CC BY
95
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ♦ Вирусология ♦
УДК 578.823.1.576.8.097.24
Аттенуация штаммов вируса катаральной лихорадки овец
Ж.Т. Аманова, магистр (amanova-janka@mail.ru), З.Д. Ершебулов, магистр (ershebulov@mail.ru), Д.С. Таранов, магистр (taranov_dv@mail.ru), Е.О. Абдураимов, кандидат ветеринарных наук (abduraimov_72@mail.ru), Е.А. Булатов, кандидат биологических наук (erbol_km@mail.ru), А.Р. Сансызбай, доктор ветеринарных наук, профессор (Sansyzbai-ar@biosafety.kz) Научно-исследовательский институт проблем биологической безопасности Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан (Республика Казахстан, п.г.т. Гвардейский).
Представлены результаты аттенуации эпизоотических штаммов «Хуросон-07/4» и «КТ/ШВЗР-07/16» вируса КЛО в РКЭ методом последовательного пассирования. В результате экспериментов на 35...40-М пассаже достигнута аттенуация данного вируса. Следовательно, получены два новых аттенуированных культуральных штамма вируса КЛО.
Ключевые слова: аттенуация, вирус, КЛО, культура клеток, РКЭ, штамм
Сокращения: КЛО — катаральная лихорадка овец, ПС — почка сайгака, РКЭ — развивающиеся куриные эмбрионы, ТЦД — тканевая цитопатическая доза
Введение
Казахстан в настоящее время активно развивает сельское хозяйство, в частности мелкое животноводство. Результаты анализа литературы по распространению КЛО среди сельскохозяйственных животных [2, 3] подтвердили актуальность работы по получению аттенуирован-ного вируса КЛО для приготовления вакцинного препарата против данной инфекции.
Пути и методы аттенуации различных возбудителей болезней весьма многочисленны. Первые эксперименты по аттенуации возбудителя КЛО провел Taylor в 1906— 1908 гг. В качестве исходного вируса он использовал штамм, не обладающий высокой вирулентностью; после 11___18 пассажей на овцах этот штамм значительно снизил патогенные свойства, но сохранил иммуногенность и почти 40 лет применялся в качестве вакцины [5].
В 1946 г. Alexander после отработки условий выращивания вируса КЛО в РКЭ провел серийные пассажи четырех штаммов вируса, изолированных в Южной Африке. По мере адаптации возбудителя КЛО к РКЭ наблюдалось ослабление его вирулентных свойств для овец и усиление их для куриных эмбрионов. Таким путем были аттенуированы штаммы Cyprus — на 101 пассаже, Estantia — на 60 и Blaukop & Theiler — на 56 пассажах. Эти штаммы вошли в состав коммерческой четырехвалентной вакцины [4]. Американские исследователи аттенуировали по методу Alexander два калифорнийских штамма вируса КЛО: БТ-8 и БТ-11. Эти штаммы после 30.. .35 пассажей в РКЭ не вызвали клинического проявления болезни у овец и на уровне 50_57 пассажей были приняты в качестве вакцинных [6, 7]. Все указанные выше вакцины, приготовленные из штаммов вируса, аттенуированных серийными пассажами в РКЭ, применялись только в очагах инфекции и стационарно неблагополучных районах, где в ряде случаев давали вполне удовлетворительные результаты [8].
Из приведенных примеров видно, что при использовании различных путей аттенуации вирусов многим исследователям удавалось получить вполне удовлетворительные вакцины.
Рис. 1. Клиническая картина проявления инфекционного процесса КЛО в РКЭ
По литературным данным, чувствительной моделью к вирусу КЛО являются лабораторные белые мыши. Наиболее восприимчивы мыши 1...3-суточного возраста. Вирус размножается в мозге новорожденных мышей при интрацеребральном заражении и вызывает их гибель через 3.5 суток с симптомами энцефалита. У взрослых мышей вирус размножается, но инфекция протекает инапарантно [1].
Цель исследования
Получить культуральные аттенуированые штаммы вируса КЛО, пригодные для использования в разработке средств специфической профилактики данной болезни.
