CC BY
59
Атомно-силовая микроскопия: конструирование биочипов для детекции и изучения поверхностной структуры инфекционных агентов на нанометровом уровне
Асташонок А.Н.1, Полещук Н.Н.1, Рубаник Л.В.1, Жавнерко Г.К.2
Республиканский научно-практический центр эпидемиологии и микробиологии, Минск, Беларусь 2ООО«Изовак технологии», Минск, Беларусь
Astashonok A.N.1, Poleshchuk N.N.1, Rubanik L.V.1, Zhavnerko G.K.2
1The Republican Research and Practical Center for Epidemiology and Microbiology, Minsk, Belarus
2Izovac Technologies Ltd, Minsk, Belarus
Atomic-force microscopy: construction of biochips for detection and study at nanometer level the surface structure of the infectious agents
Резюме. В статье представлены результаты экспериментальных исследований по конструированию сенсорных платформ для адсорбции, детекции и идентификации с использованием атомно-силовой микроскопии возбудителей социально-значимых инфекций, вызываемых C. trachomatis, M. tuberculosis, B. burgdorferi, Т. vaginalis. На сконструированных биочипах проведена дифференциация внеклеточных форм C. trachomatis на три морфологических варианта («зрелые*, -формы, ультрамалые частицы) с характеристикой их поверхностной структуры. Для M. tuberculosis детализированы основные вариации в поверхностной организации резистентных к противотуберкулезным препаратам штаммов возбудителя, а для B. burgdorferi и Т vaginalis охарактеризованы метаморфозы, отражающие их структурные различия, связанные с вирулентностью. Полученные результаты важны для совершенствования подходов к видовой идентификации патогенов, разработке чувствительных и специфичных методов диагностики и понимания механизмов, обусловливающих мимикрию и ускользание возбудителей от иммунологического надзора.
Ключевые слова: иммунобиочипы, C. trachomatis, M. tuberculosis, B. burgdorferi, T vaginalis, ультрамалые частицы, дормантные формы микроорганизмов, диагностика, атомно-силовая микроскопия.
Медицинские новости. — 2018. — №2. — С. 69—74. Summary. The article presents the results of the experimental studies on designing of sensor platforms for adsorption, detection and identification by atomic force microscopy of pathogens of the socially significant infections, caused C. trachomatis, M. tuberculosis, B. burgdorferi, T. vaginalis. On the designed biochips three morphovars of the extracellular forms of C. trachomatis were differentiated («mature», L-forms, ultra-small particles) with their surface structure characteristic. For M. tuberculosis, the main variations in the superficial organization of drug-resistant strains of the causative agent are detailed, and for B. burgdorferi and T. vaginalis metamorphoses that reflect their structural differences associated wtth virulence are characterized. The results obtained are important for improving approaches in the pathogen species identification, developing of sensitive and specific diagnostic methods, and understanding of mechanisms that cause mimicry and the pathogen escape from immunological surveillance. Keywords: immunobiochips, C. trachomatis, M. tuberculosis, B. burgdorferi, T. vaginalis, ultra-small particles, dormant forms of microorganisms, diagnostics, atomic force microscopy.
Meditsinskie novosti. - 2018. - N2. - P. 69-74.
Разработка высокочувствительных методов детекции и идентификации микроорганизмов является актуальным и значимым направлением в современной микробиологии. Среди них одно из ведущих мест принадлежит высокоразрешающей микроскопии [12]. В последние годы новые знания позволяет получать атомно-силовая микроскопия (АСМ), которая дает возможность исследовать морфофункциональные особенности возбудителей при их физиологических условиях в сочетании с оптическим наблюдением топографии поверхности в режиме реального времени [6]. Кроме того, АСМ позволяет проводить точную оценку не только морфологии, но и структуры поверхности патогенов, ис-
следовать молекулярные (гидрофобные и электростатические) взаимодействия, картировать физико-химические параметры микроархитектоники (жесткость и упругость клеточной стенки, адгезивные свойства, натяжение поверхностных макромолекул, структуру S-слоя и т.д.) [9].
