CC BY
12Ауксиновая активность пиклорама в каллюсо- и морфогенезе пыльников яблони (Malus domestica Borkh)
В.Е. Джафарова,
кандидат сельскохозяйственных наук
Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт селекции плодовых культур, г. Орел, Россия
УДК 634.11:581.143.6
Яук&иновая активность пиклораМа в каллюсо-и морфогенезе пыльников яблони (МаСив ¿отевЬка Вогк&)
Приведен1 результати вивчення калюсо- / морфогенезу пильник1в 1мунних проти парш1 сор-т'в яблун з використанням пклораму. Виявлена ауксинова активнйть даного препарату як в темряв1, так / на св1тл1.
Ефективнйть калюсогенезу досл1джуваних сорт1в варювала в'д 26,0 до 83,3% в залежнос-т1 в'д концентрацийпклораму в темряв1 та в'д 11,3 до 74,9% вумовах слабкого освтлення. Оптимальним р1внем концентраци пклораму вважаемо 4 мг/л середовища, оскльки дана концентраця забезпечить найкращ1 показники калюсогенезу досл1джуваних сорт1в яблун1 Калюс, сформований у темряв1 на середовищ[ з пклорамом, бугорчатий, щльний, блого чи молочного забарвлення. Калюс, сформований на св1тл1, нтенсивно зелений або зеленувато-б'лий, бльш щльний, з ч1тко накресленими меристематичними осередками. Морфолог1чн1 ознаки калюс1в, отриманих на середовищ[ з пклорамом, стабтьн1 за роками. За сп1вв1дношення ауксин: цитокшш 1: 2 (пклорам: БАП) ндуковане корння у сорту Юбилей Москви. У сорту Свежесть - за сп1вв1дношення ауксин: цитокнн 3: 9 (пклорам: БАП, цито-кнн). У сорту Орловское полесье зафксовано утворення 4-х бруньок за концентраци ауксин: цитокнн 1: 20.
Ключовi слова:
пильники яблуы, ауксинова активысть, пклорам, калюсн тканини.
Введение. Культивирование незрелых пыльников, содержащих микроспоры на определенной стадии развития, в оптимальных условиях может приводить к делению гаметофитных клеток и регенерации растений. Культура пыльников является одним из путей получения гаплоидных растений. Удвоение числа хромосом превращает гаплоид в фертильное гомозиготное диплоидное растение. Применение гаплоидных растений в селекции позволяет создавать константные неращепляющиеся гомозиготные формы в первой генерации и сокращать селекционный процесс; упрощать мутационную селекцию; получать каллюсную ткань, содержащую клетки разных уровней плоидности, что является дополнительным источником в селекции [1, 2].
Развитие пыльцевого каллюса многолетних плодовых культур преимущественно идет по пути косвен-
ного андрогенеза. Обязательным условием дифференциации растительной клетки и превращения ее в каллюсную является присутствие в питательной среде представителей двух групп фитогормонов: ауксинов и цитокининов [3]. Мощным индуктором морфогенеза в каллюс-ной ткани также является наличие в среде цитокининов и ауксинов, а также их соотношение. Ауксины, используемые на этапе морфогенеза, традиционны. Это 2,4-Д, ИУК, НУК. Наилучшая результативность процесса андрогенеза пока характерна для однолетних культур. Получение гаплоидных растений из изолированных пыльников многолетних культур не стабильно и малорезультативно.
В 1963 году the Dow Chemical Company индуцировала 4-ами-но-3,5,6 - трихлорпиколиновую кислоту (торговое наименование тордон, химическое название - пи-
клорам)как гербицид для борьбы с сорной растительностью. Действие этой кислоты на клетки наступает уже через 30 минут, оно проявляется в изменении состояния ядра, затем цитоплазмы и оболочки. Действуя как гербицид, пиклорам быстро проникает в клетки и передвигается к активно растущим меристема-тическим тканям. Данное вещество эффективно не только как гербицид, но еще обладает и высокой аукси-новой активностью [4]. Основной функцией ауксина в культурах тканей и клеток растений является его участие в регуляции размножения клеток. Именно этим обусловлено его непременное включение в питательные среды для культур тканей и использование как важнейшего средства управления ростом и морфогенезом в изолированной культуре [5]. Действие 4-амино- 3,5,6-трихлорпиколиновой кислоты, так же как и ауксинов, сопровождается
Ауксиновая активность пиклорама в каллюсо- и морфогенезе пыльников яблони (Malus domestica Borkh)
усилением накопления белка и нуклеиновых кислот [6].