Материалы и методы
В процессе работы были использованы эпизоотические штаммы вируса КЛО: «Хуросон-07/4» серотип 4 и <^Т/ RIBSP-07/16» серотип 16, с инфекционной активностью 7,00 ± 0,00 ^ ТЦД50/мл и 6,75 ± 0,23 ^ ТЦД50/мл, соответственно.
Для исследований по аттенуации вируса КЛО использовали 11.. .13-суточные РКЭ, заражая их в главную алланто-исную вену. Эмбрионы инфицировали следующим образом: просвечивая яйцо при помощи овоскопа, определяли расположение главной алантоисной вены, затем пробойником делали отверстие и вводили вирус внутривенно в обьеме 0,1 мл. Инфицированные РКЭ инкубировали при 34,0 ± 0,5 °С и относительной влажности воздуха 40...70 %.
Гибель эмбрионов в первые сутки считали неспецифической. РКЭ, погибавшие на 2.5-е сутки, охлаждали при 4 °С в течение 14.16 ч. Затем вскрывали эмбрионы, отбирали зародыши с характерными признаками инфекции и готовили 20%-й гомогенат, который исполь-
Аттенуация штаммов вируса катаральной лихорадки овец
Число пассажей Рис. 2. Аттенуация вируса КЛО на РКЭ
зовали для последующего пассажа. В РКЭ проведено по 40 последовательных пассажа изучаемых штаммов.
Аттенуацию вируса КЛО контролировали каждые 5 пассажей заражением новорожденных мышат сосунов 1.. .2-суточного возраста: им вводили интрацеребрально по 0,02 мл эмбриональный гомогенат в виде 20%-й суспензии. За мышами вели наблюдения в течение 6 суток. После чего оставшихся в живых мышат подвергли эвтаназии и охлаждали при 4 оС в течение 12...14 ч. Затем в асептических условиях вскрывали черепную коробку погибших и вынужденно убитых мышат, извлекали головной мозг и готовили 20%-й гомогенат, которым инфицировали культуры клеток. Срок культивирования составил 3 суток, в качестве питательной среды использовали среду Игла-МЕМ с содержанием 5 % сыворотки крови крупного рогатого скота (инактивированной при 56 °С в течение 30 мин) при заражающей дозе 0,01.0,02 ТЦД50 на клетку, рН среды 7,2.7,5.
Полученные результаты исследований были проанализированы с использованием программы Graph Pad Prism 5.0. Статистическая значимость определена на уровне р<0,05.
Результаты и обсуждение
При работе по аттенуации штаммов вируса КЛО в РКЭ методом последовательного пассирования установлено, что на первых 5 пассажах гибель эмбрионов с клиническим проявлением инфекционного процесса КЛО (рис. 1) составила 5 %; с 5-го по 10-й пассаж она повышалась до 50 %, а к 15-му пассажному уровню достигала 90.95 % из числа зараженных. Вышеуказанный процент гибели эмбрионов сохранился и на 40-м пассажном уровне. Результаты исследований приведены на рисунке 2.
Контроль аттенуации пассажных материалов вируса КЛО установил снижение патогенного действия вируса в отношении мышат сосунов с каждым последующим пассажем, при этом на 5-м пассажном уровне гибель мышат составила 90 %, на 10-м — 75 %, на 15-м — 40 %, с 20-го по 35-й пассаж — от 2 до 5 % и с 37-го по 40-й исследуемые штаммы не вызывали гибели (рис. 3).
Затем была исследована возможность восстановления вирулентных свойств аттенуированных штаммов при культивировании в культуре клеток, для этого эмбриональный материал (20%-я суспензия) пропассирован в культуре клеток (10 последовательных пассажей) с определением инфекционного титра вируса. На первом пассаже вирус накапливался в титре 6,25 ± 0,08 lg ТЦД5о/мл, при дальнейшем пасстровании наблюдали подъем инфекционного титра до 7,75 ± 0,12 lg ТЦД50/мл.
С целью определения реверсибельности полученных аттенуированных штаммов вируса, культуральные материалы 10-го пассажного уровня пассировали на мышах 1...3-суточного возраста (10 пассажей) и овцах 6...12-ме-сячного возраста (3 пассажа). Для этого культуральный
IS го 25 30 Число пассажей
Рис. 3. Контроль аттенуации вируса КЛО на мышатах сосунах
материал вводили мышатам интрацеребрально по 0,02 мл, а овцам внутривенно по 10 мл. Мышата и овцы остались живыми без проявления клинических признаков инфекции в течение 14 суток (срок наблюдения). Таким образом, получены аттенуированные вирусы КЛО, которые не обладают патогенными свойствами при введении его восприимчивым животным.