Традиционные методы детекции инфекционных агентов далеко не всегда эффективны, что может быть обусловлено накоплением возбудителей в низких титрах, продукцией дефектных, 1-форм и «некультивируемых» покоящихся морфологических вариантов частиц с измененной генетической и антигенной структурой [4]. Особой проблемой является идентификация и дифференциация резистентных к антибактериальным
препаратам форм патогенов. Известно, что при действии различных стрессовых факторов на микроорганизмы могут наблюдаться различные их структурно-модификационные изменения. В литературе большое внимание при этом уделено перестройкам, происходящим на генетическом и биохимическом уровнях. Однако для более углубленной оценки состояния возбудителей также важно изучение их структуры на на-норазмерном уровне. В то же время морфологическая основа адаптации микроорганизмов к антибактериальным препаратам освещена недостаточно полно. Механизмы структурных преобразований клеточной стенки и микропрофилей рельефа у полирезистентных
штаммов возбудителей также требуют углубленного изучения.
Данная работа посвящена изучению возможности детекции и идентификации с использованием АСМ некоторых возбудителей из различных семейств, отличающихся по форме, средним размерам и поверхностной архитектонике.
Цель исследования - используя биочипы на основе монокристаллического кремния и аминослюды, оценить возможность иммобилизации на сенсорной поверхности возбудителей из различных классов и семейств (C. trachomatis, M. tuberculosis, B. burgdorferi, T. vaginalis) и с помощью АСМ-анализа охарактеризовать их поверхностную структуру.
Материалы и методы
Возбудители. В данной работе использованы изоляты и штаммы возбудителей C. trachomatis, M. tuberculosis, B. burgdorferi, T. vaginalis, вызывающие различные инфекционные заболевания.
C. trachomatis. Исследованию подвергнуто 2 штамма C. trachomatis, выделенных из урогенитального тракта и депонированных в Специализированную коллекцию вирусов и бактерий, патогенных для человека РНПЦ эпидемиологии и микробиологии (Минск, Беларусь): CT-867/Минск/8/2011 - депонент B-03/2012, серовар. B; СТ-869/Минск/7/2011 - депонент B-04/2012, серовар. B. Штаммы предварительно накапливали на перевиваемой линии клеток McCoy, получая персистентную форму инфекции [1].
M. tuberculosis. В работе использовали эталонный штамм M. tuberculosis H37Rv, предоставленный доктором van Soolingen D. (Национальная рефе-ренс-лаборатория по туберкулезу, Нидерланды). Анализу подвергнуты также клинические изоляты микобактерий (n=4), выделенные и предоставленные доктором Farnia P. (Национальный исследовательский институт туберкулеза и легочных заболеваний, Иран). Последние характеризовались различной устойчивостью к противотуберкулезным препаратам: 1) монорезистентные (n=2) - устойчивые к рифампицину; 2) мультирезистентные (n=2) - устойчивые к изониазиду, рифампицину, этамбутолу, стрептомицину.
B. burdorferi. Использовали штамм B. burgdorferi sensu stricto, выделенный в 1996 году в Республике Беларусь из клеща Ixodes ricinus и представленный
научным сотрудником Князевой О.Р. (РНПЦ эпидемиологии и микробиологии, Беларусь) [3]. Возбудитель культивировали при 34o С в питательной среде BSK-H (модифицированная среда Barbour -Stoenner - Kelly).
Trichomonas vaginalis. Исследованы штаммы полиморфных и амастиготных трихомонад (n=2), выделенных от пациентов с различной урогенитальной патологией [5]. Для культивирования возбудителя применяли жидкую питательную среду производства НИИЭМ им. Пастера (Санкт-Петербург, Россия).
Модификация подложек для проведения АСМ. Для конструирования биочипов использовали различные типы подложек - на поверхностях аминослю-ды и монокристаллического кремния.
Слюда. Процедуру получения ами-нослюды осуществляли путем предварительного скалывания ее поверхности с последующей обработкой 3-амино-пропилтриэтоксисиланом (АПТЕС). Для этого образцы свежесколотой (немоди-фицированной) слюды помещали в стеклянный эксикатор в присутствии АПТЕС и N^-дизопропилэтиламина и инкубировали в атмосфере аргона в течение 2 часов при комнатной температуре. Подложки отмывали бидистиллированной водой и высушивали до использования.