Применение пиклорама в условиях in vitro на однолетних культурах, в частности, для получения каллюсов у бобовых и злаковых, показало его более высокую стимулирующую активность по сравнению с 2,4-Д, ИУК и НУК [7, 8, 9]. Данный препарат проявил высокую активность в индукции образования каллюса и его размножения у лука [10]. Каллюс, полученный с помощью пиклорама, дает лучший органогенез при посадке на органообразующую среду [6, 7] и по сравнению с 2,4-Д имеет более низкую фитотоксичность [11, 12]. При выращивании каллюсов на свету, пиклорам в отличие от 2,4-Д не ингибирует синтез хлорофилла и, поэтому, более пригоден для получения органогенных каллюсов [13].
По сравнению с однолетними культурами возможности индукции каллюсогенеза и морфогенеза у яблони ограничены и результативность еще мала: морфогенетиче-ские процессы индуцируются крайне редко и характеризуются нестабильностью. Из отдельных ценных генотипов вообще не удается получить растения-регенеранты из пыльцевого каллюса [14], поскольку каллюсная ткань, возникшая из пыльников, не всегда способна к морфогенезу.
Принимая во внимание до сих пор низкий выход гаплоидов при культивировании пыльников многолетних плодовых растений с одной стороны и преобладающую ауксиновую активность препарата пиклорам на однолетних культурах в сравнении с традиционно используемыми (2,4-Д, НУК, ИУК) с другой стороны, необходимо было изучить возможности каллюсо- и морфогенеза яблони с использованием пи-клорама. К тому же, данные по его применению в индукции каллюса и органогенеза у плодовых культур отсутствуют.
Методика исследований. В работе использовали пыльники
иммунных к парше сортов яблони Орловское полесье и Юбилей Москвы. В сухую погоду для посева пыльников бутоны отбирали по внешним признакам, считающимися для яблони наиболее продуктивными в отношении каллюсообразо-вания (соцветие выдвинуто, бутоны в нём плотно сомкнуты, без белого конуса, их пыльники зеленовато-желтого цвета). Бутоны помещали в чашки Петри с увлажненной фильтровальной бумагой и ставили в холодильник на 3-7 дней при температуре +3-+4°С.
Посев пыльников проводили на среду Мурасиге-Скуга в асептических условиях из расчета один бутон на пробирку. Посеянные пыльники культивировали при температуре 25°С в термостате и в условиях 16 часового фотопериода с интенсивностью освещения до 1000 лк и влажностью воздуха 60-70% в све-токомнате.
Среды, используемые для индукции каллюсообразования и органогенеза, содержали макро- и микросоли, витамины Вх, В6, РР по 0,5 мг/л, гидролизат казеина - 600 мг/л, мезо-инозит - 100 мг/л, сахарозу - 20 г/л и агар-агар, концентрация последнего варьировала в зависимости от его вида.
Для оценки ауксиновой активности пиклорама в процессе каллюсо-генеза за основу брали рекомендованный второй вариант среды МС для яблони [2]. Соотношение ауксин : цитокинин в индукции каллю-сообразования базового варианта среды равнялось 1 : 1. Концентрацию пиклорама подбирали эмпирически.
Результаты исследований. Культивирование изолированных пыльников яблони иммунных к парше сортов на искусственной питательной среде показало, что репродуктивные клетки развивались по пути косвенного андрогенеза. Начало каллюсообразования в темноте отмечалось через 10-28 дней, а на свету - через 14-28 дней. Ча-
Таблица 1
Эффективность каллюсогенеза у пыльников яблони в присутствии пиклорама, %.
Сорт Питательная среда Частота каллюсообразования (в %) при культивировании пыльников в:
термостате светоком-нате
2005 г.
