови больных с тяжелой и, особенно, средней стадией заболевания. Не у всех больных были обнаружены антитела-абзимы. Не было различий в характере расщепления субстрата и выраженности между антителами из сывороток периферической крови девочек и мальчиков.
Таким образом, установлены признаки нарушения иммунитета у детей с АБА средней и тяжелой степенями тяжести пер-систирующего течения - наличие аутоан-тител к нДНК с каталитической активностью в сыворотке периферической крови. В связи с этим анализ относительной ДНКазной активности аутоантител к нДНК становится дополнительным критерием в диагностике астмы, ее тяжести и, возможно, оценке эффективности проводимого лечения. Подобный взгляд находит свое подтверждение в работах Иойеш
4 5
10 11 12 13 номер дорожки I
ш I
п s
К1
К2
КЗ
К4
время.ч
К1
К2
КЗ
2 4 8 легкая
2 4 8 грглняя
К4
2 4 8 - мрг.ми. ч
степень ЛБА
Рис.3. Электрофореграммы, характеризующие ДНК-гидролизующую способность ААТ к нДНК у детей с АБА (мальчиков и девочек) в зависимости от тяжести заболевания.
(Субстрат - рБИ 322; К1 и К4 - субстрат без сыворотки в гидролизирующем буфере (трис-НС1 25 мМ, рН 7,5 /М^С12 5 мМ/ЫаС1 50 мМ) через 0 и 8 часов реакции соответственно; К2 - субстрат в трис-НС1 25 мМ, рН 7,5 без активаторов; КЗ - субстрат + сыворотка больного АБА (0 часов реакции).
et al. [12], которые при характеристике взаимосвязи аутоиммунных заболеваний и аутоиммунитета описывали астму как претендента на аутоиммунное заболевание. Они предположили, что аллергия и аутоиммунная патология могут иметь общее в патогенетических путях: возможное взаимодействие или общие механизмы в отдельных случаях, общие ключевые элементы, которые регулируют иммунный ответ как при астме, так и при аутоиммунных заболеваниях,- это тучные клетки, антитела, Т-клетки и др.
ЛИТЕРАТУРА
1. Васнева Ж.П. Клин. лаб. диагност. - 2003. -№ 12. - С. 44-47
2. Лакин Г.Ф. Биометрия. - М., 1990. -С. 352.
3. Лебедев К.А. Понякина И.Д. Иммунограмма в клинической практике. - М.,1990. - С. 224.
4. Окороков А.Н. Диагностика болезней внутренних органов. - М., 2001. - С. 480.
5. Пигалов А.П. Оценка здоровья детей и подростков. - Казань, 2006. - С. 120.
6. Baranovskii A.G., Odintsova E.S., Buneva V.N. et al.// Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. - 2004. - Vol. 23 (6-7). - P.1053-1056.
7. Kanyshkova T.G,. Semenov D.V., Khliman— kov D.Yu.H FEBS Lett. -1997. -Vol. 416. -P. 23-26.
8. Kanyshkova T.G, Babina S.E, Semenov D.V. //Eur. J. Biochem. - 2003. - Vol. 270. - P.3353-3361
9. Mishra O.P., Ashraf Q.M., Delivoria—Papado— poulos М.И Neuroscience. - 2002. - Vol. 115.-P. 985 - 991.
10. Nevinsky G.A., Buneva V.N. // J. Cell. Mol. Med. -2003. - Vol. 7. - No.3. - P. 265-276.
11. Paul S, Volle D.J., Beach C.M et al. // Science. -1989. - Vol. 244. - P.1158-1162.
12. Rottem M., Shoenfeld Y.// Int. Arch. Allergy Immunol. - 2003. - Vol. 132. - P.210-214.
13. Shuster A.M., Gololobov G.V., Kvashuk O.A et al. // Science. - 1992. - Vol. 256. - P.665-667.
Поступила 18.11.06.
AUTOANTIBODIES TO NATIVE DNA IN
CHILDREN WITH ATOPIC BRONCHIAL ASTHMA
R.A. Kurbanov, Z.I. Abramov, V.N. Tsibulkina, G.M. Zainetdinova
S u m m a r y
The level of anti-dsDNA antibodies in serum of 193 children with bronchial asthma and 21 healthy children was studied using method of ELISA. It was found that the level of anti-dsDNA antibodies increased with the severity of the disease. According to the correlation analysis, high level anti-DNA antibodies in serum depends only on the degree of severity of the disease but not on age, sex and season. The abzymatic activity of the antibodies, determined using the ability of enzymes to transform supercoiled DNA pBR 322 to circular and linear forms, was found in serum of some children with high level of anti-DNA antibodies. Anti-DNA antibodies from serum of patients with severe, and, especially, moderate degree of severity were characterized by highest abzymatic activity.