Кремний. Использовали пластины монокристаллического кремния (КДБ-12, p-тип лигирования), предоставленные лабораторией химии тонких пленок Института химии новых материалов НАН РБ. Гидрофилизацию поверхности кремния проводили путем нагревания в смеси H2O:H2O2:NH4OH (в отношении 5:1:1) в течение 15 минут при температуре 67-72 0С с последующей отмывкой биди-стиллированной водой и высушиванием в атмосфере азота. Структурирование сенсорных покрытий проводили, используя оригинальный подход на основе метода микроконтактной печати (МКП) [2].
Иммобилизация возбудителей на сенсорных покрытиях. Для адсорбции C. trachomatis методом МКП предварительно формировали полосы из положительно заряженного полиэлектролита - полиэтиленимина (ПЭИ), затем иммобилизировали БСА (белок сравнения). Для создания сенсорных покрытий на поверхности гидрофильного кремния из раствора на свободные участки адсорбировали авидин, а на него -
поликлональные биотинилированные противохламидийные IgG (РА1-27223, ThermoFisher Scientific, США), направленные к различным поверхностным антигенам C. trachomatis.
Для адсорбции M. tuberculosis на кремниевую подложку из водного раствора предварительно адсорбировали БСА (1 мг/мл). Затем с помощью МКП формировали на сенсорной поверхности полосы из различных полиэлектролитов - ПЭИ и полистиролсульфоната (ПСС). Для более специфической адсорбции возбудителя использовали кремниевые подложки с нанесенными поликлональными анти-туберкулезными антителами (polyclonal anti-M. bovis antibody, B0124, Dako).
Для адсорбции T vaginalis, B. burgdorferi на слюдяную поверхность наносили аликвоты (40 мкл) возбудителей, которые были предварительно обработаны двукратным центрифугированием при 1500 об/мин в течение 10 минут с последующим ресу-спендированием осадка 0,1M фосфатно-солевым буфером (pH 7,4).
АСМ-анализ. Анализ проводили с помощью микроскопа Nanoscope IIId MultiMode (Digital Instruments, США), оборудованным J-сканером. Использовали контактные 100- и 200-мкм кантилеверы «Nanoprobe» (Veeco, США) из Si3N4 c константами упругости 0,12 и 0,36 Н/м и тей-пинговые зонды из кремния с резонансной частотой ~315 кГц. Частота строчной развертки при получении изображения варьировала от 1 до 5 Гц, амплитуда колебаний была в диапазоне - 150-300 мВ. Обработку и количественный анализ биофизических параметров изображений проводили с использованием программы Femtoscan online (версия 2.2.94). Всего проанализировано 1184 изображения возбудителей, полученных при АСМ-сканировании 109 сенсорных покрытий из монокристаллического кремния и 58 подложек на основе аминослюды.
Статическая обработка результатов выполнена с использованием пакета программ STATISTICA 7.0. При обработке данных вычисляли среднеарифметические величины, их доверительные интервалы и проводили оценку достоверности различий числовых результатов по критерию Фишера - Стьюдента. В зависимости от вида распределения изучаемых количественных переменных результаты их обработки представлены
Рисунок 1
Топография поверхности внеклеточных морфологических вариантов ЭЧ C. trachomatis: А - зрелые ЭЧ, Б - L-формы, В - ультрамалые ЭЧ, Г - схема расположения антигенов возбудителя
средним значением и стандартным отклонением (М±ст). Разницу считали достоверной при p<0,05.
Результаты и обсуждение
Для детекции и идентификации возбудителей применили различные подходы, которые предусматривали: 1) получение с использованием МКП активированных сенсорных покрытий за счет иммобилизации специфических рецепторов (противохламидийных IgG) к поверхностным детерминантам C. trachomatis, 2) предварительную активацию поверхности подложек полиэлектролитами, различающихся поверхностным зарядом и нанесение антитуберкулезных антител для адсорбции M. tuberculosis, 3) приготовление подложек на основе аминослюды для иммобилизации B. burgdorferi, T vaginalis.
Адгезия возбудителя C. trachomatis на кремниевые подложки с иммобилизи-рованными противохламидийными IgG. АСМ-анализ адсорбции C. trachomatis
показал, что на сконструированных биочипах визуализировались три полиморфных внеклеточных морфологических варианта элементарных частиц (ЭЧ) возбудителя: зрелые, L -формы, ультрамалые частицы (рис. 1).