Орловское полесье МС 56,3±1,5 43,1±1,0
МСП2* 50,2±1,5 14,5±0,7
МСП4** 39,8±0,9 22,6±1,0
Юбилей Москвы МС 45,1±1,0 38,3±1,1
МСП2 26,6±1,1 11,3±0,5
МСП4 39,1±1,0 21,3±0,9
2006 г.
Орловское полесье МС 69,2±1,2 56,1±1,1
МСП2 57,0±1,3 12,9±0,7
МСП4 82,0±0,5 58,1±0,7
Юбилей Москвы МС 80,3±1,0 47,2±1,3
МСП2 39,7±0,9 12,5±0,8
МСП4 83,3±0,4 74,9±0,5
2007 г.
Орловское полесье МС 38,4±0,9 25,8±0,9
МСП4 26,9±1,1 18,9±0,7
МСП6*** 40,0±1,0 20,3±0,8
Юбилей Москвы МС 49,4±1,3 31,7±1,1
МСП4 31,0±1,0 13,0±0,8
МСП6 26,0±0,9 14,5±0,7
****** - среда Мурасиге-Скуга с добавлением соответственно 2 мг/л; 4 мг/л, 6 мг/л пиклорама.
стота каллюсообразования пыльников яблони различалась по годам: наибольшей она была в 2006 г. и варьировала от 39,7 до 83,3% при выращивании каллюса в темноте. В условиях пониженного освещения данный показатель был в пределах 12,5-74,9% (табл. 1).
Для оценки действия пиклорама на этапе каллюсогенеза использовали три уровня. Было установлено, что за годы исследований пиклорам проявил значительную ауксиновую активность в индукции каллюсо-образования. Эффективность кал-люсогенеза исследуемых сортов варьировала от 26,0 до 83,3% в зависимости от концентрации пикло-рама в темноте и от 11,3 до 74,9% в условиях пониженного освещения. При этом оптимальным уровнем
Ауксиновая активность пиклорама в каллюсо- и морфогенезе пыльников яблони (Malus domestica Borkh)
концентрации пиклорама считаем 4 мг/л, поскольку, за все годы исследований (и те, которые не представлены в таблице) именно такая концентрация давала наилучшие показатели каллюсогенеза обоих сортов яблони как в темноте, так и на свету.
Каллюс, сформированный в темноте на среде с пиклорамом, бугорчатый, плотный, белого или молочного цвета. При перенесении такого каллюса на свет половина его поверхности зеленеет в 99 из 100 случаев, тогда как без пиклорама - от 32% до 51% в зависимости от сорта. Каллюс, сформированный на свету, изначально имел интенсивно зеленую или зеленовато-белую окраску, более плотный, чем сформированный в темноте, с четко очерченными меристематическими очагами. Каллюс, образовавшийся в темноте без пиклорама, при его дальнейшем пассировании приобретает водянистую структуру или
рано стареет, что характерно для всех сортов, хотя и в разной степени. Таких негативных особенностей в каллюсах на среде с пиклорамом не отмечалось. Морфологические признаки каллюсов, полученных на среде с пиклорамом стабильны из года в год.
Способность каллюсных клеток к морфогенезу определяется соотношением цитокининов и ауксинов, входящих в состав питательных сред. При использовании пиклорама в качестве ауксина, были получены корни у сорта Юбилей Москвы при соотношении ауксин : цитоки-нин 1 : 2 (пиклорам : БАП). В кал-люсной массе сорта Свежесть также индуцированы корни, но при соотношении ауксин : цитокинин 3 : 9 (пиклорам : БАП, кинетин). Корни формировались внутри каллюсной ткани. Изменение соотношения концентрации ауксин : цитокинин 1 : 20 положительно сказалось на морфогенной способности пыль-
цевого каллюса сорта Орловское полесье. У данного сорта отмечено образование 4-х почек. Использование вместо пиклорама только НУК в тех же концентрациях не способствовало индукции морфогенеза у исследуемых сортов.