Штаммы адаптированы для культивирования в перевиваемой культуре клеток ПС.
Заключение
Получены два новых аттенуированных культуральных штамма «Хуросон-07/4» серотипа 4 и «RT/RIBSP-07/16» серотипа 16 вируса КЛО путем пассирования в куриных эмбрионах, которые далее адаптированы к культивированию в перевиваемой культуре клеток ПС с хорошо выраженным цитопатическим эффектом. Полученные штаммы депонированы 09.10.2013 г. под номером М-10-13/ Д и М-11-13/Д в Коллекции микроорганизмов РГП НИ-ИПББ КН МОН РК, для дальнейших экспериментов, связанных с разработкой живой бивалентной культу-ральной вакцины.
Библиография
1. Саметова, Ж.Ж. Принципиальная возможность получения аттенуированных штаммов вируса катаральной лихорадки овец / Ж.Ж. Саметова, З.Д. Ершебулов, Ж.Т. Аманова и др. // Мат-лы научно-практической конференции «Инновационное развитие науки в обеспечении биологической безопасности». — Республика Казахстан, п.г.т. Гвардейский, 7 август, 2013. — С. 172-181.
2. Список МЭБ и трансграничные инфекции животных: монография / В.В. Макаров, В.А. Грубый, К.Н. Груздев, О.И. Сухарев. — Владимир: ФГБУ «ВНИИЗЖ», 2012. — 162 с.
3. Стрижаков, А.А. Эпизоотология и меры борьбы с блютангом / А.А. Стрижаков, Н.И. Закутский, А.В. Ко-ломыцев // Ветеринария. — 2008. — №8. — С. 23-27
4. Alexander, R.A. The propagation of bluetongue virus in the developing chick embryo with particular reference to the temperature of incubation / R.A. Alexander // Onderstepoort Journal of Veterinary Science and Animal Industry. — 1947. — No. 22. — P. 7-26.
5. Becker, C.H. Hand buch der virus infection bei Tieler / C.H. Becker // Arch. Exp. Veterinarmed. Bd., —1968. — No. 111(2) Sp ez.Tiel.2. — Р. 1167-1197.
6. Breard, E. Transient effect of the attenuated bluetongue virus vaccine on the quality of the ram semen / E. Breard, N. Pozzi, C. Sailleau, et al. // Vet. Rec. — 2007. — No. 160 (13). — P. 431-435.
7. Osburn, B.I. Conclusions. In: Proceedings of the Third OIE International Symposium on Bluetongue. Taormina, 26-29 October 2003 / B.I. Osburn; N.J. MacLachlan & J.E. Pearson // Vet. Ital. — 2004. — No. 40. — P. 713-726.
8. Veronesi, E. Live attenuated bluetongue vaccine viruses in Dorset Poll sheep, before and after passage in vector midges (Diptera: Ceratopogonidae) / E. Veronesi, C. Hamblin, P.S. Mellor // Vaccine. — 2005. — No. 23. — P. 5509-5516.
SUMMARY
Zh.I. Amanova, Z.D. Ershebulov, D.S. Taranov, Ye.O. Abduraimov, Ye.A. Bulatov, А^. Sansyzbai
Research Institute for Biological Safety Problems Science of Committee Ministry of Education and Science of the Republic of Kazakhstan (Republic of Kazakhstan, Settl. Gvardeiskiy).
Attenuation of the Strains Bluetongue Virus. the results of attenuation of epizootic strains «Khuroson-07/4» and «RT / RIBSP-07/16» of bluetongue virus (BTV) in developing chicken embryos (ECE) by serial passaging are presented. As a result of experiments sequential passaging of bluetongue virus in chicken embryos by 35.40 passage led to the attenuation of the virus. Consequently, we obtained two new strains of bluetongue virus. Keywords: attenuation, virus, BTV, cell culture, ECE, strain.