Выявлены различия в параметрах поверхностной микроархитектоники и в линейных размерах частиц ^ - длине, Н - высоте, В - ширине, параметры шероховатости - Ra, Rq, Rsk, модуле жесткости и упругости, структуре S-слоя). Результаты суммированы в таблице.
На основании избранного подхода впервые удалось описать и охарактеризовать микроархитектонику нескольких внеклеточных морфологических вариантов ЭЧ, а также идентифицировать ультрамалые формы патогена. Последние, вероятно, соответствуют дормантным (покоящимся) формам возбудителя [8]. Известно, что дормантные формы бактерий оказываются нечувствительными к ряду антибактериальных препаратов,
характеризуются дефектом ряда метаболических систем, но сохраняют вирулентные свойства [15]. Кроме того, считается, что образование дормантных форм бактерий является следствием их длительной персистенции в организме хозяина. Данные последних лет свидетельствуют о том, что при хронизации инфекции происходит блокирование экспрессии ряда ключевых генов C. trachomatis: Ftsk, ф-факторов 28 и 66, YgeD, контролирующих размножение у хламидий, а также генов hstA, hstB, crp, ответственных за формирование инфекционных ЭЧ [14]. Можно предположить, что образование ультрамалых форм C. trachomatis является адаптационным защитным механизмом, обеспечивающим возможность выживания и пребывания возбудителя при непермиссивных условиях в состоянии покоя.
Адгезия возбудителя M. tuberculosis на подложки с оценкой возможности дифференциации чувствительных, антибиотико-резистентных и покоящихся форм. АСМ-анализ чувствительного к антибиотикам стандартного штамма M. tuberculosis H37Rv позволил оценить морфологический состав популяции. Показано, что большинство из визуализированных бактериальных структур были представлены объектами палочковидной формы размером от 1 до 5-7 мкм и диаметром 0,3-0,6 мкм c хорошо выраженной микрокапсулой в виде аморфной бахромчатой структуры. Средние значения размерных параметров возбудителя составили 3,53±0,31 мкм в длину, 0,43±0,16 мкм в ширину и 1,37±0,15 мкм в высоту, толщина клеточной стенки - 17,8±0,9 нм.
Поверхность клеточной стенки при более детальном анализе оказалась от-
ПИЦН Микроархитектоника внеклеточных ЭЧ C. trachomatis, адсорбированных на сконструированных биочипах
Морфолоческие варианты ЭЧ С. trachomatis L, мкм* H, мкм** W, мкм*** Ra, нм Rq, нм Rsk Модуль Юнга, кПал S-слой, нмлл
Зрелые ЭЧ 0,3±0,05 0,33±0,02 0,32±0,03 9,2±0,21 15,5±0,88 >1,5 20±5 а=11нм, ß=1^, j=80°
L-формы 0,15±0,05 0,18±0,04 0,17±0,04 8,3±0,12 12,05±0,24 <1,5 От 7 до 12 отсутствует
Ультрамалые ЭЧ 0,09±0,02 0,1±0,03 0,1±0,02 2,1±0,18 6,2±0,64 <1,5 36±4 отсутствует
Примечание: * - параметр, определенный в направлении, параллельном поверхности образцов; ** - параметр, определенный в направлении, перпендикулярном поверхности образца; *** - параметр, определяемый в направлении, параллельном поверхности образца; л - параметр, определенный с помощью метода силовой спектроскопии (снятие силовых кривых подвода и отвода зонда микроскопа); лл - параметр, определенный с помощью метода прямого преобразования Фурье
носительно гладкой с недостаточно развитым рельефом, среднеквадратичная шероховатость на пиках не превышала 3,05±0,16 нм. Структура S-слоя соответствовала тетрагональному типу, характерному для большинства эубактерий.