Выводы. Испытание пиклорама в качестве индуктора каллюсо- и морфогенеза в развитии пыльников яблони показало его значительную ауксиновую активность. Развитие пыльников иммунных к парше сортов яблони проходило по пути косвенного андрогенеза. Оптимальная концентрация пиклорама на этапе каллюсогенеза - 4 мг/л. Индуцированы корни у сорта Юбилей Москвы, а также почки у сорта Орловское полесье. Проявление морфогенных процессов в каллюс-ных тканях изученных сортов яблони предполагает применение данного препарата на других плодовых многолетних культурах.
ИСПОЛЬЗОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА
2.
з.
4.
5.
б.
7.
Гапоненко, А.К. Перспективы использования культуры клеток растений в селекции I А.К. Гапоненко II Успехи современной генетики. - М.: Наука, 1987. - Вып. 14. - С. 64-74.
Жуков, О.С. Методические рекомендации по получению растений-регенерантов плодовых пород в культуре пыльников I О.С. Жуков, О.Я. Олейникова, Н.И. Савельев. - Мичуринск, 1994. - 36 с. Шевелуха, В.С. Сельскохозяйственная биотехнология I В.С. Шевелуха, Е.А. Калашникова, С.В. Дегтярев [и др.]. - М.: Высш. шк., 1998. - 416 с. Kefford, N.P., Caso, O.N. A potent auxin with unique chemical structure - 4 - amino -3,5,6 -trichloropicolinic acid. I N.P. Kefford, O.N. Caso. II Bot. Gaz. - 1966. - Vol. 127. - N 2I3. - C. 159-163. Гамбург, К.З. Ауксины в культурах тканей и клеток растений I К.З. Гамбург, Н.И. Рекославская, С.Г. Швецов. - Новосибирск: Наука, 1990. 243 с. Калинин, Ф.Л. Физиология и биохимия культурных растений I Ф.Л. Калинин, В.К. Мусияка. - 1974. - Т. 6, В. 4. - С. 365.
Dulieu, H., Vallee, J. - C., Martin, G. Quelques effects de I'acide 4 - amino - 3,5,6 - trichloropicolinique (piclorame) sur les tissus de Nicotiana tabacum var. Xanthi n. c. en. culture in vitro. I H. Dulieu, J. - C. Vallee, G. Martin II C.R. Acad. Sci. - 1972. - Vol. D. 274. - №18. - P. 2574-2577.
8. Мусияка, В.К. Активизация деления и растяжения клеток культуры ткани табака в присутствии 4 -амино - 3,5,6 - трихлорпиколиновой кислоты /
B.К. Мусияка, Ф.Л. Калинин // Физиология и биохимия культурных растений. - 1975. - Т. 7., № 5. -
C. 486-492.
9. Vian, W.E. The effectiveness of picloram as an auxin source compared to 2,4-D in wheat callus culture medium / W.E. Vian. // Agron. Abstr. - 1976. - P. 65.
10. Phillips, G.C. Effects of picloram and other auxins on onion tissue cultures / G.C. Phillips, K.J. Luteyn. // J. Amer. Soc. Hort. Sci. - 1983. - Vol. 108., № 6. - P. 948-953.
11. Чернова, Л.К. Сравнение дифференцирующего воздействия 2,4-Д и 4 - амино - 3,5,6 - трихлорпиколиновой кислоты на ткани бобовых и злаковых растений / Л.К. Чернова, М.Н. Прохоров,
Б.В. Филин-Колдаков // Физиология растений. -1975. - Т. 22, № 2. - С. 170-175.
12. Mok, M.G. Genotipic responses to auxins in tissue cultures of Phaseolus / M.G. Mok, D. W. S. Mok // Physiol. Plant. - 1977. - V. 40, № 4. - P. 261-264.
13. Collins, G.B. Use of 4 - amino - 3,5,6, -trichloropicolinic acid as an auxin source in plant tissue cultures / G.B. Collins, W.E. Vian, G.C. Phillips // Crop Sci. - 1978. - V. 18, № 2. - P. 286-288.
14. Хохлов, В.С. Гаплоидия и селекция / В.С. Хохлов, В.С. Гришина. - М.: Наука, 1976. - 221 с.