Особый интерес представляли результаты наноскопического анализа штаммов возбудителя, резистентные к одному или нескольким противотуберкулезным и антибактериальным препаратам. АСМ-анализ резистентных культур M. tuberculosis показал полиморфную клеточную ассоциацию, различающуюся по морфологии, топографии микропрофиля, параметрам шероховатости поверхности, жесткостью и ригидностью клеточной стенки. Показано значительное преобладание сферической или овоидной формы частиц M. tuberculosis размером от 250±30 до 560±30 нм, а также нитевидных (ветвящихся) кок-кобациллярных структур (700-800 нм) микобактерий. Все эти формы имели хорошо различимую, но аномально-структурированную поверхность без выраженного S-слоя. Средний перепад высот рельефа поверхности при анализе профилей сечений у мультирезистентных микобактерий составлял 5-10 нм, толщина клеточной стенки - 24,2±1,5 нм (по сравнению со стандартным штаммом M. tuberculosis H37Rv). Следует отметить, что при воздействии зондом микроскопа с силой 7-10 нН кривая сечения микропрофиля не изменялась и сохраняла колоколообразный вид, что свидетельствовало о высокой жесткости и упругости оболочки у этих форм возбудителя.
Детальный наноскопический анализ позволил установить структурную основу динамического перехода и преобразования клеточной стенки при приобретении резистентности у изученных форм M. tuberculosis. Показано, что принципиальной особенностью данного процесса являлась реструктуризация и постепенное отслаивание у палочковид-
ных форм микобактерий микрокапсулы. Одновременно с этим по нижнему контуру возбудителя появлялись вздутия (расширения). Это приводило к разрыхлению клеточной стенки с последующим переходом от палочковидных до кокко-бациллярных и нитевидных ветвящихся структур патогена. По мере постепенной деградации клеточной стенки отмечалось образование округлых, овальных или вытянутых сферопластоподобных структур размером 300-500 нм. Такие образования на исследуемых образцах, как правило, занимали доминирующее положение, объединялись друг с другом в виде широких или тонких мостиков (анастомозов). Считается, что сферо-пластоподобные структуры M. tuberculosis продуцируют ряд поверхностных белков, миколовые кислоты, содержат нуклеиновую ДНК и при благоприятных условиях могут реверсировать в исходные формы развития, то есть сохраняют свою жизнеспособность [6]. Наряду со сферопластами отмечались и ультрамалые формы (до 200-300 нм) с клеточной стенкой толщиной 27-29 нм (рис. 2) и соответствующие, вероятно, наименьшей инфекционной единице развития всех видов бактерий - элементарным тельцам (ЭТ).
Известно, что у ряда других патогенов ЭТ обладают низким уровнем метаболизма, но сохраняют все компоненты клеточной стенки и способность к размножению в форме бинарного деления или почкования [7]. Предполагается, что они соответствуют покоящимся (дормантным или некультивируемым) формам, аналогичным спорам, как это отмечено для C. trachomatis [8]. Однако до настоящего времени не существует единого мнения о природе данного явления, функциональной значимости и степени их потенциальной опасности для человека. В доступной литературе отсутствуют сведения, касающиеся динамики структурных преобразований, поверхностной организации микобактерий
при переходе в такое покоящееся и, как считается, в особое некультивируемое состояние. Полагают, что из-за малой метаболической активности покоящиеся формы M. tuberculosis устойчивы к антибиотикам и могут являться резервуаром для хронической формы туберкулеза в организме человека [11, 13]. Таким образом, полученные результаты указывают на полиморфизм в структурной организации M. tuberculosis и характеризуют основные штаммовые особенности в наноархитектонике резистентных к антибиотикам форм микобактерий.
Наноскопический анализ и детекция покоящихся форм Borrelia burgdorferi. АСМ-анализ пула возбудителя, поддерживаемого на питательной среде BSK-H, позволил детализировать ряд особенностей в организации его клеточной стенки. По форме боррелии были представлены преимущественно в виде спиралей с плотной клеточной стенкой толщиной 12-14 нм, окружающей про-топлазматический цилиндр. Диаметр протоплазматического цилиндра составлял 0,17-0,22 мкм, общий диаметр возбудителя - 0,24-0,3 мкм. На наружной мембране клеточной стенки различался поверхностный S-слой, имеющий гранулярную структуру с укладкой в виде гексагональной решетки.
Кроме спиральных форм проанализированы и цистные формы боррелий. Последние были представлены в виде многочисленных гранулярных структур (800-1200 нм) с хорошо различимой клеточной стенкой толщиной 18-20 нм и внутренним плотно-упакованным матриксом. Известно, что цистообра-зование - основной способ сохранения возбудителя при непермиссивных условиях среды. Молекулярно-генетический анализ Borrelia burdorferi позволил установить ряд генов, участвующих в данном процессе: ospA, ospC, rpoH, crasp, erp, dbp, bbk32 [10]. Следует отметить, что морфологическая основа данного процесса в отношении боррелий до настоящего времени остается малоизученной. Однако это уникальное биологическое свойство, вероятно, имеет исключительно важное клиническое значение. Именно с явлением цистообразования Borrelia burdorferi связана хронизация лайм-боррелиоза, при котором возбудитель переходит в покоящееся некультивируемое состояние
3 Структурная организация и основные элементы строения T. vaginalis. А - трихомонада ланцетовидной формы; Б - трихомонада грушевидной формы; В - основные элементы структурной организации возбудителя
щ 1 ™ К, Л Л —"Блефаропласт "Аксостиль - Коста — Ядро ^---Пищеварительная вакуоль
и может диссеминировать в различные органы и ткани организма. Таким образом, полученные данные актуальны как для выяснения поверхностно-антигенных преобразований, которые обусловливают процесс мимикрии и изменение иммуно-генных свойств вегетативных боррелий, так и для изучения механизмов формирования покоящихся или цистных форм возбудителя.
Оценка возможности изучения тонкой наноструктурной организации полиморфных и амастиготных форм Т. vaginalis. Анализ штаммов I vaginalis позволил выявить три морфологические формы возбудителя: 1) классическая грушевидная (10-12 мкм); 2) ланцетовидная форма (6-7 мкм); 3) амастиготная, не превышающая величины 3-4 мкм. Основные элементы структурной организации возбудителя отмечены для грушевидных и ланцетовидных форм трихомонад. В передней части клетки визуализировалось овальной формы ядро, состоящее из одного или нескольких ядрышек. Реже встречались двухъядерные формы возбудителя. Около ядра визуализировались конгломераты микрогранул. На противоположном полюсе отмечалась плотная цилиндрическая структура - блефаро-пласт с отходящим пучком жгутиков. От блефаропласта в виде плотного тяжа просматривалась коста - структура, обладающая характерной исчерченностью. От переднего конца с боковой поверхности блефаропласта выделялся парабазаль-ный аппарат, полукругом огибающий ядро и поднимающийся вверх. Во внутреннем матриксе возбудителя визуализировались многочисленные овальной формы пузырьки (гидрогеносомы), соответствующие по морфологии митохондриям эукарио-тических микроорганизмов. От зоны блефаропласта отмечался аксостиль -осевой стержень, тянущийся к противо-
положному концу и заканчивающийся заостренным шипиком. АСМ-фотографии и структурная организация штаммов трихомонад (T vaginalis) представлена на рисунке 3.
Следует отметить, что у мелких ама-стиготных форм трихомонад отдельные структуры (коста, аксостиль, блефаро-пласт) при светооптическом исследовании часто были не различимы. Тем не менее, при АСМ-исследовании их можно было идентифицировать. Вероятно, амастиготные формы соответствуют покоящимся или цистным морфологическим типам T. vaginalis. Последние также встречаются в популяции урогенитальных трихомонад и являются одним из промежуточных (дормантных) состояний, обеспечивающих возможность сохранения возбудителя как вида при непермиссивных условиях среды.
Таким образом, с использованием АСМ-анализа (тейпинговый режим, Z-шкала: H=10 мкм, A=150 мВ, P=30°) охарактеризована топография поверхности возбудителя и описаны основные отличительные особенности строения как классических урогени-тальных, так и амастиготных форм трихомонад.
Резюмируя, можно отметить, что поверхностные детерминанты, ответственные за иммуногенные свойства у исследуемых возбудителей подвержены перегруппировке и могут быть выявлены и охарактеризованы при использовании АСМ.
Выводы:
1. Сконструированы биочипы на основе монокристаллического кремния и аминослюды, что позволило адсорбировать, идентифицировать и изучить основные параметры поверхностной микроархитектоники возбудителей, относящихся к различным таксономическим
группам - C. trachomatis, M. tuberculosis, B. burgdorferi, T vaginalis.
2. Для C. trachomatis дана характеристика поверхностной микроархитектоники трех морфологических вариантов внеклеточных ЭЧ возбудителя («зрелые», 0,3±0,05 мкм, отличающихся «пилообразным» микропрофилем, шероховатой поверхностью Ra - 8,3±0,12 нм, Rmax - 47±0,85 нм; Rq - 5,5±0,65 нм), гексагональной структурой S-слоя (а=11 нм, ß=11 нм, j=80°) в виде решетки, с параметром жесткости 20±5 кПа; L-формы, 0,2±0,05 мкм, с чередующимися шероховатыми участками поверхности (Ra - 9,2±0,21 нм, Rmax - 70±0,56 нм, Rq - 15,5±0,88 нм), прерывистым микропрофилем, не имеющие S-слоя, с параметром жесткости от 7 до 12 кПа; ультрамалые, 0,1±0,02 мкм, со сглаженными участками рельефа (Ra - 2,1±0,18 нм, Rmax - 39±0,72 нм, Rq - 6,2±0,64 нм), не имеющие S-слоя, с параметром жесткости 36±4 кПа. Впервые проведена наноскопическая дифференциация ультрамалых частиц возбудителя, соответствующих дормантным формам хламидий.
3. Для M. tuberculosis показан полиморфизм в структурной организации возбудителя и описаны основные отличительные особенности устойчивых к противотуберкулезным препаратам штаммов патогена. Установлено, что развитие резистентности у микобакте-рий сопровождается: а) динамическим переходом от классических форм к кокковидным ультрамалым и сферопла-стоподобным морфологическим вариантам; б) уменьшением в размерах возбудителя - с 3,53±0,31 мкм до 200-300 нм; в) реструктуризацией с постепенным отслаиванием у палочковидных форм микрокапсулы; г) отсутствием выраженного S-слоя; д) формированием аномально жесткой оболочки толщиной 27-29 нм.
4. Охарактеризована поверхностная организация спирохет Borrelia burgdor-feri и возбудителя T. vaginalis. Описаны классические спиралевидные формы боррелий (клеточная стенка толщиной 12-14 нм с гранулярным S-слоем в виде гексагональной решетки, протоплаз-матический цилиндр - 0,17-0,22 мкм), а также гранулярные формы возбудителя (800-1200 нм), не имеющие структурированного S-слоя и соответствующие покоящимся или цистным формам воз-
будителя. Детализирована поверхностная микроархитектоника и описаны основные различия по признакам строения амастиготных морфологических форм T. vaginalis, отражающие возможность адаптационно-приспособительной трансформации паразита.
5. Выявленные фенотипические особенности возбудителей, обусловленные полиморфизмом в наноструктурной организации поверхностной архитектоники, вероятно, отражают вариации в вирулентности и иммуногенных свойствах патогенов. Полученные результаты открывают новые возможности не только для понимания механизмов мимикрии и ускользания патогенов от иммунологического надзора, но и могут быть использованы для разработки доступных и высокоспецифичных нанодиагности-кумов, связанных с детекцией и иденти-
фикацией как типичных, так и атипичных морфологических вариантов патогенов.
Л И Т Е Р А Т У Р А
1. Асташонок, А.Н. Фено- и генотипическая характеристика Chlamydia trachomatis и детекция возбудителя с использованием флуоресцентных иммуномагнитных наночастиц: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. - M., 2016. - 22 с.
2. Асташонок А.Н., Полещук Н.Н., Докукина Т.В. и др. // Психиатрия, психотерапия и клиническая психология. - 2015. - №2. -С.11-12.
3. Князева О.Р., Федорова И.А., Бычкова Е.И., Красько А.Г. // Известия Национальной академии наук Беларуси. - 2014. - №1. -С.111-114.
4. Полещук Н., Асташонок А., Рубаник Л., Капи-тулец С. и др. // Наноиндустрия. - 2012. - №5. -С.48-54.
5. Полещук Н.Н., Рубаник Л.В., Гаврусев А.А. и др. // Здравоохранение. - 2010. - №5. - С.29-33.
6. Alsteens D., Beaussart A., Chatel S.El-K., Sul-lan R.M. // Plos. pathogen. - 2013. - Vol.9. - P.1-3.
7. Beran V, Havelkova M., Kaustova J., Dvorska L., Pavlik I. // Veterinarni Medicina. - 2006. - Vol.51. -P.365-389.
8. The role of viable but not infectious forms in chlamydial biology / Topics editors Borrel N. - Frontiers in cellular and infection microbiology (USA). - 2014. -117 p.
9. Dufrene YF // Future microbiology. - 2006. -Vol.1. - P.387-396.
10. Molecular Biology of Borrelia burgdorferi, Lyme Disease / Edited by Dr. Ali Karami. - InTech (Croatia). - 2012. - P.160.
11. Lamont E.A., Bannantine J.P., Armien A., Ariya-kumar D.S., Sreevatsan S. // PLoS One. - 2012. -Vol.7. - P.1-10.
12. Maver U., Velnar T, Gaberscek M., Planinsek O., Finsgar M. // Trends in analytical chemistry. - 2016. -Vol.80. - P.96-111.
13. Velayati A.A., Farnia P., Masjedi M.R. // Int. J. Clin. Exp. Med. - 2011. - Vol.4. - P.193-199.
14. Schoborg R.V // Microbes Infect. - 2011. -Vol.13. - P.649-662.
15. Shleeva M.O., Salina E.G., Kaprelyants A.S. // Microbiology. - 2010. - Vol.79. - P.1-12.
Поступила 07.06.2017г.
Особенности клинического течения и распространение множественной миеломы по иммунохимическим вариантам в Азербайджане
Гусейнов В.Т., Насруллаева Г.
Азербайджанский медицинский университет, Баку
Huseynov VT, Nasrullayeva G.
Azerbaijan Medical University, Baku
Clinical features and distribution of multiple myeloma immunochemical variants in Azerbaijan
Резюме. Исследуется эпидемиология множественных миелом, обнаруженных у жителей Азербайджана, в зависимости от типа иммуноглобулина с целью выявить их влияние на клиническое течение и лечение заболевания. Анализ полученных результатов показывает, что наиболее часто встречаются IgA- и IgG-миелома. Не выявлена зависимость протекания заболевания и продолжительности жизни больных от конкретного иммунохимического варианта.
Ключевые слова: множественная миелома, моноклональные иммуноглобулины, белки Бенс-Джонса, трансплантация стволовых клеток.
Медицинские новости. - 2018. - №2. - С. 74-77. Summary. The article examines the epidemiology of multiple myelomas, found in Azerbaijan, depending on the type of immunoglobulin in order to identify the effect of immunoglobulin types on the clinical course and treatment of the disease. The analysis of the obtained results shows that in Azerbaijan of all types of myelomas IgA and IgG myeloma are the most common types. The result of the study was the lack of regularity in the dependence of the course of the disease and the life expectancy of patients from a specific immunochemical variant. Keywords: multiple myeloma, monoclonal immunoglobulins, Bens-Jones proteins, stem cell transplantation. Meditsinskie novosti. - 2018. - N2. - P. 74-77.
I ножественная миелома (ММ) - это злокачественное заболевание плазматических клеток, характеризующееся образованием монокло-нальных тяжелых иммуноглобулинов (1дА, Щ 1дЕ) и легких (к, X) цепей протеинов в костном мозге. ММ составляет 1% от всех онкологических заболеваний, свыше 10% от всех опухолевых заболеваний кроветворной системы [1, 2]. При
этом заболевании в лимфоциты, образованные из стволовых клеток трансформируются в плазматические клетки, которые синтезируют моноклональные иммуноглобулины или же легкие цепи протеинов (парапротеин, М-протеин). В результате этого у больных нарушается синтез нормальных элементов крови, особенно иммуноглобулинов, что приводит к следующим клиническим проявле-
ниям: деструктивные поражения костей, нарушение реологических свойств крови, иммунная недостаточность, тяжелые поражения почек.
Как известно, каждый иммуноглобулин состоит из двух длинных (тяжелых) и двух коротких (легких) цепей. Исходя из строения тяжелых цепей, различают 5 классов иммуноглобулинов. Каждая тяжелая цепь имеет своеобразное строе-
